医学动物防制２０１４年６月第３０卷第６期Ｊ Ｍｅｄ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｊｕｎ ２０１４，Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．６ ・５９１・ ｄｏｉ：１０．７６２９／ｙｘｄｗｆｚ２０１４０６００１ ・论著・ 非结核分枝杆菌快速药敏试验研究 吴海峰 ，张辉 ，王艳彬 ，吕翠环 ，李玉静 ，刘晓燕 ，徐美丽 １．河北省胸科医院，石家庄０５００４１；２．河北省血液中心 摘要：目的研究结核分枝杆菌ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０系统液体培养法和美国临床实验室标准化协会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏ‘ 分别采 ｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ＣＬＳＩＭ）２４一Ａ微量肉汤稀释法的快速药敏试验与对非结核分枝杆菌的意义。方法用ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０液体培养法联合微量肉汤稀释法的快速药敏试验与Ｌ—Ｊ固体培养法和绝对浓度药敏法分别对４８ 份非结核分支杆菌（ｎｏｎｔｕｂｅｅｒｃｕｌｏｕｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＮＴＭ）培养时间和药敏报告时间进行比较研究。结果４８份ＮＴＭ 在ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０培养仪的平均阳性报告时间（７．０±１．１）ｄ，Ｌ—Ｊ培养基平均阳性报告时间（１７．６±３．９）ｄ， 两者比较差异有统计学意义（ｔ：一１８，Ｐ＜０．０１）；微量肉汤稀释法结果报告时间为（７．２±１．２）ｄ，Ｌ—Ｊ固体药敏 试验报告时间为（２７．３±２．４）ｄ，两者比较差异有统计学意义（ｔ＝一５２．２，Ｐ＜０．０１），两种药敏试验方法对相同种 类药物的耐药率均为９０％以上，微量肉汤稀释法比Ｌ—Ｊ法可以检测的药物种类更多。结论时间上有着明显优势。 关键词：微量肉汤稀释法；Ｌ—Ｊ固体培养法；非结核分枝杆菌；药敏试验 中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３—６２４５（２０１４）０６—０５９１—０３ ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０液体 培养法联合微量肉汤稀释法的快速药敏试验比Ｌ—Ｊ固体培养法和绝对浓度药敏法在培养时间和药敏结果种类及报告 Ｒａｐｉｄ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ＷＵ Ｈａｉ—ｆｅｎｇ’，ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ—ｂｉｎ，ＬＶ Ｃｕｉ—ｈｕａｎ，ＬＩ Ｙｕ—ｊｉｎｇ，ＬＩＵ Ｘｉａｏ—ｙａｎ，ＸＵ Ｍｅｉ—ｌｉ Ｃｈｅｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＨｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００４１，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯＭｅｅｔｌｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｏｆ ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ＣＬＳＩＭ （Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）２４一Ａ ｍｉｃｒｏ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｒａｐｉｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｈｕｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｇ ｒａｐｉｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｌ—Ｊ ｓｏｌｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｎ－ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８ ｐａｔｉｅｎｔｓ ＮＴＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉ— ｔｉｖｉｔｙ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ４８ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＮＴＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ａｖｅｒａｇｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｐｏｒｔ ｔｉｍｅ ｉｓ（７．０±１．１）ｄ，Ｌ—Ｊ ｍｅｄｉａ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｖｅｒａｇｅ ｔｉｍｅ ｉｓ（１７．６±３．９）ｄ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ（ｔ＝一１８，Ｐ＜０．０１），ｍｉｃｒｏ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｉｍｅ ｉｓ（７．２± １．２）ｄ，Ｌ—Ｊ ｓｏｌｉｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｔｉｍｅ ｉｓ（２７．３±２．４）ｄ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ（ｔ＝一５２．２，Ｐ＜０．Ｏ１），ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９０％，ｍｉｃｒｏ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ｍｏｒｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｔｈａｎ ｔｈｅ Ｌ—Ｊ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｒａｐｉｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｈａｓ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｔｈａｎ Ｌ—Ｊ ｓｏｌｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｉｃｒｏ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｌ—Ｊ ｓｏｌｉｄ ｃｕｈｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｄｒｕｇ ＳＵＳ— ｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ 分枝杆菌属除了结核分枝杆菌（Ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， 基金项目：河北省医学科学重点课题计划项目（２０１００２０８） ＭＴＢ）复合群和麻风分枝杆菌外统称为非结核分枝杆 菌（ｎｏｎｔｕｂｅｅｒｃｕｌｏｕｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＮＴＭ），非结核分 枝杆菌在自然界中广泛存在，属于条件致病菌，目前 作者简介：吴海峰（１９７７一）男，主管检验师，研究方向：医学微生 物学 已发现１６０多种。ＮＴＭ病具有与结核病临床表现相 似的全身中毒症状和局部组织损害，与结核病难以区 ・５９２‘ 医学动物防制２０１４年６月第３Ｏ卷第６期Ｊ Ｍｅｄ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ分，但其治疗却与结核病有不同之处。２０００年中华 医学会结核病学分会制定出《非结核分枝杆菌病诊断 与处理指南》，２００７年ＡＴＳ（美国胸科协会）和ＩＤ． ＳＡ（美国传染病学会）也提出了ＮＴＭ肺病的临床和 微生物学诊断标准，两种诊断标准大致相同，均提出 非结核分枝杆菌肺病的诊断主要依靠病原微生物 学¨ 。ＮＴＭ菌种的筛查和药敏结果在流行病学和 临床诊断、治疗上都有重要意义 Ｊ。 本实验采用ＢＡＣＴＥＣ Ｉ￣ＩＧＩＴ ９６０液体培养法，根 据ＣＬＳＩ Ｍ２４一Ａ微量肉汤稀释法的快速药敏试验同 经典的Ｌ—Ｊ固体培养法和绝对浓度药敏法作比较， 将河北省胸科医院２０１２年分离的４８份ＮＴＭ的培养 时间和药敏试验结果进行分析报告。 １材料和方法 １．１材料来源 １．１．１研究对象２０１２年来河北省胸科医院就诊的 患者，采集痰、支气管镜灌洗液、脓标本进行分枝杆 菌培养，剔除重复送检患者，共分离出４８份ＮＴＭ。 １．１．２标准菌株结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ、牛分枝杆 菌购自生物制品研究所。 １．１．３ 仪器、试剂 ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０培养仪， ＢＢＬ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ培养管均购自美国ＢＤ公 司；快速药敏试验用肉汤购于上海积彩医疗器械有限 公司公司；改良Ｌ—Ｊ培养基及药敏培养基按《结核 病诊断细菌学检验规程》 自制。 １．２药敏试验快速药敏试验根据ＣＬＳＩ Ｍ２４一Ａ微 量肉汤稀释法，将药物包被在９６孔ｕ型微量反应板 上，由本实验室自制。浓度分别为链霉素（Ｓｍ）１、 ２、４、８ ｇ／ｍ１，异烟肼（Ｉｎｈ）０．２、０．４、０．８、１．６ ｍｌ，利福平（Ｒｆｐ）１、２、４、８ ｇ／ｍｌ，乙胺丁 醇（Ｅｍｂ）２、４、８、１６ ｇ／ｍｌ，氧氟沙星（Ｏｆｘ）２、 ８ ｇ／ｍｌ，左氧氟沙星（Ｌｆｘ）２、８ ｍｌ，阿米卡星 （Ａｍ）１、４ ｍｌ，卷曲霉素（Ｃｍ）２．５、１０ ｇ／ ｍｌ，丙硫异烟胺（Ｐｒｏ）１０、４０ ｇ／ｍ１，力克肺疾 （Ｄｐｃ）０．５、２ ｍ１，莫西沙星（Ｍｆｘ）０．５、２ ｇ／ ｍ１，环丙沙星（Ｃｉｐ）１、４ ｇ／ｍｌ，克拉霉素（Ｃｌｒ） ４、ｌ６ ｍｌ，利福布丁（Ｒｆｂ）０．７５、３ ｇ／ｍｌ，利 奈唑胺（Ｌｚ）２、８ ｍｌ，加替沙星（ＧＦＸ）２、８ ｇ／ｍｌ。 Ｌ～Ｊ培养基药敏浓度链霉素（Ｓｍ）１０、１００ ｇ／ ｍｌ，异烟肼（Ｉｎｈ）１、１０｜Ｌｇ／ｒｉｌｌ，利福平（Ｒｆｐ）５０、 ，Ｊｕｎ ２０１４，ｖ。１．３０，Ｎ。．６ ２５０ ｍｌ，乙胺丁醇（Ｅｍｂ）５、５０ ｍｌ，对氨基 水杨酸（Ｐａｓ）１、１０ ｍｌ，力克肺疾（Ｄｐｅ）１、 １０ ｇ／ｍ１，左氧氟沙星（Ｌｖｆ）２、２０ ｍｌ １．３茵型判定用于菌型鉴定的ｃ２一羧酸肼噻吩 （ＴＣＨ）１００ ｍｌ，对硝基苯甲酸（ＰＮＢ）５００ ｍｌ。 ＰＮＢ一，ＴＣＨ＋为人型结核菌；ＰＮＢ一，ＴＣＨ一 为牛型结核菌；ＰＮＢ＋，ＴＣＨ＋为非结核分支杆菌 （ＮＴＭ）。 １．４统计学分析数据采用ＳＰＳＳ １２．０统计软件处 理，计数资料以（Ｘ±ｓ）表示，两组间比较采用两独 立样本比较的ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意 义 ２结果 ２．１ 两种方法非结核分枝杆菌阳性报告时间４８份 ＮＴＮ在ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０培养仪的平均阳性报告时 间（７．０±１．１）ｄ，最快２ ｄ，最慢１４ ｄ；Ｌ—Ｊ培养 基平均阳性报告时间（１７．６±３．９）ｄ，最快７ ｄ，最 慢４２ ｄ，两组差异有统计学意义（ｔ＝一１８，Ｐ＜ ０．Ｏ１）。 ２．２ 非结核分枝杆菌药敏结果分析在报告阳性后 涂片抗酸染色确定为抗酸菌阳性，将培养物分别接种 微量反应板和Ｌ—Ｊ药敏培养基，微量肉汤稀释法结 果报告时间为（７．２±１．２）ｄ后根据微量反应板各孔 的生长情况进行菌型分型和获得药物ＭＩＣ值。Ｌ—Ｊ 常规药敏试验（２７．３±２．４）ｄ后根据生长状况得到 药敏试验结果，两者药敏结果报告时间比较差异有统 计学意义（ｔ：一５２．２，Ｐ＜０．Ｏ１），药物耐药率（见 表１）。 表１ ＮＴＭ两种药敏试验相同的药物耐药率（％） 通过表１可以得出ｓｇ、Ｉｎｈ、Ｒｆｐ、Ｅｍｂ、 、 Ｄｐｅ这６种常用的抗结核药物耐药性均在９０％以上。 快速药敏试验还可以对以下ｌ０种药物进行药敏 试验（见表２）。 医学动物防制２０１４年６月第３Ｏ卷第６期Ｊ Ｍｅｄ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｊｕｎ ２０１４，Ｖｏｋ ３０，Ｎｏ．６ ・５９３・ 表２快速药敏试验其它药物耐药率 ３讨论 能得到结果。 药敏试验药物组合包括了常用的一线和二线抗结 ＮＴＭ广泛存在于自然界，大部分是腐物寄生菌， 核药物。药敏试验结果统计ＮＴＭ对常用的药物Ｓｍ、主要见于水、土壤和气溶胶。ＮＴＭ的疏水特性形成的 Ｉｎｈ、Ｒｆｐ １００％耐药，Ｅｍｂ耐药率９０％以上，对Ｄｐｃ、 生物膜使其可持续生存于供水系统中。人可从环境中 感染ＮＴＭ而患病，水和土壤是重要的传播途径。与 结核分枝杆菌比较，ＮＴＭ毒力和致病性均较低，通常 属于机会性致病菌。ＮＴＭ的易感者主要是慢性呼吸道 疾病（ＣＯＰＤ、肺结核残余空洞、矽肺、支气管扩张 症、肺囊性纤维化等）和免疫抑制者特别是ＡＩＤＳ患 者，而在ＡＩＤＳ和免疫受损宿主中，ＮＴＭ病通常表现 为播散性。 近年来ＮＴＭ所致疾病报道增多，越来越引起临 床对分枝杆菌培养和ＮＴＭ分离鉴定的重视。由于 ＮＴＭ对常用抗结核药物普遍耐药，因此快速的菌型分 型和药敏试验结果对ＮＴＭ病的确诊和治疗方案的调 整尤为重要。 传统的分枝杆菌鉴定方法是根据其生物学特征， 如生长速度、色素、菌落形态和生化特征，进行形态 学鉴定或根据生化试验进行鉴定。常用的Ｌ—Ｊ固体 培养基培养时间需要４～８周，报阳性后再接种固体 药敏试验培养基进行菌种鉴定和药敏分析，又需要大 约４周。培养和药敏试验结果需要８一ｌ２周才能完 成，已经不能满足临床需求。因此迫切需要一种简单 快速的培养、菌种初筛和药敏试验方法以帮助临床制 定合理有效的用药方案。 利用ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０液体培养基进行分枝杆 菌培养，非结核分枝杆菌平均报阳时间为（７．０ ４－ １．１）ｄ，报阳时间最快为３ ｄ，最慢为１６ ｄ。ＮＴＭ在 ９６０培养管中不形成典型的条索状生长，通过抗酸染 色确定为抗酸菌阳性后根据ＣＬＳＩ Ｍ２４一Ａ微量肉汤稀 释法原理，接种于包被好的９６孔ｕ型微量反应板上， 培养７～１４ ｄ后即可得到菌种鉴定和药敏试验结果。 Ｌ—Ｊ培养和药敏试验法，ＮＴＭ报阳时间平均 （１７．６ ４－３．９）ｄ，最快报阳时间为７ ｄ，最慢为４２ ｄ， 抗酸染色确定阳性后接种药敏培养基需要４—８周才 ｏｆｘ、Ｌｆｘ、Ｐｔｏ、Ｒｉｂ耐药率也达到９０％以上，Ｃｉｐ、 Ｇｆｘ、Ｍｆｘ耐药率达到７０％以上，与结论符合 Ｊ。对 ｃｌｒ低浓度６０％、高浓度５５％；ｃｍ低浓度５９％、高浓 度５５％；ａｍ低浓度６５％、高浓度６０％；Ｌｚ低浓度 ６２％、高浓度５５％；４种药物尚有比较好的敏感性。 ４８份ＮＴＭ耐药率非常高，可能与来本院就诊的患者 大都经过其他医院的治疗或者有不规范的化疗经历有 关。 目前国内对ＮＴＭ分型的检验技术尚未普及，核 酸探针、ＰＣＲ技术、基因芯片和细胞壁脂肪酸色谱分 析等新技术尚未用于临床诊断，传统的固体培养药敏 方法需要时间长，利用现有的ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０液 体快速培养法，结合ＣＬＳＩ Ｍ２４一Ａ微量肉汤稀释法可 以使ＮＴＭ的菌型初筛和药敏试验结果时间缩短到１５ ～３０ ｄ，有利于临床根据菌种初筛及药敏试验结果及 时更改治疗方案，减轻病人的痛苦和经济负担。 由于本实验研究样本资料均来源于同一医院，样 本量不够大，只能菌种初筛而不能准确分型，故研究 结论需要大规模的试验进行证实和完善。 参考文献 ［１］肖和平．非结核分支杆菌病诊断与处理指南［Ｊ］．中华结核和呼 吸杂志，２０００，２３（１１）：８—１１． ［２］Ｇｒｉｆｉｔｈ ＤＥ，Ａｋｓａｍｉｔ Ｔ，Ｂｒｏｗｎ—Ｅｌｌｉｏｔｔ ＢＡ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｏｆｉｃｉａｌ Ａ＂ＩＳ／ ＩＤＳＡ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｅｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｕｓ ｍｙｅｏｂａｅｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２００７， １７５（４）：３６７—４１６． ［３］吴龙章，李一耕，蔡杏珊，等．同时从痰液、胸腔积液中分离出 鸟分支杆菌１例［Ｊ］ 中华结核和呼吸杂志，２０００，２３（１０）： ２３． ［４］中国防痨协会．结核病诊断细菌学检验规程［Ｊ］．中国防痨杂 志，１９９６。１８（１）：２８—３１． （收稿日期：２０１３一ｉ０—１９）
