检验医学２０１５年９月第３０卷第９期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０ ， 中图分类号：Ｒｄ４６．６１ ３０．Ｎｏ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—８６４０．２０１５．０９．０１５ 文章编号：１６７３．８６４０（２０１５）０９￣９３１－０３ 文献标志码：Ａ 真菌（１，３）一Ｉ３；一Ｄ－葡聚糖多克隆抗备 及ＥＬＩＳＡ竞争法检测体系的建立 严 俊 ， 杨葳 ， 翟栓柱 ， 薛知信 ， 郁 彭 ， 周泽奇 （１．天津科技大学生物工程学院，天津３００４５７；２．天津市医疗器械技术审评中心，天津３０００７０） 摘要：目的建立高特异性和敏感性的（１，３）－３１－Ｄ－葡聚糖酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测体系。方法经 蛋白修饰的（１，３）一３－Ｄ一葡聚糖和真菌提取物作为免疫原制备兔多克隆抗体，并对高效价交叉反应弱的抗体进行 纯化和辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记，最后建立真菌（１，３）一Ｂ—Ｄ一葡聚糖ＥＬＩＳＡ竞争法检测体系。结果建立的 ＥＬＩＳＡ竞争法检测体系线性范围为３．１２５～２００ ｐｇ／ｍＬ。添加１００、２５和６．２５ ｐ ｍＬ抗原的血清回收率为９７．８％ 一１１３．６％，重复试验的变异系数＜１５％。该检测体系能有效地从血清样本中检出低浓度的烟曲霉、白念珠菌和 高浓度的隐球菌，并且对结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌和金黄色葡萄球菌５种细菌抗干扰能 力强。结论利用（１，３）一３－Ｄ．葡聚糖作为包被抗原，酶标抗体ＨＲＰ－Ａｂ３Ｂ作为检测抗体，成功建立了（１，３）－Ｂ－ Ｄ－葡聚糖ＥＬＩＳＡ竞争法检测体系。 关键词：（１，３）－Ｂ－Ｄ一葡聚糖；酶联免疫吸附试验；侵袭性真菌病 Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｉ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｆｕｎｇａｌ（１，３）－ｂｅｔａ－Ｄ— ｇｈｃａｎ ＹＡＮ Ｊｕｎ ，ＹＡＮＧ Ｗｅｉ ，ＺＨＡＩ Ｓｈｕａｎｚｈｕ ，ＸＵＥ Ｚｈｉｘｉｎ ，ＹＵ ，ＺＨＯＵ Ｚｅｑｉ ． （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，孔ｏｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｉｆｎ ３００４５７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｉａｎｊｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，死口ｎｊｉｎ ３０００７０，Ｃｈｉａ）ｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｆｕｎｇａｌ（１，３）一ｂｅｔａ—Ｄ—ｇｌｕｃａｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（１，３）一ｂｅｔａ—Ｄ—ｇｌｕｃａｎ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｅｘｔｒａｃｔ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ｌｉｔｔｌｅ ｃｒｏｓｓ・ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｏｌｙｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）ａｎｄ ｐｕｒｉｉｆｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｆｕｎｇａｌ（１，３）－ｂｅｔａ・Ｄ—ｇｌｕｃａｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｗａｓ ３．１２５—２００ ｐｇ／ｍＬ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｎｇｅ ｆｏｒ １００，２５ ａｎｄ ６．２５ ｐｇ／ｍＬ ｓｅＹＩｌｍ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ９７．８％一１ １３．６％，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｔｅｓｔ ｗａｓ＜１５％．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ ｈ Ｊｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｌｎａｎｓ ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ。ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｌｉｔｔｌｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ５ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｎｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｏｒｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ（１，３）一ｂｅｔａ－Ｄ—ｇｌｕｃａｎ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｃｏａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ— ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＨＲＰ—Ａｂ３Ｂ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：（１，３）－ｂｅｔａ－Ｄ—ｇｌｕｃａｎ；Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅ 现代移植医学的发展、获得性免疫缺陷综合 征等多种因素使低免疫人群增多，侵袭性真菌感 染的发生率迅速增长。侵袭性真菌感染症状无特 异性，诊断困难，有效治疗时间短，死亡率高。建 立特异、快速、敏感的侵袭性真菌病检测方法是临 床诊疗的需要。常用的鲎试剂检测（１，３）．Ｂ．Ｄ．葡 聚糖的试验条件苛刻，假阳性因素过多（包括内 毒素污染、溶血和部分抗肿瘤药物等）且不能检 出隐球菌和毛霉菌等 引。酶联免疫吸附试验 （ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）技术 成熟，成本相对较低，诊断快速，便于临床实验室 使用。因此，建立真菌（１，３）一Ｂ—Ｄ一葡聚糖ＥＬＩＳＡ 作者简介：严检测体系具有十分重要的临床应用价值。 材料和方法 一、材料 １．试验动物雄性新西兰兔（约２ ｋｇ／只）， 由天津国际生物医药联合研究院提供和饲养。 ２．抗原和菌种 海带多糖、茯苓多糖、凝胶 多糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖和隐球 菌荚膜多糖由丹娜（天津）生物科技有限公司提 供，曲霉菌种由北京协和医院提供。 ３．主要试剂牛血清白蛋白（ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＢＳＡ）购自上海生工生物工程有限 俊，男，１９８７年生，硕士，主要从事临床微生物疾病早期诊断研究。 验医学２０１５年９月第３Ｏ卷第９期ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｅｏｔｅｔｕｂｅｒ ２０１５．Ｖ０ｌ ３０．Ｎ０ ９ 公司，辣根过氧化物酶（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ， ＨＲＰ）标记的羊抗兔ＩｇＧ购自Ａｂｂｋｉｎｅ公司，其它 试剂购自Ｓｉｇｍａ公司。 ４．主要仪器 ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ １９０酶标仪购 自Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ公司，１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ高效液相 色谱仪购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司，ＡＫＴＡ蛋白纯化系统 ＦＰＬＣ购自Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司。 二、方法 １．免疫原制备（１，３）一３－Ｄ．葡聚糖免疫原制 备：使用过碘酸盐氧化法 和ＤＭＴＭＭ试剂法 对 （１，３）一３－Ｄ－葡聚糖（包括海带多糖、茯苓多糖和凝 胶多糖等）进行ＢＳＡ修饰。烟曲霉菌体和孢子免 疫原制备：烟曲霉经液体３０ ｏＣ ２００ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡 培养４８ ｈ后过滤收集菌体 ｊ。用３．７％甲醛灭活， 生理盐水洗涤。倒入液氮研磨破碎，收集上清液。 烟曲霉经３０℃平皿固体培养７２ ｈ后洗脱收集孢 子。用３．７％甲醛灭活，生理盐水洗涤。用血球板 法计数，超声波破碎，获得孢子破碎液。 ２．动物免疫将免疫原与弗氏完全佐剂等体 积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射。再 次免疫改用弗氏不完全佐剂。第３次免疫后，每隔 １周进行耳动脉采血，测定抗血清效价。当免疫后 效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清。 ３．间接法测定效价用磷酸盐缓冲液稀释 抗原作为包被液，在４℃包被过夜后弃去，洗液洗 涤３次，封闭液封闭。用磷酸盐缓冲液梯度稀释 抗血清／多克隆抗体后加到酶标板上，３７℃孵育 １ ｈ，洗板后加入ＨＲＰ标记的羊抗兔ＩｇＧ工作液， ３７℃孵育３０ ｍｉｎ，洗板后加入四甲基联苯胺底 物，３７℃显色１５ ｍｉｎ后终止。测定４５０ ｎｍ吸光 度（Ａ 。 ）值。将Ａ 。 值在０．４～０．６之间的抗 血清／多克隆抗体的稀释倍数作为其效价。 ４．多克隆抗体和ＨＲＰ标记抗血清先依次 用５０％和３３％饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ亲和层析，获得高纯度的多克隆抗 体ｌ 。最后用十二烷基磺酸钠．聚苯烯酰胺凝胶 电泳进行鉴定。 用过碘酸盐氧化法对抗体Ａｂ．３Ｂ进行ＨＲＰ 标记。再用｝ｉ．ＫＴＡ蛋白纯化仪分离纯化并实时检 测Ａ 值，收集第１个蛋白峰，命名为酶标抗体 ＨＲＰ—Ａｂ３Ｂ。 ５．真菌（１，３）．３－Ｄ－葡聚糖ＥＬＩＳＡ竞争法体 系酶标板包被：用磷酸盐缓冲液稀释的（１，３）－ Ｂ—Ｄ一葡聚糖作为包被液，３７℃过夜包被，洗板后 用封闭液封闭。样本处理：取３００ ＩｘＬ血清样本， 加入１００ Ｌ乙二胺四乙酸二钠处理液，振荡混 匀，沸水浴３ ｍｉｎ，１０ ０００×ｇ离心１０ ｍｉｎ。竞争法 检测：酶标板上依次加入５Ｏ 抗原标准品［（１， ３）一１３－Ｄ－葡聚糖浓度为８００、４００、２００、１００、５０、２５、 ｌ２．５、６．２５、３．１２５和１．５６３ ｐｇ／ｍＬ］或处理后样本 上清液，再加入５０ 适当浓度的酶标抗体ＨＲＰ． Ａｂ３Ｂ，混匀后３７℃孵育６０ ｍｉｎ，洗板后加四甲基 联苯胺底物溶液，３７℃显色１５ ｍｉｎ后终止。测定 Ａ４５０ 值。 ６．ＥＬＩＳＡ竞争法体系性能验证 （１）线性： ＥＬＩＳＡ竞争法重复检测３次，计算线性相关系数； （２）检测限：将Ｔｒｉｓ—ＨＣ１样本稀释液作为样本，重 复检测２０次，用文献［８］的方法计算检测限；（３） 回收率和重复性：用加１００、２５和６．２５ ｐｇ／ｍＬ凝 胶多糖的３种正常人血清作为样本，用处理液处 理后重复检测１０次；（４）交叉反应：将８种病原 菌（结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷 伯菌、金黄色葡萄球菌、烟曲霉、白念珠菌和隐球 菌）干粉添加到健康人血清中并进行梯度稀释， 样本经同样的方法处理后进行检测，观察非真菌 抗原是否出现假阳性。 结 果 一、抗血清效价和交叉试验 采集全血后分离的血清，用茯苓多糖、凝胶多 糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、隐球菌 荚膜多糖包被酶标板使用间接法进行检测。抗血 清效价超过１６ ０００的兔子有１１只（除去与其它 真菌多糖抗原存在严重交叉反应的３只）。其中 （１，３）一Ｂ—Ｄ－葡聚糖免疫获得抗血清效价高，且与 其它抗原交叉反应弱。选择其中效价最高的１Ｂ、 ２Ｃ、３Ｂ和６Ａ的兔血清进行纯化。 二、多克隆抗体Ａｂ－３Ｂ电泳鉴定 抗血清纯化的抗体中，Ａｂ一３Ｂ效价最高，效价 为１６ ０００。对其进行电泳鉴定。根据Ｍａｒｋｅｒ条带 迁移率可知，抗体Ａｂ一３Ｂ蛋白带的相对分子质量为 ５０ ０００和２５ ０００，与抗体轻链和重链的相对分子质 量完全一致，且无其它杂蛋白条带。由此证明，纯 化后抗体Ａｂ一３Ｂ中无其它杂蛋白。见图１。 １００ ０ＯＯ一 ７０ ＯＯ０— ５０ ＯＯｏ一 ～重链 一轻链 图１多克隆抗体Ａｂ一３Ｂ电泳图 检验医学２０１５年９月第３０卷第９期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１５，Ｖｏｌ ３０．Ｎｏ ９ 三、ＥＬＩＳＡ竞争法检测体系验证 建立的ＥＬＩＳＡ竞争法检测体系的线性范围为 ３．１２５～２００ ｐｇ／ｍＬ；重复检测３次，曲线拟合方程 的ｒ 值均＞０．９８，见图２；检测限为２．１３０ ｐｇ／ｍＬ； 含高、中和低浓度（１００、２５和６．２５ ｐｇ／ｍＬ）抗原血 清检测到浓度值依次为（９７．８０±９．５３）、（２６．５０± ３．７１）、（７．１０±０．９８）ｐｇ／ｍＬ，回收率为９７．８％～ １１３．６％，变异系数均＜１５％；含１０ ｇ／ｍＬ细菌 病原菌（结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、 克雷伯菌和金黄色葡萄球菌）干粉的血清均无法 检出（１，３）．Ｂ—Ｄ一葡聚糖，３种常见的真菌病原菌 （低浓度的烟曲霉、白念球菌和高浓度的隐球菌） 均能检测到（１，３）一３－Ｄ一葡聚糖。见表１。 １．５６３ ３．１２５ ６ ２５ １２ ５ ２５ ５０ １００ ２００ ４００ ８００ 抗原浓度（ｐｇ／ｍＬ） 注：■第１次，Ｙ＝１．４４—０．３８９１ｇＸ，产＝０．９９１；●第２次 Ｙ：１．３７—０．３５７１ｇＸ，ｒ ＝０．９８９；▲第３次，Ｙ＝１．２７—０．３５６１ｇＸ ｒ２＝０．９９３ 图２ ＥＬＩＳＡ竞争法的标准曲线验证 （ｐｓ／ｍＬ） 表１菌体干粉添加到血清ＥＬＩＳＡ竞争法检测结果对比 §ｌ １ ｌ ０ § Ｏ Ｏ Ｏ ０ ３ 注：＞２００或＜３．１无准确的检测值 ２ ｌ Ｏ ９ ２５表示超出该方法的检测范围，８ ７ ６ ５ ４ ０ 讨 论 降低对检测人员技术和实验室检测环境的要求，实 现准确、简便、快捷诊断侵袭性真菌病。 参考文献 【１ Ｉ ＧＵＬＬＯ Ａ．Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｃｏｎｔｉｎｕｅｓ［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ，２００９，６９（Ｓｕｐｐｌ １）：６５—７３． ［２］ ＳＨＥＮ ＹＺ，ＱＩ ＴＫ，ＭＡ Ｊｘ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ 本研究创新利用修饰的（１，３）一Ｂ－Ｄ－葡聚糖作 为包被抗原，酶标抗体ＨＲＰ．Ａｂ３Ｂ作为检测抗体， 成功建立了（１，３）．Ｂ．Ｄ．葡聚糖ＥＬＩＳＡ竞争法检测 体系。试验中使用的抗体Ａｂ一３Ｂ具有很高的特异 性，避免与其它真菌多糖的交叉反应。该检测体 系不仅能从血清中检出低浓度的曲霉和白念珠菌 （１，３）．Ｂ．Ｄ一葡聚糖，而且可以检测高浓度的隐球 菌（１，３） Ｂ．Ｄ．葡聚糖，与５种临床常见病原菌（结 核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌和 金黄色葡萄球菌）无交叉反应。此外，本检测体系 敏感性高，检测限为２．１３０ ｐｇ／ｍＬ，检测时间短， ２ ｈ内完成检测，提高了目前临床上（１，３）一Ｂ—Ｄ一葡 聚糖鲎试剂检测方法的特异性。 本研究的创新点是把原来非特异性的鲎试验 检测方法改变为特异性的ＥＬＩＳＡ检测方法，类似研 究未见报道。原鲎试验方法特异性较差，内毒素污 染、多糖类药物等都会使其呈假阳性，无法检测溶 血、高脂、黄疸、浑浊等特殊样本。ＥＬＩＳＡ检测体系 使用免疫学原理，因此不存在内毒素的干扰，溶血或 其他特殊样本经处理液处理后也能正常检测。由此 可见，相对于鲎试剂，ＥＬＩＳＡ具有明显优势。 本研究虽然建立了真菌（１，３）一ｐ—Ｄ一葡聚糖 ＥＬＩＳＡ竞争法检测体系，但是该体系的性能还需要 进一步评估。如果该检测体系能成功应用于临床诊 断，必将大大提高（１，３）．Ｂ—Ｄ．葡聚糖检测的特异性， ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｔ ａ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｏｓｐｉｔａｌ ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｅｓ，２００７，５０（６）：４７５－４８０． ［３］王端礼．医学真菌学：实验室检验指南［Ｍ］．北京： 人民卫生出版社，２００５：１２０－１２２． ［４］ＨＯＵＤＥ Ｍ，ＧＯｑＹＳＣＨＡＬＫ Ｍ，ＧＡＧＮＯＮ Ｆ，ｅｔ ａ１． Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｈａｇｏｅｙｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，２０１２，８０（２）：５０６－５１７． １５ ｌ ＳＣＨＬＯＴＩ＇ＭＡＮＮ ＳＡ，ＪＡＩＮ Ｎ，ＣＨＩＲＭＵＬＥ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｃｏｅｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｔｏ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，３０９（１—２）：７５．８５． １ ６ ｌ ＨＡＯ Ｗ，ＰＡＮ ＹＸ，ＤＩＮＧ ＹＱ，ｅｔ ａ１．Ｗｅｌ１．ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ￣ｍｎｓｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｕｍｐｒｏｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２ＯＯ８，１５（２）：１９４－ ２０２． ［７］ 黎燕，健男，纪岩．分子免疫学实验指南［Ｍ］．北京： 化学工业出版社，２００８：２９－４２． ［８］ 全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化 技术委员会．ＹＹ／Ｔ １１８３—２０１０酶联免疫吸附法检 测试剂（盒）［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２０１０． （收稿日期：２０１５－０２—２５） （本文编辑：姜敏）
