酵母双杂实验步骤
2.1.1酵母双杂交2.1.1.1G ateway⼊门克隆
设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防⽌引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N 是为了保证经过⼊门载体构建⽬的载体时阅读框的正确性，⼀般建议为C。
通过PCR扩增获得带有att B位点的基因⽚段，扩增体系和条件见，其中将退⽕温度改为65℃。获得扩增产物后对其进⾏回收纯化，测定纯化后DNA的质量和浓度后进⾏下⼀步的BP反应，反应体系如下：att B-PCR产物（≥10 ng/µL）1-7µLpDONR221 (150 ng/µL)1µLTE buffer, pH 补⾜8µL
将上述混合物加⼊离⼼管中，加⼊2µL BP反应酶，加⼊之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离⼼后，25℃反应1h，加⼊1µL蛋⽩酶K后，混匀离⼼，37℃反应10min终⽌BP反应，将BP 反应产物参照进⾏转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选⽤含有50µg/mL Kan抗⽣素的LB平板进⾏阳性克隆筛选，参照检测阳性克隆，然后根据中的⽅法提取重组质粒，测定质量和浓度后送⾄测序公司进⾏测序。进⾏BP反应时，需注意以下⼏项：
(1)对于BP反应来说，最⾼效的是采⽤线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P⼊门载体；
(2)为了提⾼BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长⾄4-6h，可以将效率提⾼2-3倍，或者延长⾄过夜反应，可以将效率提⾼5-10倍，对于长⽚段克隆来讲，适当的延长反应时间是⾮常必要的；
(3)提⾼体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10µL体系中PCR产物最好不要超过250ng。2.1.1.2诱饵载体构建
重组的⼊门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下：⼊门载体 (50-150 ng)1-7µLpDEST32 (150 ng/µL)1µLTE buffer, pH 补⾜8µL
将上述混合物加⼊离⼼管中，加⼊2µL LR反应酶，加⼊之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离⼼后，25℃反应1h，加⼊1µL蛋⽩酶K后，混匀离⼼，37℃反应10min终⽌BP反应，将LR 反应产物参照进⾏转化，由于pDEST32载体为Gen抗性，所以选⽤含有50µg/mL Gen抗⽣素的LB平板进⾏阳性克隆筛选，参照检测阳性克隆，然后根据中的⽅法提取重组质粒，测定质量和浓度。
LR反应注意事项：对于LR反应来说，最⾼效的是超螺旋的⼊门载体和⽬的载体进⾏反应，但对于超过10kb的载体，将载体线性化可能反⽽会提⾼反应的效率；为了提⾼LR反应效率，可以适当延长反应时间，这对于⼤于10kb的质粒⾮常有必要。2.1.1.3转化酵母细胞
转化前需⼩量制备MaV203酵母感受态细胞，步骤如下：(1)将保存的MaV203菌株在YPAD平板上划线，30℃培养2天；(2)挑取酵母菌单克隆⾄10mL YPAD液体培养基中，30℃，230rpm
过夜培养；
(3)将过夜的酵母培养液在50mL的YPAD液体培养基中稀释⾄OD600为左右，30℃，230rpm继续培养2-4h；
(4)室温下2500rpm离⼼5min收集菌体，弃上清，加⼊40mL 1×TE（）重悬；
(5)室温下2500rpm离⼼5min收集菌体，弃上清，加⼊2mL1×LiAc/×TE重悬；(6)室温静置孵育10min；
(7)⽴即⽤于下游的酵母⼩量转化实验。
酵母感受态细胞制备完成后，按照表3-2中的组合进⾏转化，通过以下步骤将组合载体转⼊酵母细胞中：(1)向每个离⼼管中加⼊1µg质粒、100µg变性鲑鱼精DNA以及100µL酵母感受态细胞；
(2)加⼊700µL的1×LiAc/40% PEG-3350/1×TE并上下颠倒混匀，30℃孵育30min；
(3)加⼊88µL的DMSO，混匀，然后42℃热击7min；(4)在微量离⼼机中瞬时离⼼10s，弃去上清；(5)加⼊1mL1×TE重悬菌体后瞬时离⼼，弃上清；
(6)加⼊50-100µL1×TE重悬菌体，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30℃培养2天。表3-2 酵母转化组合
LEU2 Plasmid TRP1 Plasmid Purpose1none none Negative transformation control
2pEXP?32/Krev1pEXP?22/RalGDS-wt Strong positive interaction control3pEXP?32/Krev1pEXP?22/RalGDS-m1Weak positive interaction control4pEXP?32/Krev1pEXP?22/RalGDS-m2Negative interaction control5pDEST?32pDEST?22Negativeself-activation control
6Bait plasmid pDEST?22Test of self-activation2.1.1.4⾃激活检测
转化完成后，可以进⾏诱饵载体的⾃激活检测，同时确定⽂库筛选时的3AT浓度，具体步骤如下：(1)从SC-Leu-Trp平板上挑取4个包含重组诱饵载体和pDEST?22载体的单克隆，在⼀个新的SC-Leu-Trp分别划线，同时，分别挑取表3-2中组合1到5的2个单克隆作为对照，30℃培养18h；(2)将SC-Leu-Trp作为样板影印⾄包含不同3AT浓度（0 mM, 10 mM,25 mM, 50 mM, 75 mM, 和100 mM）的SC-Leu-Trp-His平板上，
迅速进⾏影印清洁2-3次，30℃培养24h；
(3)24h后，再次进⾏影印清洁2-3次，然后继续放于30℃培养约2天（40-44h）后，进⾏观察，可以抑制包含重组诱饵载体和空猎物载体的酵母细胞⽣长的最低3AT浓度即为筛库时所⽤的3AT浓度，如果这个浓度为100mM，则表明诱饵载体本⾝存在⾃激活作⽤，筛库不能进⾏，若低于100mM，则筛库可以进⾏。
2.1.1.5⽂库筛选
进⾏⽂库筛选之前，需将重组诱饵载体按照中的转化⽅法转⼊MaV203中，在SC-Leu平板上筛选阳性克隆。然后进⾏⽂库筛选级别的酵母感受态细胞制备，制备过程如下：
(1)接种含有诱饵载体的酵母菌于20 mL SC-Leu培养基中，30℃过夜培养；
(2)翌⽇早上，将培养液加⼊300 mL SC-Leu液体培养基中⾄浓度为2×106 cells/mL (OD600 =~，30℃继续培养直⾄培养液浓度达到2×107 cells/mL (OD600 =~；
(3)室温1000-1500×g离⼼5分钟收集菌体，30 mL⽆菌⽔重悬后转移⾄50 mL离⼼管中；
(4)1000-1500×g 室温离⼼5分钟，弃上清，加⼊mL1×TE/1×LiAc重悬；
(5)⽴即将感受态细胞⽤于转化。
将⽂库转化⼊酵母感受态细胞的步骤如下：
(1)加1 µg⽂库DNA和50 µg⾼质量鲑鱼精DNA⾄每个 mL离⼼管中，共加30个管，每个管⾥加⼊50 µL重悬的酵母感受态细胞。注意：⽂库DNA和鲑鱼精DNA的总体积不能超过20 µL，最好不超过10 µL；
(2)加300 µL除菌的40% PEG-3350/1×LiAc/1×TE ⾄每个离⼼管中，翻转离⼼管充分混合，30℃孵育30min；
(3)加DMSO到10% (~40 µL每管)，然后翻转混匀，42℃热击10min；(4)从⼀个转化管中取出100 µL转化液，⽤灭菌⽣理盐⽔按照1:100和1:1000进⾏稀释，每个稀释倍数涂100 µL⾄10-cm的SC-Leu-Trp板⼦上；
(5)将30个管中的转化产物分别涂到30个15-cm含有合适的3AT的SC-Leu-Trp-His平板上，30℃培养3天；
(6)计算10-cm SC-Leu-Trp板⼦上的克隆数，最好平板上长有20到300个克隆，通过下⾯的公式计算转化效率：每个转化反应的克隆数=单个平板上的克隆数×稀释倍数×转化总体积/单
个平板上涂的菌液体积；
(7)对每个SC-Leu-Trp-His+3AT平板进⾏影印清洁；(8)30℃继续培养2-3天后，初步筛选出阳性的His+克隆。2.1.1.6报告基因检测
将SC-Leu-Trp-His+3AT平板上长出来的His+克隆⼦以及中的转化组合2-6重培养的新鲜菌落，⽤⽆菌⽔稀释到同⼀浓度（⼀个直径1mm菌落加⼊30µL⽆菌⽔中，⽤⾎球计数板将所有稀释液调整⾄同⼀浓度）。检测HIS3基因和URA3基因表达情况时，将每个菌落稀释液吸取3µL点⾄SC-Leu-Trp-His+3AT，SC-Leu-Trp-Ura以及SC-Leu-Trp+5FOA（%）平板上，30℃培养3-5天。检测lac Z基因表达情况时，吸取3µL每个菌落的稀释液点⾄YPAD（覆盖NC膜）平板上，30℃培养2天，准备进⾏X-gal实验。X-gal实验的步骤如下：
(1)称取10mg X-gal溶解在100µL DMF中，溶解后加⼊10mL的Zbuffer中，同时加⼊60µL β-巯基⼄醇，混匀备⽤；
(2)将两张直径125-mm的Whatman541滤纸叠放在直径15-cm的培养⽫中，⽤约8mL的上述X-gal溶液完全浸润，并将⽓泡移除；(3)⽤镊⼦将YPAD平板表⾯的带有菌落的NC膜轻轻取出，完全浸润在液氮中20-30s，然后将冻过的NC膜轻轻放在上述准备好的滤纸上⾯，移除⽓泡，然后轻轻将培养⽫中多余的液体倒出；
(4)盖上培养⽫的盖⼦，放置于37℃孵育，孵育时将培养⽫倾斜⼀个很⼩的⾓度，从⽽避免X-gal在滤纸上过多的累积影响实验结果；
(5)24h内观察蓝⾊显现情况。
根据以上报告基因的检测结果对互作情况进⾏判断，判断标准见下表（表3-3）：表3-3 Invitrogen酵母双杂系统报告基因表型判断
Table3-3 Interpretation of phenotypes of reporter genes in Y2H system of Invitrogen-His lacZ-Ura% 5FOA互作情况假阳性+变蓝??弱互作+变蓝+?互作+⽩⾊?+不互作
