(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112175863 A(43)申请公布日 2021.01.05
(21)申请号 202010965501.9(22)申请日 2020.09.15
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M2019725 2019.09.17
C02F 3/34(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)C12R 1/385(2006.01)C12R 1/05(2006.01)
(71)申请人 重庆理工大学
地址 400054 重庆市巴南区红光大道69号
附1号(72)发明人 赵天涛 张千 陈雪 刘毫 封丽
张云茹 张磊 艾铄 (74)专利代理机构 重庆志合专利事务所(普通
合伙) 50210
代理人 胡荣珲(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)C12N 1/36(2006.01)
(54)发明名称
用于去除高盐废水中含氮污染物的复合菌剂的制备方法和应用(57)摘要
本发明涉及一种用于去除高盐废水中含氮污染物的复合菌剂的制备方法和应用，所述复合菌剂由深红红球菌C1、莱比托游动球菌、菌铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌和不动杆菌复合而成。本发明所述复合菌剂具有耐高盐、耐高氮的特性，
可在高盐条件下的好通过五种微生物协同作用，
氧环境中实现高氮废水高效脱氮。
权利要求书2页 说明书5页 附图2页
CN 112175863 ACN 112175863 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于去除高盐废水中氮含量的复合菌剂，其特征在于，该复合菌剂由深红红球菌C1 、莱比托游动球菌、菌铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌和不动杆菌复合而成。
2.根据权利要求1所述复合菌剂，其特征在于，所述深红红球菌C1 、莱比托游动球菌、菌铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌和不动杆菌的浓度均为OD600 =1.0±0.2，深红红球菌C1 ：莱比托游动球菌：菌铜绿假单胞菌：粪产碱杆菌：不动杆菌的体积比为10～15%：20～30%：10～20%：15～20%：10～20%。
3.根据权利要求1或2所述复合菌剂，其特征在于，所述深红红球菌C1的保藏号为CCTCC NO：M 2019725，莱比托游动球菌的编号为CICC 23939，菌铜绿假单胞菌的编号为CICC 20152，粪产碱杆菌的编号为CICC 222，不动杆菌的编号为CICC 10695。
4.权利要求1-3任一所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，有以下步骤：1）菌种的驯化在高氮条件下，采用盐度梯度驯化的方法，对权利要求1所述各菌种进行高盐、高氮耐受性驯化；
2）菌种的扩大培养
以含碳化合物为碳源，在含盐度为12%的CM培养基中分别对步骤1）驯化后的各菌种进行扩大培养；
3）复合菌剂的制备取步骤2）所得的菌液，按权利要求2所述比例混合，得到种子液，种子液富集培养至OD600 =1.0±0.2，即得复合菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述含碳化合物为无水乙酸钠、琥珀酸、葡萄糖中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述各菌种的扩大培养的方法为：
深红红球菌C1取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d；
莱比托游动球菌取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d；
菌铜绿假单胞菌取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d；
粪产碱杆菌取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d；
不动杆菌取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述盐度的盐为NaCl。
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权 利 要 求 书
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8.权利要求1-3任一所述复合菌剂在用于除去高盐废水在氮含量中的应用。
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说 明 书
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用于去除高盐废水中含氮污染物的复合菌剂的制备方法和
应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种用于去除高盐废水中含氮污染物的复合菌剂的制备方法和应用。
背景技术
[0002]随着我国工业化进程加剧，化工废水、腌制废水、印染废水、采油废水等生产过程产生的高盐( 盐度＞3%) 废水量也大幅增加，大部分高盐废水含氮量也较高，高氮废水处理不当直接排入水体，会导致水体富营养化等现象，造成水体质量恶化。[0003]目前对于废水脱氮的处理有多种方法, 如物理法、化学法、生物法等。其物理、化学法由于需要添加大量药剂，使得处理成本较高，过量的药剂易造成二次污染，因此有运行成本高，污染环境的缺点；生物法因经济、高效而被广泛用于废水的脱氮处理。[0004]传统生物法在低盐度条件下进行脱氮处理时具有很大的优势，但当盐度超过3.5 %时，由于高盐废水中氯离子浓度过高，会快速改变微生物的细胞渗透压从而破坏菌体细胞，抑制细菌生长，尤其是对NOB（Nitrite-oxidizing bacteria）细菌及厌氧氨氧化细菌等具有极强的毒害作用，因此，对于高盐废水，常用的生物方法有活性污泥法、氧化塘法和人工湿地法等，这些方法中：活性污泥法，抗冲击负荷能力差；氧化塘法和人工湿地法占地面积大、受季节、温度等自然影响因素大处理效果不稳定，且效果不明显。发明内容
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于去除高盐废水中含氮污染物的复合菌剂的制备方法和应用。所述复合菌剂具有耐高盐、耐高氮的特性，通过五种微生物协同作用，可在高盐条件下的好氧环境中实现高氮废水高效脱氮。[0006]本发明所述的总氮（TN）由硝态氮（NO3-）表征。[0007]本发明的技术方案是：
一种用于去除高盐废水中氮含量的复合菌剂，该复合菌剂由深红红球菌C1 、莱比托游动球菌、菌铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌和不动杆菌复合而成。[0008]所述深红红球菌C1 、莱比托游动球菌、菌铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌和不动杆菌的浓度均为OD600 =1.0±0.2，深红红球菌C1 ：莱比托游动球菌：菌铜绿假单胞菌：粪产碱杆菌：不动杆菌的体积比为10～15%：20～30%：10～20%：15～20%：10～20%。[0009]所述深红红球菌C1的保藏号为CCTCC NO：M 2019725，莱比托游动球菌的编号为CICC 23939，菌铜绿假单胞菌的编号为CICC 20152，粪产碱杆菌的编号为CICC 222，不动杆菌的编号为CICC 10695。
[0010]上述复合菌剂的制备方法，有以下步骤：
1）菌种的驯化在高氮条件下，采用盐度梯度驯化的方法，对上述各菌种进行高盐、高氮耐受性驯化；
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说 明 书
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2）菌种的扩大培养
以含碳化合物为碳源，在含盐度为12%的CM培养基中分别对步骤1）驯化后的各菌种进行扩大培养；
3）复合菌剂的制备取步骤2）所得的菌液，按上述比例混合，得到种子液，种子液富集培养至OD600 =1.0±0.2，即得复合菌剂。[0011]步骤2）所述含碳化合物为无水乙酸钠、琥珀酸、葡萄糖中的一种或几种。[0012]步骤2）中所述各菌种的扩大培养的方法为：
深红红球菌C1取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d；
莱比托游动球菌取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d；
菌铜绿假单胞菌取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d；
粪产碱杆菌取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d。
[0013]不动杆菌
取10～20 mL菌液至盐度为12%的CM培养基中，密封，在37℃、150 r/min条件下振荡培养3 d。
[0014]所述盐度的盐为NaCl。
[0015]上述复合菌剂在用于除去高盐废水在氮含量中的应用。[0016]深红红球菌C1（Rhodococcus ruber C1），属于红球菌属。菌落呈圆形、不透明、橙红色、干燥、边缘有辐射、菌落略隆起、表面光滑、质地湿润。直径为4-6 μm，长8-12 μm，革兰氏染色阳性，最佳生长温度为37～40℃，pH为7.5～8.0。[0017]莱比托游动球菌（Planococcus rifietoensis，CICC 23939），属于动性球菌属。菌落直径1.0～1.2UM左右，不产芽孢，好氧菌，菌落呈黄橙色，菌体呈圆球型，革兰氏染色阳性，最佳生长温度为27～37℃，pH为7.5～8.2。[0018]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa CICC 20152），属于假单胞菌属，菌落直径1.5～4.0UM左右，不形成芽孢，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明，菌体呈短棒型；革兰氏染色阴性。最佳生长温度为30～40℃，pH为7.5～8.0。[0019]粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis CICC 222），属于粪产碱杆菌属。直径为0.5～1.0mm，长度为0.5～2.6mm，通常为单一菌体排列，不产生孢子。革兰氏染色阴性，最佳生长温度为20～37℃，pH为7.5～8.0。[0020]不动杆菌（Acinetobacte CICC 10695），属于不动杆菌属，革兰氏染色阴性，菌体大小为1.5～2.5um，粘液性型菌株有荚膜，无芽孢，无鞭毛，不能运动。专性需氧，最佳生长
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说 明 书
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温度为20～37℃，pH为7.5～8.0。[0021]本发明所述的深红红球菌C1 的保藏号为“CTCC NO：M 2019725”（于2019年10月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学），分类命名为Rhodococcus ruber C1 。
[0022]莱比托游动球菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（编号CICC 23939）。[0023]菌铜绿假单胞菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（编号CICC 20152）。[0024]粪产碱杆菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（编号CICC 222）。[0025]不动杆菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（编号CICC 10695）。[0026]本发明提供的可在高盐条件下高效除氮的复合菌剂，具有如下有益效果：
（1）本发明提供的复合菌剂在高盐条件下（3%～15%）,可耐高渗透压，快速生长，并长时间保持高活性。[0027]（2）本发明提供的复合菌剂可在高盐条件下（3%～15%）完全好氧环境中高效除氮，克服了高渗环境对微生物强烈的毒害作用，同时解决了传统生物脱氮工艺好氧厌氧结合的两段式生物脱氮。[0028]（3）本发明提供的复合菌剂将其各单菌扩大培养所需的培养基成分简单，成本低，且可在短时间内大量富集。[0029]（4）本发明提供的复合菌剂使用方便、用量少，可直接投入水体中形成优势菌种高效除氮，具有处理效率高、处理成本低的优势，可以广泛推广应用。[0030]采用本发明复合菌剂能够有效解决高盐环境下，微生物细胞破裂死亡而导致生物量极低，尤其是硝化及反硝化细菌等被高渗环境强烈抑制从而导致高盐环境中生物脱氮效果极低等问题。
[0031]下面结合附图和具体实施例，对本发明作详细的说明。附图说明
[0032]图1为复合菌剂在30℃、盐氮浓度为490 mg/L时，对盐氮的去除情况；
图2为复合菌剂在不同盐度条件下对盐氮去除情况；图3为复合菌剂在30℃时对榨菜废水总氮去除情况。具体实施方式[0033]1、实验材料
CM（Czapek medium）培养基：NaNO3 3g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KCl 0.5 g,，FeSO4 0.01 g/L，蔗糖 30 g/L，用NaCl调节培养基盐度，调节CM培养基的pH值至8.0。[0034]其余试剂为市售分析纯产品。[0035]2、检测方法
菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为600 nm。污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》（第四版，中国环境科学出版社，2002）。[0036]实施例1：
步骤1）菌种的驯化深红红球菌C1（CCTCC NO：M 2019725）高盐耐受性驯化：取2 mL菌液接种于装有100 mL
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灭菌后的CM培养基（氮浓度为490mg/L）的250 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。在上述相同条件下增加NaCl浓度，进行连续传代培养，共传代6次，分别对应的NaCl浓度为3%、5%、7%、10%、13%、15%。[0037]莱比托游动球菌（CICC 23939）高盐耐受性驯化：取2 mL菌液接种于装有100 mL灭菌后的CM培养基（氮浓度为490mg/L）的250 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。增加NaCl浓度（与深红红球菌C1增加NaCl浓度相同，下同），进行连续传代培养，共传代6次。[0038]铜绿假单胞菌（CICC 20152）高盐耐受性驯化：取2 mL菌液接种于装有100 mL灭菌后的CM培养基（氮浓度为490mg/L）的250 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。在上述相同条件下增加NaCl浓度，进行连续传代培养，共传代6次。[0039]粪产碱杆菌（CICC 222）高盐耐受性驯化：取2 mL菌液接种于装有100 mL灭菌后的CM培养基（氮浓度为490mg/L）的250 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。在上述相同条件下增加NaCl浓度，进行连续传代培养，共传代6次。[0040]不动杆菌（CICC 10695）高盐耐受性驯化：取2 mL菌液接种于装有100 mL灭菌后的CM培养基（氮浓度为490mg/L）的250 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。在上述相同条件下增加NaCl浓度，进行连续传代培养，共传代6次。[0041]步骤2）菌种的扩大培养
以含无水乙酸钠为碳源，在含盐度（NaCl）为12%的CM培养基中分别对步骤1）驯化后的各菌种进行扩大培养；
深红红球菌C1（CCTCC NO：M 2019725）扩大培养方法取10～20 mL经过高氮、高盐耐受驯化后的菌液接种于装有1000 mL灭菌后的盐度为12%的CM培养基（下同）的2000 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。[0042]莱比托游动球菌（CICC 23939）的扩大培养方法
取10～20 mL经过高氮、高盐耐受驯化后的菌液接种于装有1000 mL灭菌后的盐度为12%的CM培养基的2000 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。[0043]铜绿假单胞菌（CICC 20152）的扩大培养方法
取10～20 mL经过高氮、高盐耐受驯化后的菌液接种于装有1000 mL灭菌后的盐度为12%的CM培养基的2000 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。[0044]粪产碱杆菌（CICC 222）的扩大培养方法
取10～20 mL经过高氮、高盐耐受驯化后的菌液接种于装有1000 mL灭菌后的盐度为12%的CM培养基的2000 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。[0045]不动杆菌（CICC 10695）的扩大培养方法
取10～20 mL经过高氮、高盐耐受驯化后的菌液接种于装有1000 mL灭菌后的盐度为12%的CM培养基的2000 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养3d。[0046]3）复合菌剂的制备
取步骤2）所得深红红球菌C1菌液1～1.5ml，莱比托游动球菌菌液2～3 ml，铜绿假单胞菌菌液1～2 ml，粪产碱杆菌菌液1.5～2ml，不动杆菌菌液1～2 ml，混合，得到种子液。[0047]取20 mL种子液接种于装有1000 mL灭菌后的盐度为12%的CM培养基的2000 mL三角瓶中，充分摇匀，30℃、150 r·min-1条件下培养4d。当OD600值升至0.7之后达到平稳期，得
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到复合菌剂。
[0048]实施例2：复合菌剂在盐度为12%的人工废水中高效除氮实验
人工废水配方为：乙酸钠4g，NaNO3 3g/L，KH2PO4 0.35g/L，NaHCO3 0.56g/L，所得人工废水中氮浓度为490 mg/L。[0049]取100 mL人工废水于250 mL锥形瓶中，用微量移液器向瓶中加入2 mL复合菌剂菌液（OD600为0.9～1.2），采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150 r·min-1条件下培养，然后每隔24 h测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，同时测定所述人工废水中氮（盐）的含量，确定氮的去除效果。由图1可知，在盐度为12%的条件下复合菌剂对人工废水中氮（盐）的去除率高达91.2%。[0050]实施例3：复合菌剂在不同盐度下高效除氮实验
人工废水配方为：乙酸钠4g，NaNO3 3g/L，KH2PO4 0.35g/L，NaHCO3 0.56g/L，所得人工废水中氮浓度为490 mg/L。[0051]取100 mL人工废水于250 mL锥形瓶中，用微量移液器向瓶中加入2 mL复合菌剂菌液（OD600为1-2），采用封口膜密封，将不同锥形瓶分别设置成不同的盐度（3%、5%、7%、10%、13%、15%），放入摇床设定在30℃、150 r·min-1条件下培养，测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，同时测定所述人工废水中氮（盐）的含量，确定氮的去除效果。[0052]由图2可知，复合菌剂在盐度为3～15%范围内均可实现人工废水中氮（盐）的高效去除，其去除率为87.7%-98%。[0053]实施例4：复合菌剂处理榨菜废水实验
取100 mL榨菜废水（取自重庆涪陵国色食品有限公司）于250 mL锥形瓶中，用微量移液器向瓶中加入2 mL复合菌剂菌液（OD600为1-2），采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、150 r·min-1条件下培养，然后每隔24 h测定菌液的OD600值确定菌体生长情况，同时测定废水中总氮的含量，确定去除效果。由图3可知，复合菌剂可高效去除榨菜废水中的总氮，去除率高达83.5%。
[0054]结论：申请人在实验中发现，由深红红球菌C1 、莱比托游动球菌、菌铜绿假单胞菌、粪产碱杆菌和不动杆菌复合而成的复合菌能在高盐、高氮条件下，实现总氮的高效去除，去除率高达83.5%-98%。
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