维普资讯 http://www.cqvip.com 发酵科技通讯 离子交换树脂分离纯化谷胱甘肽的研究 胡晓梅黄娟舒媛许铁成 （河北梅花集团有限公司 廊坊０６５７０２） 摘 要：研究００１ｘ７阳离子交换树脂分离纯化谷胱甘肽的工艺条件，考察了００１×７阳离子交换树 脂对ＧＳＨ的静态吸附量，以及洗脱时，洗脱液，洗脱浓度，洗脱流速等对分离纯化产品ＧＳＨ的影响。确 定其工艺流程；最适上柱ｐＨ为２．５，洗脱液ＮａＣ１溶液最适洗脱浓度为１．２％，洗脱流速为２．０ｍｌ／ｍｉｎ；收 集洗脱液，用紫外分光光度法检测其ＧＳＨ的浓度，回收率为７５％，纯度相对提高６０％。 关键词：树脂ＧＳＨ洗脱条件 谷胱甘肽（ＧＳＨ）是一种活性三肽，是普遍存 啤酒酵母（由本公司发酵车间提供）； 在于细胞中的一种重要的抗氧化剂，是动物组织， 无水乙醇（天津永大化学试剂）；亚硝基铁氰化 植物组织，细菌和酵母内巯基（－ＳＨ）最为丰富的 钠（天津科密欧试剂）；考马斯亮蓝Ｇ２５０（天津科密 化合物，同时有护肝，解毒，抗氧化等多种医疗功 欧试剂）；００１ｘ７强酸型苯乙烯系阳离子树脂； 能。临床上，谷胱甘肽可以用于迅速提高机体免疫 ２．６ｃｍ￣６０ｃｍ层析柱；７５２型紫外可见分光 力，在抗氧化，抗辐射，消除自由基，解毒，促进铁 光度计（上海光谱仪器公司）；旋转蒸发器（上海亚 质吸收等方面具有良好的效果且无副作用；在食 荣仪器公司），ＢＳＺ一１００部分自动收集器（上海沪 品加工领域，谷胱甘肽具有增强食品营养价值和 西仪器厂）；ＬＧＪ一１２冷冻干燥机。 强化食品风味等功能【１Ｊ。 １．２试验方法 谷胱甘肽的分离纯化是生产工艺中最重要的 １．２．１谷胱甘肽提取液的制备 一部分，从细胞中提取ＧＳＨ得到的提取液中常常 采用５０％的酒精对酵母菌体进行浸提，时间 含有大量的蛋白质，氨基酸，肽类等多种杂质，得 ２ｈ，得谷胱甘肽提取液，液缩一倍后备用。 到纯度较高的谷胱甘肽需要进行分离纯化。ＧＳＨ １．２．２阳离子交换树脂的预处理 的分离纯化方法主要有铜盐法、双水相法、树脂 首先使用两倍体积的饱和氯化钠溶液处理树 法。树脂法经济效益好，并且有一定分离纯化效 脂，将树脂置于食盐溶液中浸泡１８—２０ｈ，然后放 果，基本达到试验预期目标。 尽食盐水，用清水洗净，至排出水中不带黄色；其 ＧＳＨ的等电点为２．９８，在高ｐＨ值情况下 后，用两倍体积的２％一４％的ＮａＯＨ溶液浸泡４ｈ， ＧＳＨ性质不稳定，易被氧化为氧化型谷胱甘肽 放尽碱液，用清水冲洗树脂直至排出水接近中性 （ＧＳＳＨ）失去生理活性，因此ＧＳＨ的分离纯化工艺 为止；最后用两倍体积５％ＨＣ１溶液，浸泡８ｈ，放 需在酸性条件下进行。首先选定使用阳离子交换 尽酸液，用清水洗至中性待用。 树脂来分离纯化ＧＳＨ，而弱酸性阳离子交换树脂 １．２．３ 阳离子交换树脂对谷胱甘肽的分离纯化 ｐＨ低于３时不电离，因此本试验选用强酸型阳离 将经过处理后的００１￣７阳离子交换树脂５０ｇ 子交换树脂００１￣７作为纯化ＧＳＨ的树脂。 装入 ２．６ｃｍ￣６０ｃｍ层析柱中，保证其无气泡产 １材料和方法 生；取ＧＳＨ浓缩液，调ｐＨ（低于等电点２．９８），上 柱，测定不同的上柱ｐＨ１．５、２．０、２．５对ＧＳＨ回收 １．１试验材料、试剂和仪器 率的影响；待ＧＳＨ在柱上充分交换吸附后，水 匿 维普资讯 http://www.cqvip.com
第３７卷第４期 ２００８年１０月 发酵科技通讯 ２．２不同洗脱液对ＧＳＨ纯化效果的影响 洗，测定不同洗脱液（ＮａＯＨ、ＨＣＩ、ＮａＣＩ），不同洗 脱液浓度（０．８％、１．２％、１．６％），不同洗脱流速 （１．５ｍｌ／ｍｉｎ、２．０ｍｌ／ｍｉｎ、２．５ｍｌ／ｍｉｎ）对ＧＳＨ分离纯 化的影响。 本试验分别采用５％的ＮａＣ１、ＮａＯＨ、ＨＣ１溶 液进行洗脱试验，每５ｍｌ洗脱液收集为一组，测定 每组的吸光值，计算ＧＳＨ的浓度。其结果如图１、 １．２．４洗脱终点的判断圆 取洗脱收集液５ｍｌ加２滴１％亚硝基铁氰化 钠溶液，观察其颜色变化，若颜色变为红色，表明 洗脱液中还有ＧＳＨ存在，否则，洗脱液中无ＧＳＨ 存在。 １．２．５树脂的再生方法 用３倍体积２％一４％ＮａＯＨ溶液浸泡树脂４ｈ， 再采用２ｍｏｌ／Ｌ的ＨＥ１浸泡，搅拌２ｈ以上，用去离 子水清洗至中性备用。 １．２．６ ＧＳＨ的含量分析 亚硝基铁法：在测定管中加入１．Ｏｇ硫 酸铵粉末（以使体系硫铵达到饱和），ｌｍ１分析样 品，３ｍｌ硫酸铵饱和溶液，摇匀，加入０．５ｍｌ亚硝基 铁试剂，随即加入０．７ｍｌ ８ｍｏｌ／Ｌ的氨水溶 液，混匀，用紫外可见分光光度计测定其吸光值， 计算其浓度。 １．２．７蛋白质的含量测定 考马斯亮蓝法［３１ ２结果与讨论 ２．１上柱的谷胱甘肽溶液ｐＨ对ＧＳＨ回收率的 影响 ｐＨ值会影响到溶液中各种物质的带电性质， 对离子交换有较大的影响，本试验选用上柱ｐＨ 为１．５、２．０、２．５，上柱体积１００ｍｌ，洗脱液体积 ２５０ｍｌ，经过离子交换后，计算各ｐＨ条件下谷胱 甘肽的回收率，确定最佳的上柱ｐＨ值，其试验结 果如表１。 ｐＨ ＧＳＨ含量 上柱液 洗脱液ＧＳＨ的含量 ＧＳＨ的回收率 ％ １．５ １．９９８ ０．３３６７ ４５－８８ ２．０ １．９９８ ０．４１６９ ５２．１６ ２．５ １．９９８ ０．６０２０ ７５｜３２ 表１ 不同上柱ｐＨ值对谷胱甘肽的回收率的影响 由表１知，当上柱ｐＨ值２．５时，谷胱甘肽的 回收率是７５．３２％，明显优于其它ｐＨ值条件下的 回收率，可确定最佳上柱ｐＨ值是２．５。 ２、３所示： ８ ４ ７ ３５ ６ ３ ０ 蠹５ ２５ 滏４ ２ 茔３ 餐 １５ 窭 ８ ２ Ｑ １ ＇ ０５ Ｏ １ ３ ５ ７ ９ ｌｌ ｌ３ 【５ ｌ７ ｌ９ ２ｌ ２ 收集缀数 图１ ＮａＯＨ洗脱收集 —★一ＧＳＨ—◆一Ｐｒｏ Ｏ．２５ ０ ０．２ 一 ９ 麓 ｏ．１５蓦 露 工 ０．１謇 ∞ 仑 ０ Ｏ．０５ Ｏ １ ３ ５ ７ ９ ｌｌ ｌ３ １５ １７ １９ ２ｔ ２３ 收集绝数 图２ ｂｔＣＩ洗脱收集 ３ ０ ９ 捞 避 型 曼 避 蓝 ∞ Ｑ １ ３ ５ ７ ９ ｉｉ ｉ３ ｉ５ ｌ７ ｌ９ ２１ ２３ 收集绸数 图３ ＮａＣｌ洗脱收集 由图１知，ＮａＯＨ洗脱时，洗脱峰很集中，但 是蛋白质的洗脱也很集中，主要是由于在较高的 ｐＨ条件下，远离被吸附物质的等电点，大多数物 维普资讯 http://www.cqvip.com 发酵科技通讯 质带负电荷，所以很容易被洗脱，但是由于ＧＳＨ 第３７卷 在碱性条件下不稳定，故不宜采用碱性洗脱。由图 ２和图３可知，与ＮａＣ１洗脱相比，酸性洗脱在 ＧＳＨ流出时蛋白质浓度更高一些，采用ＮａＣ１洗 脱时ＧＳＨ的出峰更集中一些，故采用ＮａＣ１作为 ８ ｌ０ ８ 洗脱剂进行洗脱。 ２－３洗脱液不同浓度对ＧＳＨ纯化效果的影响 蓍４ ∽ 由于工业生产中很难采用线性梯度洗脱，因 ９ 此必须选择洗脱剂合适的浓度，本试验选择了三 种洗脱浓度（０．８％、１．２％、１．６％）对ＧＳＨ的纯化效 果进行研究，结果如图４所示： —★－｛。２（妫— １ ６ — Ｏ ８０９６ ３ 、 ～ 避 一 露 ｍ ， 蕊 一 睡 收集鳃熬 班 ｎ 图４洗脱剂不同浓度的洗脱 由图４结果表明三种不同浓度的洗脱剂，都 可以使ＧＳＨ洗出，但是出峰先后有很大的差别，一 啦 浓度较低的情况下，出峰较晚，而且峰形比较平 潍 缓，但浓度为１．２％时出峰集中，更高浓度（１．６％）洗 脱时峰的变化不大，过高的浓度会使得流出液中 盐浓度较大，所以试验选用１．２％ＮａＣ１作为理想 的洗脱剂浓度。 ２．４不同洗脱流速对ＧＳＨ纯化效果的影响 洗脱时，流速的不同，不仅影响ＧＳＨ的收率， 而且会影响洗脱收集液的体积，因此洗脱的速度 对洗脱效果有明显的影响，流速太慢，洗脱时间 长，设备利用率低；洗脱速度太快，ＧＳＨ洗脱率 低，洗脱液体积大，浓缩能耗高，而较慢速度的洗 脱能使吸附的ＧＳＨ尽可能集中的洗脱下来，取得 较好的效果。本试验采用三种洗脱流速（１．５ｍｌ／ ｍｉｎ、２．０ｍｌ／ｍｉｎ、２．５ｍｌ／ｍｉｎ），其洗脱效果比较如图 ５所示： 由图５可知，当流速是２．０ｍｌ／ｍｉｎ时，ＧＳＨ的 洗脱峰比较集中，有利于ＧＳＨ的洗脱和回收。 ０ ｌ ？ 擘 ｌｌ ｌ ｌ３ ｌ ｌ Ｚ Ｚ 收集缝数 图５不同洗脱流速的洗脱 ２．５ 离子交换树脂分离纯化ＧＳＨ重复试验结果 经过重复试验可知，采用离子交换法分离纯 化谷胱甘肽，在最适分离条件下，谷胱甘肽的平均 回收率是７５％，最适上柱ｐＨ是２．５，洗脱液选用 ＮａＣ１，最适洗脱浓度为１．２％，最佳洗脱流速是 ２．０ｍｌＹｍｉｎ，在此情况下，能使谷胱甘肽纯度相对提 高６０％。 ３结论 本试验研究采用００１ｘ７阳离子交换树脂以 啤酒酵母为原料分离纯化谷胱甘肽，试验结果显 示此方法可行，根据试验结果确定最佳工艺条件 是：最适上柱ｐＨ值２．５，洗脱流速是２．Ｏｍｌ／ｍｉｎ，洗 脱液为１．２％的ＮａＣ１溶液，产品中ＧＳＨ的纯度比 原液提高６０％，谷胱甘肽的回收率是７５％，可见 此方法可行。 产品中含有和谷胱甘肽性质和分子量都比 较接近的其他肽类物质，通过阳离子交换树脂的 分离纯化可以除去部分蛋白质和多肽类，采用超 滤等工艺能达到更高的纯度。 参考文献： ［１］ＰＥＮＮＩＮＣＫＸ Ｍ Ａ ｓｈｏｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ，ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓｅｓ； ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｅｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，２６（９／１ｏ）：７３７－７４２． ［２］刘捺玉．谷胱甘肽的研究和应用．生命的化学．１９９５，１５（１）： ｌ９—２１． ［３】曹新志．谷胱甘肽的分离和干燥方法广州食品工业科技． １９９６『２１．４４—４５． ］王淼，范崇东，苏晓晋．阳离子交换法分离纯化酵母细胞提 取液中的谷胱甘肽．食品科学．２００７，２８（４）：２１１－２１６．
