地西他滨联合三氧化二砷对肝癌SMMC-7721细胞株P15^INK4B及甲基化转移酶表达的影响

浙江中西医结合杂志2018年第28卷第11期ZhejiangJITCWM（Vol.28No.112018）地西他滨联合三氧化二砷对肝癌SMMC-7721细胞株P15INK4B及甲基化转移酶表达的影响边祥海

孙贵富

（DAC）摘要目的探讨地西他滨和三氧化二砷（As2O3）对肝癌SMMC-7721细胞株P15INK4B抑

癌基因及甲基化转移酶表达的影响。方法MTT方法检测地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721

DNA甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3A、DNMT3B细胞株的抑制率。RT-PCR方法检测P15INK4B、

肝癌SMMC-7721细胞株细胞增殖mRNA的表达。结果2.0mmol/LDAC和2.0滋mol/LAs2O3联用，

抑制率均较4.0mmol/LDAC、4.0滋mol/LAs2O3单药组增强（[72h：（69.9依1.2）%比（33.8依0.7）%、（47.9依

联合组同4.0mmol/2.5）%，P<0.05）]。地西他滨和As2O3作用细胞72h后P15INK4B抑癌基因表达增强，

LDAC、4.0滋mol/LAs2O3单药组比较，差异有统计学意义（[0.74依0.14）比（0.57依0.15）、（0.56依0.11），

联合组同4.0mmol/LDAC、P<0.05]；甲基化转移酶表达水平下调，4.0滋mol/LAs2O3单药组比较，差异比（0.36依0.13）比有统计学意义[DNMT3A：（0.28依0.11）、（0.41依0.13），P约0.05；DNMT3B：（0.32依0.13）

（0.39依0.12）、（0.45依0.16），P<0.05；DNMT1：（0.31依0.15）比（0.44依0.19）、（0.44依0.12），P约0.05]。结论

增加P15INK4B基因表地西他滨和三氧化二砷可能通过抑制肝癌SMMC-7721细胞株甲基化转移酶，

达来抑制肝癌细胞增殖。

关键词肝癌SMMC-7721细胞株；地西他滨；三氧化二砷；P15INK4B；甲基化转移酶

DecitabineCombinedwithArsenicTrioxideEffectstheExpressionofP15INK4BandDNAMethyltrans原feraseinLiverCancerSMMC-7721CellLineHaiyanPeople'sHospital,Haiyan(314300),ChinaABSTRACTObjective

Toinvestigatetheeffectsofdecitabine（DAC）combinedwitharsenictrioxide（As2O3）onMTTmethodwasusedtoobservethesuppressionratioofdrugsontheproliferationof

BIANXianghai,SUNGuifu.

DepartmentofOncology,Zhejiang

theexpressionofP15INK4BtumorsuppressorgeneandDNAmethyltransferaseinhepatocellularcarcinomaSMMC-7721celllines.Methods

（DNMTs）,i.e.,DNMT1,DNMT3AandDNMT3B.Results

SMMC-7721cells.RT-PCRwasperformedtodetectmRNAexpressionofP15INK4B,andDNAmethyltransferases

After72htreatingwith2.0mmol/LDACand2.0滋mol/L

As2O3,thesuppressionratioofSMMC-7721proliferationincreased,comparetothoseofthesingledruggroups（ei原sionofDNMTsdecreasedsignificantly,DNMT3:（0.28依0.11）vs（0.36依0.13）and（0.41依0.13）（P约0.05）;DNMT3B:

pressionofP15INK4Bincreasedsignificantly[（0.74依0.14）vs（0.57依0.15）and（0.56依0.11）,P<0.05],andtheexpres原

DecitabineandarsenictrioxidecouldinhibittheproliferationofSMMC-7721livercancercell

ther4.0mmol/LDACor4.0滋mol/LAs2O3）（[69.9依1.2）%vs（33.8依0.7）%and（47.9依2.5）%,P<0.05].Also,theex原

（0.32依0.13）vs（0.39依0.12）and（0.45依0.16）（P约0.05）;DNMT1:（0.31依0.15）vs（0.44依0.19）and（0.44依0.12）（P约bysuppressingmethyltransferasesandincreasingtheexpressionofP15INK4Bgene.0.05）.Conclusion

KEYWORDSSMMC-7721cell;Decitabine;Arsenictrioxide;P15INK4B;Methyltransferase

肝癌恶性程度较高，预后较差，死亡率高，提高

研肝癌治愈率及生存期是肝癌研究的重点和难点。

基金项目：浙江省嘉兴市海盐县科技局计划项目（No.2016Y3B2012）

作者单位：浙江省海盐县人民医院肿瘤内科（海盐314300）通信作者：边祥海，E-mail：bxh0066@163.com

肝癌的发生与相关基因甲基化有关，正常究[1-2]证实，

肝脏、肝硬化、肝癌组织中，肿瘤抑制基因甲基化程

且差异明显。地西他滨是第一个度呈逐渐增强态势，

被美国食品药品监督管理局批准的用于治疗骨髓增生异常综合征表观遗传学的去甲基化药物，可以抑

浙江中西医结合杂志2018年第28卷第11期ZhejiangJITCWM（Vol.28No.112018）925

制甲基化转移酶，激活沉默的抑癌基因[3]。三氧化二TTCCTCGAGGCCTA-3忆；下游5忆-GTTGCAGTCCTCT

砷具有诱导肿瘤细胞分化，促进凋亡及细胞毒作用，GTGAACACTGTGG-3忆（扩增产物335bp）；DNMT3A：

小剂量联合用药有望成为肝癌治疗的新出路[4-5]。本研究主要探讨两药对肝癌SMMC-7721细胞株P15抑1癌基因及甲基化转移酶的表达影响。1.1材料与方法材料与试剂肝癌SMMC-7721细胞株引自中科院上海细胞生物研究所；地西他滨注射液098150301decitabine，DAC，山东鲁南制药集团，批senic20130304trioxide，规，格50mg/瓶）；三氧化二砷注射液

（号ar原SigmaSangon公司，规（格As10mg/2O3，瓶北京）；双四鹭甲药基业偶股份氮唑盐公司购，于批美号国1.2细胞公司培养（批批号号M2128SMMC-7721RP1100-50T）；M-MLV细胞）。试剂盒购于上海株用含10%热灭活胎牛血清（56益，灭活30min）的RPMI10培养基，置37益、5%的CO2培养箱中常规培养。每2~3天传1.3代1MTT次，法取检测各对数生组对长期细胞肝癌进SMMC-7721行实验。细胞株的生长抑制率取对数生长期细胞接种于96孔板，调整密度为1伊104整/mL，每孔接种200滋L，DACAs工作浓度分别为1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L药物组调，4.02OAs102滋3组工作浓度分别为1.0滋mol/L、2.0滋mol/L、Omol/L32.0滋，mol/L联合用药，空组工作浓度为DAC2.0mmol/L+浓度设培养5个复液和等孔。量的白分别SMMC-7721对照组加入培养24、48、72h细胞等体后悬积的加液入，RPMI20每滋个L的DMSOMTT（完全溶2005mg/mL解。

滋酶L/标孔）仪，，上继续测微570nm型孵混育合4h处器，吸光震离荡心弃上清，加入度20minOD值，。使细胞增结晶殖抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照

组1.4伊100%methyltransferasesRT-PCR。

检测P15INK4B、DNA甲基转移酶1mRNA2的表达收，DNMT1集1.3）下、DNMT3A药、DNMT3B（DNA的

RNA/伊106cDNA引个物细胞，混合按液Trizol，DNA法按提试取剂细胞物处理盒要mRNA细胞，，配每制组模约板上，基因引物由上海生工基因公司求合逆转录合成5bp忆-AATCTTTGAAAATATTATTGC-3游5忆-CTAATAAGAAAAAGATCAACT成：茁-actin：忆（-3忆;下游

G-3）；扩增忆P15INK4B扩增产物497；产下：上游5忆-TGGGGGCGGCAGCGATGA物游450bp5忆-AG-GTGGGTGGGGGTGGGAAAT-3）；DNMT1：上游5忆-ACCGCTTCTAC忆上游5忆-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3；下

游5忆-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3忆（扩增产CCAGGAAAGGC-3物551bp）；DNMT3B：上游5忆-AATGTGAATCCAGAGGAACCGT-3上（忆忆；下游5忆-ACTGGATTACACTCC12.5下94滋L游，引模物板各扩增产物190bp）。PCR体系包括：DNA21滋滋L，TaqDNA合成酶混合型actin益预变性5min，94益L1min，P15INK4B的PCR反应条件：

延P15，反57应益共45s30，72个益循环60s，，茁-MT3B伸反5min应共2的25。DNA25个滋L；PCR甲循基环转，

72益体移系酶包DNMT1括:、DNMT3A、DN原

型滋L5512.5，上滋游L及；下反游应参引数物为：各1滋L，Taq逆DNA转录合反成酶应产混物

合

循益环，30sDNMT3B，72益反60s应，共DNMT194益35个、预变性5min，94益30s，

循DNMT3A环，72益反延应伸共5min30。个

取

反应产物5滋L，1.5%琼脂糖凝胶电泳（1V/cm），凝胶

成1.5像系统计学统（BIO-RAD方法应公用司）SPSS16.0记录，ImageJ软件软进件分行统析计。分析，计量资料采用均数+标准差（x依s）表示，多组比较用F检验，组间两两比较采用t检验，P约0.05为差异有2统计学2.1结意义。地西果

他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞增殖7721抑制率比较性，联细胞合组具有优于生地地长西西抑制作他滨他滨和用和As,三具有氧化2O3单药剂量二砷组和对（时SMMC-P<0.05间依）赖

，

见表1。

表1地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞增殖抑制率比较（%，x依s）组别孔数空白组

24h48h72hFPDACDAC1.0mmol/L555.20依0.311.20依0.415.60依--DAC2.0mmol/LAsAs2O34.0mmol/L5

16.4依0.619.1依0.424.1依1.10.710.3149.334<0.05

<0.051.0滋mol/L5530.7依0.622.6依0.433.8依0.713.302<0.05

As22O联合O332.0组4.0滋滋mol/Lmol/L59.7依0.512.8依1.314.9依0.812.368<0.05

533.234.3依0.537.5依0.545.5依1.27.685<0.05F5

55.8依依0.60.838.257.1依依0.33.747.9依2.59.012<0.05

P9.277

<0.0511.31769.9<0.0515.287依1.28.525<0.05<0.05注：DAC：地西他滨；AsAs2O3：三氧化二砷；联合组：DAC2.0mmol/L+2.22O32.0地滋mol/L西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞

（（926

浙江中西医结合杂志2018年第28卷第11期ZhejiangJITCWM（Vol.28No.112018）P15INK4B基因表达的影响肝癌SMMC-7721细胞株

的AsP15INK4B基因不表达或弱表达，经地西他滨和（或）2O3作用72h后P15INK4B基因表达增强，具有剂量

依赖性，联合组较单药组比较表达明显增多，

差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2

地西他滨和（或）三氧化二砷对SMMC-7721细胞

因表达的影响（x依s）

组别P15INK4B基孔数灰度值空白组As5As2O350.38As250.34依0.16DAC2OO31.032.0滋mol/L4.0滋滋mol/Lmol/L50.43依DAC1.0mmol/L50.56依0.120.14DAC2.0mmol/L50.33依0.11联合组4.0mmol/L50.44依F5

0.57依0.140.190.74依0.15P

22.313依0.14<0.05注：DAC：地西他滨；AsAs22O32.0滋mol/L

O3：三氧化二砷；联合组：DAC2.0mmol/L+

2.3地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞甲

基化转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表达的影7721响经地西他滨和（MT1mRNA细胞甲药水平基转下移酶或）As2O3作用72h后，SMMC-具有DNMT3B剂量依、赖DNMT3A性，联合和组DN与单原

0.05组比较表达水平降下，

调，差异有统计表3

）。

地见西表他滨3。学意义（P<

和

（或）三氧化二砷对SMMC-7721细胞甲基转移酶的影响

（x依s）组别孔数空白组5DNMT3ADNMT3BDNMT1AsAs2O31.0滋mol/L

50.760.670.75依0.160.77As250.57依0.13DAC2OO332.04.0滋滋mol/Lmol/L550.410.580.68依依依0.14

0.11

0.120.45DAC1.0mmol/L0.67依依0.160.15

0.69依0.58依0.160.44依0.120.16DAC2.0mmol/L550.500.依依依0.15

0.14

0.13

0.54依依0.150.65依联合组4.0mmol/L0.39依0.120.14

0.59依0.12F5

0.280.36依依0.110.13

0.320.44依0.140.14P

11.297<0.0516.300依0.13

0.31依依0.19<0.0517.4530.15<0.05注：DAC：地西他滨；AsAs2O3：三氧化二砷；联合组：DAC2.0mmol/L+

32O3讨2.0滋mol/L论

研究[1-2]证实肝癌的发生与DNA甲基化具有密切关系。在肝癌中，CpG岛的启动子高甲基化与抑癌基因沉默、转录抑制相关[6]。地西他滨通过抑制DNA甲基转移酶，减少DNA的甲基化，从而抑制肿瘤细

胞增殖[7]。

樊伍峰等[8]研究发现，地西他滨联合丙戊酸钠可以通过激活MEK/ERK信号转导通路抑制肝癌细胞HepG2的增殖。三氧化二砷为中药砒霜的主要成分，我国学者首创其用于治疗急性早幼粒细胞白

血病，取得重大突破[4]，

研究[9]表明其对肝癌具有一定的治疗作用。2011年9月卫生部医政司颁布的

《原发性肝癌诊疗规范》中明确指出亚砷酸注射液为第一个经多中心临床研究证明有效而获国家食品药品监

管局批准用于肝癌治疗的系统性化疗药物。

孟真等[10]研究发现，三氧化二砷具有去甲基化作用。

彭土生等[11]发现三氧化二砷能抑制肝HepG2细胞的黏附、

迁移和侵袭能力。

李海燕等[12]发现三氧化二砷能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力，

机制可能与甲基化有关。

郝立晓等[13]综述了近年来三氧化二砷联合药物治疗肝癌方面的最新进展，发现三氧化二砷药物联合治疗肝癌疗效确切。

7721本研究显示，性4.0mmol/L（P<0.05细胞具有）。本生研究预长地抑制作西他滨实验用，和三显示具有氧化，地浓二西度砷他滨和对时SMMC-在间依1.0~赖4.0有较滋mol/L理想的浓浓增殖度度范范围之间，三氧化二砷在1.0~抑制作围之间用，对肝呈癌一定SMMC-7721的时间、

剂量细胞依株

赖关系（P<0.05）。为实现低毒高效的抗肝癌细胞目的，根据等效半量相加法的联合用药原则，笔者选取三氧化二砷和地西他滨的中间剂量组成联合组，同单用药比较，抑制率均比单用药高，差异有统计学意义

P<0.05）。但是，两药联合的最佳剂量组合，仍待进一步的研究。

研究[14]证实，肝癌中的肿瘤抑制基因与启动子的

高甲基化状态有关，

而这些基因在调节细胞周期、凋亡、黏附、侵袭及DNA修复中具有关键作用。周期依赖激酶抑制基因P15通常被认为是肝癌错乱甲基化的靶点之一，INK4B基因表达P15蛋白，

该蛋白质是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制性调节蛋白[15]。在许多组织中都有表达，其主要功能是通过与细胞周期依赖激酶结合，使细胞周期阻滞于G1期，从而抑制细胞增殖。DNMT1是最先被克隆的特异DNA甲基

转移酶，正常组织可呈持续低表达，

其在维持基因甲基化状态中起重要作用。DNMT3A和DNMT3B是近来被克隆的另两种形式的甲基转移酶，正常组织中

不表CpG达位或低点胞表达，两者是异常嘧啶激特活异，的只对尤其DNACpG是重位甲新点甲基甲基化修饰，

转基移转酶移DNMT3A

酶[16]。甲

基转移酶的（浙江中西医结合杂志2018年第28卷第11期ZhejiangJITCWM（Vol.28No.112018）代肿瘤医学，2016，24（9）：1501-1504援

927

和DNMT3B的异常激活，可能导致肝癌细胞某些功

能基因的启动子高度甲基化，进而可能引起包括P15INK4B基因在内的多种功能基因表达失活。彭建新

肝癌组织DNMT1、等[17]研究发现，3A、3BmRNA显著

高于其在癌旁组组织/肝硬化组织和慢性肝炎组织中

我们对肝癌细胞株SMMC-7721的体外研究的表达。

（或）P15INK4B发现，经地西他滨和As2O3作用72h后，

差异基因表达增强，联合组较单药组表达明显增多，有统计学意义（P<0.05）；甲基化转移酶DNMT3Bm原

RNA、DNMT3A和DNMT1mRNA的水平下调，差异

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506-508援

综上所述，地西他滨和三氧化二砷对肝癌

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参

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