绿色荧光蛋白的克隆表达——分子实验设计报告

安平 20 蒋云凤 20

一、 引言

2008年，三位科学家在一种学名Aequorea victoria的水母中发现了绿色荧光蛋白（GFP），其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。从此，绿色荧光蛋白作为一种新型标记蛋白被广泛应用于细胞生物学与分子生物学中，在DNA重组技术的配合下，绿色荧光蛋白独特的发光机制使我们能够更清晰地观察到细胞内部的结构和活动，从而极大地推进了微观生物学的发展。

本次试验的目的即为通过DNA重组技术，将GFP基因导入大肠杆菌质粒中并诱导表达，从而获得能发出绿色荧光的大肠杆菌。

实验中使用了pEGFP-N3质粒，其上携带有EGFP蛋白表达基因，EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。将pEGFP-N3上的EGFP基因转移至大肠杆菌中，需要的载体为pET28a，pET质粒是最有效的原核表达系统之一，将pEGFP-N3质粒与表达载体pET28a重组，并将重组质粒转化感受态细胞，基因在细胞中表达后即可观察到发光的大肠杆菌。

二、 实验流程

Pet28a导入细菌并扩大培养 碱裂解法提取质粒 Pet28a载体酶切 pEGFP-N3质粒扩增及酶切 琼脂糖电泳鉴定及胶回收 T4连接酶连接获得重组质粒 重组质粒转入DH5α，菌落PCR检验 提取重组质粒转入BL21并诱导表达 三、 实验步骤

1、Pet28a导入细菌并扩大培养

1.1实验原理：由于实验材料只有少量的pet28a质粒，需要对它进行扩增，于是我们首先要将pet28a转化入大肠杆菌中进行扩大培养。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，在有氯化钙存在的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有抗生素的选择培养基上。为了提高转化成功率，我们选择使用能够摄入外源DNA的DH5α受溶菌。将pet28a导入DH5α细胞后，将细胞涂布在含有卡那霉素的LB培养基上扩大培养，由于pet28a上带有卡那霉素抗性基因，能在培养基上正常生长的菌落即为成功转入pet28a的细菌。 1.2实验目的：扩增pet28a载体 1.3实验材料 1.3.1材料

少量pet28a基因，大肠杆菌DH5α细胞，平板，涂布器，酒精灯，EP管等 1.3.2试剂

LB固体培养基（pH=7）：酵母粉0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 1.0 g，琼脂粉1.5g，蒸馏水，5mol/L的NaOH溶液

卡那霉素：50mg/ml，配制后抽滤灭菌，分装，-20℃冻存。 1.4实验方法

1）取100 μl感受态DH5α加入1.5ml离心管中，冰上慢速解冻，溶化后加入2 μl pet28a质粒，轻轻混匀，冰上静置10-30 min

2）30分钟后取出混合物42℃水浴热冲击90 s，之后立即冰浴5分钟

3)5分钟后向混合物加0.8mlLB液体培养基，于37摄氏度摇床震荡培养1小时 4）之后将混合物离心，6000转3分钟，离心后去掉上清，保留沉淀（菌细胞）

5）吸取80微升菌液于含有卡那霉素的LB固体培养基上，涂布均匀，在超净工作台上放置30分钟

6）平板做好标记，用封口膜封好，置于37度恒温培养箱中培养过夜，第二天观察结果。 1.5实验结果预期

在培养基上生长出了大量菌落，即转导入pet28a的大肠杆菌DH5α细胞。 1.6实验结果讨论、注意事项

1）这一步实验建立在已有DH5α细胞的基础上，若没有现成的DH5α，则需要制备。 2）DH5α、pet28a、培养基的用量来自于查阅文献，可能并不适用于这个实验，需要再次确认。

3）整个操作在无菌条件下进行，所用材料都要经过灭菌，并严防污染。

2、碱裂解法提取质粒 2.1实验原理

1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。

碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。

2.2实验目的：掌握碱法抽提质粒DNA的原理和方法 2.3实验材料

2.3.1材料：转化好的感受态细胞（含pET28a质粒），离心管，EP管架，取液器吸头，常用玻璃器皿（三角瓶、量筒、试剂瓶等） 2.3.2试剂 1）溶液Ⅰ50 mL, 葡萄糖 , 50 mmol/L , 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) , 用前加溶菌酶4mg/L.121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 2）溶液Ⅱ100 mL, 0.2 mol/L NaOH ,SDS, 1% (W/V)

用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配； 3）溶液Ⅲ100 mL, 60 mL KOAc (5 mol/L), 11.5 mL冰乙酸, 28.5 mL H2O .该溶液钾离子浓度为3 mol/L, 醋酸根离子浓度为5mol/L； 4）酚-氯仿(1:1,V:V)；

5）TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl pH8.0, 1mmol/LEDTA pH8.0, 其中含RNAase20ug/mL. 6）70%乙醇，无水乙醇；

7）液体LB培养基（pH7.0）, 10 g/L胰蛋白胨, 5 g/L酵母提取物 , 10 g/L NaCl , 1 mL/L NaOH(1 mol/L)；

8）氨苄青霉素25mg/mL贮备液

2.3.3仪器设备：恒温水浴锅，高压灭菌锅，超净工作台，移液器，高速离心机，机，漩涡振荡器 2.4实验方法

1）感受态细胞经转化培养后，培养皿内有单菌落长出

2) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min振荡培养过夜。

3) 取1.5 ml 菌液于EP管中（并设置对照），做好标记，放入离心机10000 转 离心2分钟，弃去上清。

4) 向离心管中加入100 l用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀，室温放置10min 5) 加入200 l新配制的溶液 Ⅱ，轻轻颠倒混匀离心管2-3次，冰上放置5分钟。

6) 加入150 l用冰预冷的溶液 Ⅲ，温和颠倒3-5次，冰上放置15分钟使DNA充分沉淀 7) 10000 转离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管，弃去沉淀

8) 加入饱和酚和氯仿异戊醇各200 l，充分颠倒混匀，用微量离心机10000 转离心10分钟，将上清转移到另一离心管中。

9) 向上清中加入400 l的氯仿异戊醇，充分颠倒混匀后，再次离心10000转2分钟，将上清转移到另一离心管中，弃去原来的EP管

10) 加入700l乙醇并轻轻混匀，放入-20度冰箱一小时。12000转，5分钟离心。离心后发现管壁上有微量白色沉淀。弃去上清。

11）向管中加入800微升70%乙醇，充分颠倒混匀；12000转，2分钟离心。去上清保留沉

淀。用滤纸条沿管壁吸干乙醇（不要碰到沉淀），敞开盖子室温自然晾干30分钟直到没有乙醇味道；加入20微升TE缓冲液将质粒DNA进行充分溶解（TE缓冲液含有RNA酶可去除质粒中的RNA），可用头轻轻吸打使充分溶解

12）凝胶电泳检测提取效果：样品中取出5微升进行电泳，剩下的冷冻下次使用。 2.5实验结果预测

加入溶液1浑浊；加入溶液2变澄清；加入溶液3出现白色絮状沉淀；加入氯仿抽提溶液分层。电泳后理论上讲会有3条带（跑在最前边的是cccDNA（共价闭合环），中间的是OC（开环），最后的有点拖带，稍宽，早期多认为是线状的，但后来专家认为断链质粒发生几率很低，形不成条带，因此现在一般认为是处于复制过程中的1.5倍左右的条带），最亮的一条带为超螺旋带，即我们需要的产物，大小应该为5300bp左右。 2.6实验结果讨论、注意事项

1）整个过程动作要轻缓，尤其是加入溶液2、3时。 2）废物废液及时倒掉

3）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起： ①DNA过载 ②电压过高 ③加样孔破损 ④凝胶中有气泡

3、pEGFP-N3的扩增以及pEGFP-N3和pet28a的双酶切 3.1实验原理

pEGFP-N3是携带有EGFP基因的载体，以它为模板可以扩增出大量的EGFP基因，再利用性内切酶对两个质粒进行双酶切，以分别获得目的基因与载体，为下一步的重组做好准备。性内切酶能特异地结合于一段被称为性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：

Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成： 一种为性内切核酸酶（酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 示意图：

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

在分子克隆中常用II型性内切酶，Bam HI 和NotⅠ都属于II型性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异核苷酸序列内，切断ＤＮＡ的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。Bam HI 和NotⅠ的识别序列和切口是：

Bam HI： G↓GATCC NotⅠ： GC↓GGCCGC

G、A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的片段数，就可以推断切口的数目，从片段的迁移率就可以大致判断酶切片的大小差别。用已知相对分子质量的

线状DNA为对照，同归电泳迁移率的比较，就可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。 3.2实验目的

扩增pEGFP-N3，酶切pEGFP-N3和pet28a获得目的基因和目标载体。 3.3实验材料 3.3.1材料

pEGFP-N3质粒和pet28a质粒，Bam H I，Not I，EP管，EP管架，移液器，离心机，恒温培养箱，一次性手套 3.3.2试剂 1）10Xbuffer 2）双蒸水 3.4实验方法 1）准备2个0.2ml离心管，做好标记。吸取6微升的双蒸水和2微升的10Xbuffer加入A管，仔细观察尖是否吸取到溶液；加入两种性内切酶各1微升（不要接触EP管底端，酶吸完迅速放回冰上），加入10微升环状质粒

2）取6微升双蒸水和2微升10Xbuffer入B管，仔细观察尖是否吸取到溶液。加入10微升克隆基因片段

3）将0.2ml离心管放入1.5mlEP管中进行瞬时离心（how?），放在EP管架上37度恒温培养箱酶切1小时

4）琼脂糖电泳检测是否酶切 3.5实验结果预期

酶切过程肉眼观察不到，需要进一步电泳检测才能得到验证。 3.6实验结果讨论

1）有时会发现质粒DNA不能被酶所切割，可能是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注没有去除干净。可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。 2）染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？

在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。 4、琼脂糖电泳鉴定及胶回收 4.1实验原理： 1）琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

2）胶回收是对产物质粒的纯化与回收，利用琼脂糖凝胶电泳，将目的产物与其他片段和物质区分，切割回收操作，纯化了产物。 4.2实验目的：鉴定、纯化酶切产物 4.3实验材料：

1）材料：酶切后的两管产物，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，取液器吸头，小刀片

2）仪器：电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），取液器，微波炉，凝胶成像系统。 3）试剂：Gold view（DNA染料），0.5×TAE缓冲液，上样缓冲液（6×） 4.4实验步骤：

1）琼脂糖凝胶板的制备：分别称取0.3g与0.4g琼脂糖，置于不同锥形瓶中，分别加入30m与40ml1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。静置20min左右，轻轻晃动拔出梳子。分别制得鉴定（薄的）与纯化（厚的）的胶片。

2）点样：将薄胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器吸取提取的质粒和原质粒溶液DNA5μL与1μL上样缓冲液（6×Loading Buffer）混匀，加入胶板的样品孔内。

3）电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为120V左右，大约电泳15分钟。至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离正极胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

4）观察与拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

5）点样：在4）中检测出条带成功酶切，现将厚胶片放入电泳槽中（样品孔位于负极），注

入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器分别吸取提取剩下的质粒DNA与2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer）混匀，加入胶板的样品孔内。（两个不同的孔） 6）电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为120V左右，大约电泳15分钟。至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离正极胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

7）观察与切胶：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，用干净刀片快速切下所需的荧光条带。放入已知重量1.5ml离心管中，再称重，获得切胶重量。

8） 以0.1g凝胶对应300μL的体积加入PN。

9） 50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。

10） 将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm离心60s，

弃掉废液。

11） 加入800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。

12） 加入500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。将离心吸附柱放回收管，

13000rpm离心2min。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30μL，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min。 13） 置于－20℃保存。 4.5实验结果预测

酶切后的质粒存在两个条带。电泳理想结果为每列两个条带，则获得质粒PEGFP-N3和PET28a双酶切产物。

4.6实验结果讨论

检测出两条带是双酶切质粒成功的结果显示。电泳成像中，由于目的基因大约500bp左右，即电泳上方条带是目的条带。

5、T4连接酶连接获得重组质粒

5.1实验原理:DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 5.2实验目的：得到重组质粒 5.3实验用品：

1）材料：已酶切的产物PEGFP-N3和PET28a，0.2ml的EP管，移液器头，一次性手套，

2）试剂：T4DNA连接酶, ddH2O，T4DNA连接酶buffer。 3）设备:移液器，台式高速离心机，PCR仪。 5.4实验步骤

1）取个0.2mlEP管做好标记:；

2）在EP管中分别加入10×buffer2ul，酶切后的PET28a 8ul，酶切后的荧光基因片段9.5ul，T4DNA连接酶0.5ul；

3)瞬时离心EP管，结束后，将其放在架子上，放入22℃恒温培养箱中连接20分钟。之后放在-20℃的冰箱中以备转化。 4）取2ul凝胶电泳鉴定连接产物。 5.5实验结果预测

电泳结果可能显示为多条条带 5.6实验结果讨论

酶连接过程一定不是完全如理想的质粒与目的基因的连接，有很多种组合的可能。在这种情况下，将电泳结果与酶切电泳结果进行比较各自的条带大小，可分析到自己所要求的连接产物是否连接成功。

6.重组质粒转入DH5α，菌落PCR检验 6.1实验原理：

1）重组DNA的转化:DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。对于不同的受体细胞，往往采取不同的转化战略。DH5a是大肠杆菌的一种菌株。 DH5a的感受态是指细胞经过一些特殊方法(电击法、CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。

2）菌落PCR：菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

6.2实验目的：重组质粒转入DH5α并扩增；菌落PCR鉴定阳性克隆。 6.3.1重组质粒转入DH5α 6.3.1.1实验用品：

1）材料：DH5α，pET-28a重组质粒DNA。

2）仪器:LB固体培养基，恒温培养箱，冰盒，摇床 6.3.1.2实验步骤

1）取出感受态细胞DH5a在冰上融化，按照每200ul感受态细胞加入整管连接产物，混合后冰浴30min；

2)30min后，42℃热冲击60s，立即置于冰浴5min

3）5min后，在感受态细胞混合物中加入0.8mlLB液体培养基，在37℃摇床中培养1h 4）1h后，在6000r/min离心3分钟，去掉上清（留下约200ul），混匀

5）利用上部所得溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正面放置培养基半小时，然后放置于37℃培养箱中倒置培养过夜。 6.3.1.3实验结果预测 平板上长出菌落

6.3.1.4实验结果讨论 菌落成功长出，说明含有抗药基因的质粒成功的导入了受体细胞。根据菌落大小与疏密程度，很容易判断质粒导入的成功率。为了提高转化率，细胞生长密度应以每毫升培养液中细胞数在5x10^7个范围内为佳，这可以通过测定培养液的A600nm控制。 6.3.2菌落PCR技术鉴定重组DNA

6.3.2.1实验用品

1）材料：DNA模板，4×dNTP，T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，MarkerDNA，吸头。 2）试剂：10×buffer，15 mmol/L MgCl2

T7启动子正向引物：5’-taa tacgactcacta tag gg-3’ T7启动子反向引物：5’-tgc tag ttattgctcagc gg-3’ 3）仪器：PCR热循环仪， 琼脂糖凝胶电泳系统。 6.3.2.2实验步骤

1）在0.2mlEP管内配置25ulPCR反应体系 反应物 ddH2O 10XBuffer MgCl2 4XDNTP 引物1 引物2 Taq酶 菌落 体积（ul） 18.5 2.5 1.5 1 0.5 0.5 0.5 1个 2)用灭菌头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心 3）放入PCR仪中，设置反应程序：

a) 94℃预变性5min b) 94℃变性30s c) 55℃退火30s d) 72℃延伸60s e) 重复b-d30次 f) 72℃延伸10min

4）取9ul反应液加1ul10xbuffer做电泳检测 6.3.2.3实验结果预测

目的基因得到扩增，电泳得一条区带。 6.3.2.4实验结果讨论

PCR扩增后产物电泳后，可以看到一条明显的条带，由于菌体PCR原理可得，这条条带大小即为目的基因片段大小，通过比较条带大小，可知EGFP基因已经成功连接到PET28a载体上。

7.重组质粒转入BL21并诱导表达 7.1实验原理： 1）BL21是常用的表达菌株，一般配合以强表达载体来进行目的基因的强表达。BL21（DE3）pLysS对λDE3（1）是溶源性的。λDE3含有T7噬菌体基因I，编码的T7 RNA聚合酶受lac UV5启动子的控制。BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，他携带编码T7溶菌酶基因。在T7启动子控制下，T7溶菌酶降低靶基因的背景表达但并不干扰由IPTG诱导的表达水平。 2)IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。 7.2实验目的：诱导外源绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达 7.3.1BL21感受态细胞的制备 7.3.1.1实验用品： 1)材料：大肠杆菌

2）试剂：0.1mol/l的CaCl2，灭过菌的甘油 3）仪器：超净工作台，4℃离心机 7.3.1.2实验步骤：

1）开始实验前，打开工作台紫外线照射30分钟（菌液不要放入），照射后，打开照明灯，打开鼓风

2） 用镊子夹取酒精球擦手，注意手上酒精挥发后再点燃酒精灯。所有实验在酒精灯上进行 3）打开离心管盖置于冰盒，再取培养基，将100ml培养基分装至两个离心管中，盖好盖。将三角瓶盖好置于待灭菌区，把分装好的离心管做好标记，在冰上放置10分钟，然后离心3000r 10分钟

3） 离心后放置冰上，将上清倒掉

4） 取100-1000ul的，取5mlcacl2置于50ml的离心管中，重悬

5） 倒去上清液，重复上一步操作，将菌体重悬一次，动作轻缓，置于冰上放置15到30分

钟，之后4摄氏度离心3000r离心10分钟，倒去上清 6） 100-1000ul的吸取加入4mlCaCl2/个，将菌体重悬，

7） 取灭菌后的甘油，每只离心管吸取600ul的甘油，使甘油的浓度达15%，注意在吸取甘

油要缓慢，吸取完毕后将其置于离心管中。将甘油混匀。完毕后，将甘油瓶盖好 8） 之后，离心管置于冰上放置1-2分钟后即为感受态细胞。

9） 可将悬液转至1.5ml的离心管中，每只大约200ul。分装完毕做好标记，置于-70℃保存。

7.3.2重组质粒转入BL21并诱导表达 7.3.2.1实验用品：

1）材料：重组质粒，BL21感受态细胞

2）试剂：LB固液培养基，24mg/ml IPTG,20mg/ml X-gal 3）仪器：恒温摇床，离心机，金属浴，培养箱 7.3.2.2实验步骤

1）从上一步得到的DH5α细胞中提取重组质粒 2）（注意，感受态细胞融化过程要置于冰上，不可于室温，拿离心管上端。）感受态细胞溶化后，按每200ul感受态细胞加入整管连接产物 3） 混匀后，冰浴30分钟。

4） 30分钟后取感受态混合物在42℃热冲击90s

5） 90s后，取出立即冰浴5分钟，注意移动过程不要剧烈摇晃

6）5分钟后，向混合物加0.8mlLB液体培养基，于37摄氏度摇床震荡培养1小时 7）之后，混合物放于离心机6000r /min 离心3分钟 3分钟后，取出，去掉上清液800ul，约剩200ul的菌液

8）在超净工作台上加入40ul的IPTG和40ul的x-gal（加之前，吹打菌液使成为悬浮液），加后混匀

9）吸取80ul菌液，加在含有氨苄抗生素的LB 固体培养基上，涂布棒涂布。涂布棒需冷却后。之后，将平板置于超级工作台30分钟

10）之后，将平板做好标记，用封口膜封好。置于37℃培养箱中培养过夜，第二天观察结果

7.3.2.3实验结果预测

在紫外线照射下可以看到绿色荧光 四、实验结果预测

若是操作正确，实验结果成功的几率是很大的，但是仍不排除实验失败的可能。如果失败可能的原因有：（1）荧光的强弱直接与蛋白表达量有光，这与质粒导入量息息相关，可能由于操作不当，导致导入量较少，则导致荧光较弱；(2)同为感受态细胞的DH5a和BL21都可以作为表达宿主。BL21 是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，做蛋白表达是比较适合用的，。BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高表达。DH5a复制稳定的特点，所以它是核酸疫苗通常使用的宿主株。DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的RNA POLYMERASE 识别，比较好用的载体有PLPR可诱导的启动子。而带有T7 启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7 启动子的T7 RNA POLYMERASE 在DH5a中没有。

对于BL21，已将T7 RNA POLYMERASE 的编码基因整合到了菌的基因组上，能识别T7 启动子，从而可容纳外源基因在此T7启动子的带动下表达。转化是选择BL21，是由于其比较合适做蛋白表达，BL-21为非重组酶缺陷型，转化进入其中的重组质粒不能稳定存在，这也可能是失败的原因。 四、 参考文献

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[2]周俊初,史巧娟,谢波. 绿色荧光蛋白基因(gfp)在华癸中生根瘤菌与紫云英共生固氮作用研究中的应用[J]. 中国科学基金,2001,05:48-51.

[3]孙义敏,尹丙姣,李卓娅,姜小丹,徐勇. 重组绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白的表达及应用[J]. 华中

科技大学学报(医学版),2004,05:519-521+534.

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