第41卷第3期2010年3月
东北农业大学学报JournalofNortheastAgriculturalUniversity
41(3):101~104
Mar.2010
猪SRPK1基因的电子克隆
俄广鑫1，刘娣1,2*，谢雨彤1，祝继原1，杨少成1，王嘉博1，赵金凤1
（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨
150030；2.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨
150086）
摘要：用小鼠和人的SRPK1基因的编码区序列通过NCBI数据库进行比较和检索，得到一个高同源性的猪cDNA序列和4个猪SRPK1基因的ESTs。利用DNAMAN软件将以上片段进行拼接，得到了一条较长的拼接片段X-1。ORFfinder和Blast2sequence程序分析。结果表明，X-1中包含一个完整的长为1968bp的编码区，编码656个氨基酸，且此编码区DNA序列与人的SRPK1基因有91.73%的一致性，氨基酸序列的一致性为92.93%。
关键词：SRPK1；生物信息学；电子克隆；开放读码框查找中图分类号：S828
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2010）03－0101－04
SiliconcloningofpigSRPK1gene/EGuangxin1,LIUDi1,2,XIEYutong1,ZHUJiyuan1,
YANGShaocheng1,WANGJiabo1,ZHAOJinfeng1(1.CollegeofAnimalSciencesandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.InstituteofAnimalHusbandryResearch,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China)
Abstract:UsetheSRPK1sequenceofhumanandmousetocompareandsearchinNCBIdate,
whereahighsimilarcDNAsequenceandfourpigs'SRPK1ESTswerefound,whichweresplicedintoalongerone(X-1)byDNAMANsoftware.Acompleteopeningframeof1968bplength,wasfoundbyORFfinderandBlast2sequenceintheX-1sequence,whichencodedaproteinof656aminoacids.Thiscodingsequenceof1pin-oldshowed91.73%indentityin1968bpsegmentswiththehumanSRPK1geneandhad92.93%identityin656aminoacids.
Keywords:SRPK1;bioinformatic;siliconcloning;ORFfinder丝氨酸精氨酸（SR）蛋白特异性激酶（SerineArginineProteinSpecificKinase，SRPK）家族具有磷酸化含有RS结构域的RNA剪接子的功能，人类
收稿日期：2009-09-22
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划重点项目（2008BADB2B01）
作者简介：俄广鑫（1984-），男，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail:eguangxin@126.com*通讯作者：刘娣，教授，博士生导师，研究方向为动物分子遗传育种。E-mail:LiuDi1963@163.com防治,1998,2(14):44-45.[7]
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SRPK1已被克隆定位于人类染色体6p21.2-p21.3，并证实在细胞周期中它具有调节RNA剪接因子在细胞核中分布的功能[1]。SRPK1是一种对RNA剪接
·102·东北农业大学学报第41卷
子的RS结构域有很高特异性的激酶，因为它只识别精氨酸,且在基质里只磷酸化丝氨酸。为了进一步研究它的生物学特性，并试图探讨SRPK1是否与人类疾病有关，进而制作了染色体图谱。我们用小鼠和人的SRPK1基因的编码区序列对NCBI数据库进行Blast比较，得到一个相似性很高的猪的cDNA序列（GenBank：AK240278），并检索出4条猪SRPK1的ESTs，对序列进行双序列比对、外显子的预测和拼接，得到一个与小鼠和人SRPK1基因有很高相似性的cDNA片段，推算用生物信息学的方法分析拼接的cDNA片段就是猪的SRPK1基因。
1.3猪SRPK1基因的电子克隆
用Blast2Sequence程序比较人的mRNA（GenBank：NM003137）和进过DNAMAN拼接后猪的cDNA。推测猪的SRPK1基因外显子区域和开放读码框，进一步证实上述的结果，并将推测得外显子拼接成猪可能的SRPK1cDNA序列。1.4猪SRPK1基因的核酸与蛋白质序列分析
采用Blast2sequence程序进行核酸序列同源性和蛋白质同源性比较；用ClustalW、BoxShade进行和显示多序列比对和进化分析。
2结果与分析
2.1数据库的比较分析结果
将小鼠SRPK1基因和人的SRPK1基因的编码区在NCBI的nr和months数据库进行Blastn分析，确定猪的SRPK1基因尚未克隆；再在猪dbEST和Htgs数据库中进行Blastn分析，找到4个同源性很高的大规模测序的cDNA序列和一条与人、鼠SRPK1基因相似性很高的核酸序列（GenBank：AK240278），我们将这五部分拼接为序列1pin_old（见图1），拼接序列1pin_old与人、鼠进行同源性比对分析时发现在拼接序列发生缺失，在拼接片段的缺失处，人和鼠都有45bp长的片段并且一致（见图1）。所缺失部分是猪性都高于93.3%以上
SRPK1基因EST（dbEST：262391）与EST（dbE-ST：259137）之间即在（dbEST：262391）的3′端和（dbEST：259137）的5′端之间。我们比较了GeneBank上所有物种的SRPK1基因的核酸序列后我们推测猪SRPK1基因在缺失处也存在45bp大小的高一致性片段，当然还需要我们实际应用RT-PCR进行验证。由于缺失片段小，缺失片段内无明显功能性box且同源性高同时为了能进行下步工作，我们忽略缺失部分并将序列拼接见图2，这样我们就拼接出了猪SRPK1基因所在的序列X-1。
1材料与方法
美国国家生物技术信息中心（NCBI）：提供并
1.1生物信息学数据库和软件
维护了GenBank，OMIM，MEDLINE，人/小鼠同源图谱和生物分类数据库。它的网址是：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
DNAMAN：分子生物学软件，可以进行序列比对和拼接。
Megalign：附属于DNAstar的子程序，主要功能是进行多序列比对以及进化树构建。
双序列比对：http：//www.edi.ac.uk/clustalw/in－dex.html。
ORFfinder：是以面向对象化的开放读码框查找程序，在NCBI上有链接。它的网址是：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html1.2猪SRPK1基因的生物信息学分析
将小鼠的SRPK1基因（GenBank：NM001025726）和人的SRPK1基因（GenBank：NM003137）的编码区在NCBI的nr、months、others、dbEST和Htgs（HighThroughputGenomicSequences）数据库中进行Blastn分析。
670
鼠SRPK1RatSRPK1
人SRPK1SRPK1human拼接序列1pin_old
680
690700710720
鼠SRPK1（RatSRPK1），人SRPK1（SRPK1human），拼接序列（1pin_old）
图1SRPK1片段缺失处
Fig.1MissingfragmentofSRPK1inpig
第3期俄广鑫等：猪SRPK1基因的电子克隆·103·
1EST3EST4EST5EST2EST1
2607
EST1：dbEST266260；EST2：dbEST262391；EST3：dbEST259137；EST4：dbEST258574；EST5：GeneBankAK240278
图2
Fig.2
猪SRPK1基因拼接
SplicingphotographofSRPK1geneinpig
2.2猪SRPK1核酸和蛋白质序列分析
将推测的外显子拼接成cDNA序列，应用DNAstar软件的ORFsearch程序分析其中的开放读码框，猪SRPK1基因的开放读码框为1968bp；用Translate程序将cDNA序列的开放读码框翻译成氨基酸序列，推测编码656个氨基酸。分子质量为72747.86ku，等电点是5.83。猪SRPK1基因与人的SRPK1基因在1968bp有91.78%的一致性，在656氨基酸上有92.93%的一致性。氨基酸的分布（见图3），通过DNA-MAN软件分析得出谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸的含量最高分别为10.62%、9.22%、8.91%、7.66%。
2.3蛋白二级结构进化分析
从GenBank数据库中检索12条SRPK1同源基因，分别来自人、猪、鸡、牛、狗、黑猩猩、褐鼠、家鼠、爪蟾、石斑鱼、猊猴。SRPK1在物种间高度保守，编码区长度均为1968bp，编码656个氨基酸，使用Clustalx程序对12条序列进行比对），与同源性后发现，猪与人的同源性最高（92.93%，详细结果见图3。在使用DNAstar最低（62.83%）程序时，采用NJ算法构建进化树从分子进化树中可以看出，如果以鸡作为脊椎动物进化过程的树根话，猪的SRPK1基因的进化较人原始，但考虑到SRPK1的保守性，这种原始不会引起SRPK1功能的缺失，进化意义却有待探讨。
黑猩猩Chimpanzee
狗Dog
人Human猪Pig
牛Cattle
猊猴Rhesusmonkey
苏门答腊猩猩Sumatranorangutan
家鼠Housemouse
挪威鼠Norwayrat
家鸡Gallus
石斑鱼Zebrafish
21.8
20
15
10
5
0
西方爪蟾Westernclawedfrog
图3
Fig.3
基于NJ算法的SRPK1基因的分子进化树
PhylogentictreedrawnwithNJmethodbasedonSRPK1gene
3讨论
我们利用生物信息学的数据库和软件在计算机
上克隆了猪SRPK1基因，并通过Sanger实验室的猪基因组数据库将其定位于7号染色体。该基因与人、小鼠的SRPK1基因有很高的同源性，可以确
·104·东北农业大学学报第41卷
定我们预测的这个基因就是猪SRPK1基因的Ortholog。目前已证明SRPK1基因在1周龄公猪肌肉组织中表达，肌肉cDNA文库的建立比较容易。我们可以用RT-PCR法检测该基因的表达情况，然后再证实它的cDNA序列。自从人类基因组计划以来，大量有关的生物信息技术和序列数据库如洪水般涌现，人与模式生物基因组的测序工作进展极为迅速，迄今已完成了40余种微生物的全基因组测序工作，人的基因组工作框架和精细图也已公布[2-3]。生物信息学数据库和软件的日益完善加快了基因的鉴定和分离[4-5]。人类和模式生物的基因克隆基本上可采用基于EST（表达序列标签）和Unigene的电子克隆即利用计算机进行同源性分析，寻找感兴趣的EST，构建包含这些EST的重叠群，在进行序列的特性分析[6-7]。本文克隆猪SRPK1基因为我们进行基因克隆提供了新的思路。电子克隆在加快基因研究的步伐同时也加快了动物遗传育种研究，它可以帮助我们更好更快的发掘经济性状的主效及候选基因。
析，得知猪SRPK1是酸性蛋白其保守性极高，进化较教灵长类原始。
[
参
考文
献
]
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4结论
通过检索数据库（ESTs）已提交的EST片段并
应用DNAstar软件进行拼接得到富含整个CDS区域的猪SRPK1基因序列。使用生物信息学工具分析SRPK1蛋白序列的一级结构，并对其进行了分!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!\"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!\"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!\"●
科技动态
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胚胎干细胞移植助患病实验鼠恢复视力
美国哥伦比亚大学医学中心科学家所领导的国际研究小组表示，他们利用实验鼠胚胎干细胞取代受损视网膜
细胞，成功地帮助患色素性视网膜炎的实验鼠恢复了视力。该研究成果有望用于开发治疗人类色素性视网膜炎的新方法。
色素性视网膜炎在人类中的发病率为1/3000至1/4000，每年全球新增患者约150万人。人体视网膜色素上皮细胞是维持视觉能力的特殊细胞，色素性视网膜炎可导致视网膜周边的视觉细胞死亡，出现视觉变狭窄和四周模
“隧道视觉”病症。糊的
该研究项目负责人、哥伦比亚大学医学中心眼科、病理学和细胞生物学副教授斯蒂芬·曾表示，新的研究具有光明的前景，因为他们将干细胞转化成视觉细胞，帮助患病的实验鼠恢复了视力。他说，移植的细胞不仅外表像视觉细胞，而且其功能也与视觉细胞相当。
研究中，有1/4患病实验鼠在接受干细胞移植后视力得到恢复，但有些实验鼠出现了良性肿瘤和视网膜脱离的
·曾和同事表示，他们将进一步优化技术，以减少人类胚胎干细胞移植用于人体试验时并发并发症。对此，斯蒂芬
症的发病率。
斯蒂芬·曾表示，一旦并发症的问题得到解决，这将成为新的治疗方法，不仅能够医治色素性视网膜炎，而且还能治疗与年龄变老相关的视网膜黄斑变性、斯特格病变以及其他种类的视网膜疾病，它们均具有视网膜细胞损伤的特征。
摘自：科技日报
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