２０１３年第３期 世界热带农业信息 天然橡胶专栏 橡胶基因组中一个与酿酒酵母脯氨酸特异性通透酶 基因部分同源的多态性片段的克隆及序列测定① Ｐ．Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ等著 （印度橡胶研究所） 田郎译 （中国热带农业科学院橡胶研究所） 摘 要橡胶树（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ Ｍｕｅｌ１．Ａｒｇ．）的传统种植区主要分布于高温多雨的热带地区，抗旱基因或 ＤＮＡ标记的筛选鉴定对于橡胶耐旱品系的选育及橡胶树向温光和雨量相对不足的非传统植胶区的拓展具有十分 重要的意义。ＲＡＰＤ分析是目前遗传多态性研究及特异性基因片段鉴定最有效的分子学工具之一。本研究借助聚 合酶链式反应（ＰＣＲ）对来自３７个橡胶无性系的基因组ＤＮＡｓ进行了ＲＡＰＤ分析。结果显示，多态性及特异性扩 增条带的数量随无性系及引物的不同而有所差异，有些扩增带为一些无性系共有，而另一些则仅存在于个别或 少数无性系之中。根据引物ＯＰＢ一１２的两个特异性扩增条带（１．２和１．４ ｋｂ）在各无性系中单独或同时存在与否， 我们鉴定出了两个相应的特异性ＲＡＰＤ标记，其中１．４ ｋｂ扩增带尤其引人注目。克隆及测序结果表明，该ＲＡＰＤ片 段与酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）脯氨酸特异性通透酶基因存在一定程度同源性。针对该片段设计一对 特异性引物并再次对基因组ＤＮＡ进行更严格条件下的ＰＣＲ扩增，结果从１４个参试无性系中获得了该１．４ｋｂ条带。 这种由ＲＡＰＤ标记通过特异性引物设计转化得到的ＳＣＡＲ（序列特异性扩增区）标记可用于橡胶树优良或特异性 基因的筛选及鉴定。 关键词橡胶树，克隆，ＤＮＡ扩增，聚合酶链式反应，ＲＡＰＤ标记 天然橡胶是一种以顺式一１，４一聚异戊二烯为 体用于性状遗传规律的研究。 主要成分的天然高分子化合物。迄今为止，橡胶 纵观橡胶遗传育种的发展历史，尽管人们在 在植物体内的生理功能尚不完全清楚。天然橡胶 橡胶产量改良上已取得相当大的进展，但对于各 具有弹性强、可塑性高、绝缘性好，以及防滑、 种抗逆性状的改良还远远不能满足植胶业发展的 耐磨和抗撕裂性强等众多优异性能，是一种用途 需求。究其原因，一是橡胶栽培群体本身的遗传 极为广泛而重要的工业原料。目前，巴西橡胶树 基础极为狭窄，二是现有的橡胶遗传资源十分贫 （Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｍｕｌ１．）Ａｒｇ．】依然是全球商品 乏，三是常规手段难以有效地鉴定和利用各种有 天然橡胶的唯一来源。随着世界经济的高速发展 用的基因资源。近年来，随着植物分子生物学的 及天然橡胶需求量的Ｅｔ益增加，橡胶树的种植已 迅猛发展，ＤＮＡ分子标记这一新兴技术的出现为 逐渐拓展到了热带边缘地区。由于橡胶树原产南 植物优良及特异基因的筛选鉴定提供了一条十分 美热带雨林，是一种典型的热带作物，各种生物 有效的途径。与其它标记（包括形态、细胞及生化标 及非生物胁迫因子的存在无疑极大程度地了 记）相比，ＤＮＡ标记由于在植物基因组中数量多， 橡胶树向非传统植胶区的发展。此外，橡胶树是 多态性高，且检测不受发育阶段和环境条件的影 一种遗传上高度杂合的多年生木本作物，加上授 响，也不受基因表达与否的，因而在植物亲 粉结实率低，这使得人们很难得到合适的后裔群 缘关系及多态性研究上具有明显的优越性。 ①基金项目：国家天然橡胶产业技术体系专项资金项目（ＮＯ．ＣＡＲＳ一３４一ＧＷ１）。 收稿日期：２０１３—０２—０５；编辑部Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｊｒｄｎｙｘｘ＠１２６．ｃｏｍ。 世界热带农业信息 ２０１３年第３期 糖凝胶电泳以检测和鉴定多态性条带。每引物至 少重复扩增３次，剔除模糊条带，仅纪录可重复出 现的清晰扩增带用于ＲＡＰＤ分析。就每一无性系而 言，将扩增片段视作非连续性状，根据其出现与 否分别记作１和０。 为了将挑选出的ＲＡＰＤ条带转换成ＳＣＡＲ标 记，按Ｓａｍｂｒｏｏｋ等人的方法对这些条带进行克隆 据报道，包括同工酶，小卫星，ＲＦＬＰ， ＡＦＬＰ，以及ＲＡＰＤ在内的很多分子标记已成功地 被用于橡胶树遗传多态性及品种鉴定的研究。在 这些ＤＮＡ多态性检测技术中，基于ＰＣＲ（聚合酶链 式反应）的ＲＡＰＤ分析是相对简单而有效的技术之 一，利用该技术只需少量ＤＮＡ样品即可建立所鉴 定品系的ＤＮＡ指纹图谱。ＲＡＰＤ扩增产物经电泳 分离后，根据ＤＮＡ条带存在与否筛选出的标记还 可用于植物种间及种内遗传变异，特异性基因鉴 定，以及基因表达模式等诸多方面的研究。此外， 利用随机引物获得的ＲＡＰＤ标记可进一步被转换成 ＳＣＡＲ（序列特异性扩增区）标记。由于ＳＣＡＲ标记 采用一对相对较长且与模板ＤＮＡ完全互补的特异 性引物（约２０个碱基）对原ＲＡＰＤ片段进行ＰＣＲ扩 增，因而其结果更加稳定可靠，可重复性也更强。 目前，在莴苣属（Ｌｅｔｍｃ￣，野豌豆属（ ａ）， 小麦属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ），以及剪股颖属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）植 物中都已有过此方面的研究报道。 本研究重点采用Ｒ＿ＡＰＤ技术对橡胶栽培无性系 之间的遗传多样性进行分析探讨，并报道一个与 酿酒酵母脯氨酸特异性通透酶基因部分同源ＰＡＰＤ 片段的ＳＣＡＲ鉴定分析结果。 １材料和方法 从位于印度戈德亚姆的印度橡胶研究所 （ＲＲＩＩ）的试验地及苗圃采集３７个橡胶无性系的幼 嫩叶片。样品采集后于一８０￣Ｃ下冷冻保存备提取基 因组ＤＮＡ用。 按我们早先（２００２年）已报道过的改良ＣＴＡＢ 法分别提取各无性系的叶片总ＤＮＡ，之后采用一 系列寡核苷酸引物（由美［］Ｏｐｅｒｏｎ公司合成）对制备 的ＤＮＡ样品进行ＰＣＲ扩增以检测不同无性系之间 的ＲＡＰＤ变异。所有ＰＣＲ扩增反应均在ＤＮＡ热循 环仪（美［］Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ公司）上进行。每反应体系总 体积为２０ ，其中含有ｌＯｘ反应缓冲液，２５ ｎｇ模 板ＤＮＡ，２５ ｐｍｏｌ引物，２５０ ＩｘＭ ｄＮＴＰｓ，以及０．５ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶。ＰＣＲ步骤及条件为： （１） ９４￣Ｃ预变性４ ｒａｉｎ； （２）按９４￣Ｃ变性６０ Ｓ、３７＂（２退 火９０ Ｓ、７２ｑＣ延伸２ ａｒｉｎ循环３５次； （３）７２℃最后 延伸７ ｍｉｎ。最后，取等量扩增产物进行１．５％琼脂 一２一 和序列测定。所有无性系中均出现的ＤＮＡ条带被 看作是共有条带，而仅在某些而不是全部无性系 中出现的条带则看作非共有带，也即多态性条带。 将挑选出的非共有ＤＮＡ条带从琼脂糖凝胶切 割下来，然后将分离纯化的ＤＮＡ克隆进ｐＢＳ载体的 Ｅｃｏ ＲＶ位点。用重组质粒ＤＮＡ转化大肠杆菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ ＤＨ５ａ的感受态细胞，并通过蓝 白斑筛选选择转化克隆。将阳性菌落（白色）置于 １０ ｍＬ含有５０ Ｉｘｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ （Ｌｌ】 ａ—Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培养基中培养过夜。从５个 的转化克隆纯化质粒ＤＮＡ，并通过Ｅｃｏ ＲＩ及Ｂａｍ ＨＩ双酶切检测克隆的ＤＮＡ插入子的大小，之后进 行１．５％琼脂糖凝胶电泳分离。此外，质粒还用Ｔ７ 及Ｔ３￣１］序引物进行ＰＣＲ扩增，经ＤＮＡ自动测序仪 分析获得克隆片段的完整序列后，利用ＢＬＡＳＴＮ程 序在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行ＤＮＡ序列同源性搜索 比对。 根据多态 ￣ＲＡＰＤ片段的碱基序列，在原来所 用１０碱基ＲＡＰＤ￣Ｊ Ｉ物上分别增加大约１０个与该片段 两端完全互补的碱基，即可获得一对此片段的特 异性扩增引物，Ｉ！１］ＳＣＡＲ￣Ｉ物（由Ｓｉｇｍａ公司合成）。 ＰＣＲ扩增仍在上述总体积为２０１ｘＬ的反应体系中进 行，不同之处包括： （１）用１对特异性引物（正向 为５ 一ＣＣＴＦＧＡＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡ一３ ， 反向为 ５ －ＣＣＴｒＧＡＣＧＣＡＣＴｒＡＡＴＣＣＴＣ一３ ）替代ＲＡＰＤ引 物； （２）反应步骤及条件为：９４￣｛３预变性４ ｍｉｎ， ６５￣Ｃ￣Ｉ物退火１ ｍｉｎ，７２℃引物延伸２ ｍｉｎ；之后按 ９４ｏＣ １ ｍｉｎ、６５℃１ ｍｉｎ、７２℃１．３ ｍｉｎ循环３０次； 最后于７２ｑＣ再延伸７ ｍｉｎ以确保双链扩增子的产生。 之后，仍对ＰＣＲ产物进行１．５％琼脂糖凝胶电泳分 析，并观察和记录各无性系样品ＳＣＡＲ扩增带的 有无。 （未完，下期待续）
