生物化学实验报告
姓 名： ****
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*****实验教学中心
实验名称 实验时间 指导老师 评分 第一部分 一、 实验目的 掌握程度 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 *** 实验地点 组员 批改日期 *** *** 实验主要目的 了解蛋白质含量测定的常用方法 掌握Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量的原理和基本操作技术 掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法 二、 实验原理 掌握程度 原理 双缩脲反应 具体内容 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。 Folin-酚显Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼
色反应 酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。 标准曲线 在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。 即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 三、 材料与方法 1、实验材料 本次实验仪器 1. V-1100分光光度计 2. 恒温水浴箱 3. 试管6支、试管架 4. 加样、加样架 5. 坐标纸 本次实验试剂 1. 牛血清白蛋白标准液（200μg/ml） 2. 碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3. Folin-酚试剂 4.健康人血清（300倍稀释）
2、实验方法 蛋白样品 混匀，放10min 加酚试剂 2s混匀 碱性铜试剂 水浴10min 放至室温 比色 3、操作步骤： 试剂（ml) 牛血清白蛋白标准液 样品液（稀释300倍） 蒸馏水 碱性硫酸铜 蛋白质浓度（μg/ml） 1 - - 1.0 2.0 0 2 0.20 - 0.80 2.0 40 3 0.40 - 0.60 2.0 80 4 0.60 - 0.40 2.0 120 5 0.80 - 0.20 2.0 160 6 - 0.50 0.50 2.0 未知 （1）各管混匀，室温放置10min。 （2）向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 （3）冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。 4、注意事项 Folin-酚试剂Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条的稳定性问题 件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），
使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。 时间问题 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。 第二部分 一、实验结果与处理 1.数据记录 测定次数 2号试管 各管吸光度测量值A500 3号试管 4号试管 5号试管 6号试管 1 2 3 平均值A500 0.030 0.031 0.032 0.031 0.063 0.0 0.065 0.0 0.088 0.087 0.087 0.087 0.147 0.144 0.144 0.145 0.136 0.133 0.133 0.134
2.绘制标准曲线 标准曲线0.160.140.120.10.080.060.040.020050y = 0.0008xR2 = 0.9541A(吸光度）0.000线性 (A(吸光度）0.000)A（吸光度）100c(ug/ml)150200 二、实验结果的计算和讨论 1、结果计算 如上图 y=0.0008x 当y=0.134时 x=167.5ug/ml 血清中含有的蛋白质数有为：167.5×2×300×0.001=100.5g/l 2、讨论与分析 参考：正常人的血清蛋白浓度范围为60-80g/l 实验结果：实验测得正常人血清蛋白含量是100.5g/l 实验的失误可能发生在: 导致失败的可能原因 A、时间没有严格控制好，在实验时没有严格按照实验时间要求操作，造成Lowry反应的显色随时间过长，颜色过深，使结果偏大 B、用于加蒸馏水的加样出现问题，加入的蒸馏水量偏小
其他能影响实C、分光光度计的装液管有洗不净的污染 验误差的原因 D、Folin-酚试剂，牛血清白蛋白标准液为多个小组共同使用，有可能在之前组被污染
