第二部分基因表达研究方法yDetection of mRNA expressionyDetection of protein expressionyDetection of promoter activity基因表达研究方法yDetection of mRNA expressionyDetection of protein expressionyDetection of promoter activityPCRPCR只是一个简单的不起眼玩艺——凯利·穆利斯（KaryMullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…它最大的特点就是能不断推出新形式。——摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]130次循环后靶序列扩增的数量No. ofNo. Amplicon1 cycle = 2 AmpliconCyclesCopies of Target2 cycle = 4 Amplicon123 cycle = 8 Amplicon244 cycle = 16 Amplicon385 cycle = 32 Amplicon4166 cycle = Amplicon53267 cycle = 128 Amplicon201,048,576301,073,741,8241. 半定量PCR•是以持家基因为参照，研究不同样本mRNA的表达变化。①选择内对照基因GAPDH、β-actin、18sRNA、28sRNA等②半定量标准计算PCR 产物：靶cDNA/GAPDH cDNA等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至平台期，不再扩增.为什么终点定量不准确？理论上PCR是一个指数增长的过程，实际PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也完全不一样，波动很大。图1同一个样本重复96次PCR的扩增曲线2为什么终点定量不准确？•传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数;•绝大多数实验需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。2. Real-time quantativeRT-PCR•实时荧光定量PCR是在PCR反应体系里加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析方法。在PCR过程中，荧光信号可以被探测器“即时”捕获，电脑软件可以通过等式△Rn=Rn+Rn计算△Rn，其中Rn+是表示每点测量的荧光强度，Rn表示荧光基线强度, △Rn的值表示PCR过程中，荧光增加的强度即PCR产物的量.•以△Rn值对循环数作曲线，选择一个荧光阈值，荧光达到荧光阈值的循环数叫做阈值循环数( Threshold cycle,Ct)，而Ct值随起始模板量的增加而线性降低，从而可以通过Ct值推算起始模板量。3有兴趣的话，也可以假设PCR的效率(即Ex)为100%，从上式推算出定量PCR标准曲线的最佳斜率和CT值的最佳范围。Ct值Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.一般取PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3‐15个循环荧光信号标准偏差的10倍.4探针法实时定量PCR•实时定量PCR的发明归功于2个重要的发现:•一是发现DNA Taq酶有5‘-3’外切酶活性; 二是利用荧光共振能量转移技术(FERT)构建了双标记寡核苷酸探针，即TaqMan探针。•随后相继出现了针，虽然这些探针不依靠DNA Taq酶有5分子信标、scorpions和’-3杂交探’外切酶活性，但都利用了FERT原理。5MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。TaqMan探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团，如TAMRA等。6分子信标作用原理无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生荧光共振能量（FRET）转移，荧光猝灭，荧光背景极低。加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET的发生，荧光恢复。7阳性内对照(IPC)的设置内对照的设置101112131415③探针设计的原则：●PCR扩增片段大小：80-150 bp;●探针不能和任一引物互补;●探针长度：小于30 Nt;●探针尽可能的靠近引物。163、Northern blot•指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。28S18S4、RNA酶保护分析法（RNaseprotection assay，RPA）0d 2d 4d 6d 8d靶mRNAGAPDHNorthern blot 杂交分析mRNA的表达RPA基本程序•待测RNA的分离•体外转录标记RNA探针•待测RNA与探针RNA进行液相杂交•RNA酶消化•不同大小杂交片段凝胶电泳分离175、原位杂交(in situ hybridization)原位杂交的原理是：将带有标记的DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片上或细胞内待测核酸(如mRNA或DNA）片段进行杂交，然后通过检测标记物的方法显示杂交结果，在光镜或电镜下就可观察目的mRNA或DNA的存在和定位。Whole mount in situ hybridizationSections in situ hybridizationFISH186、基因芯片Gene chips1、Electrophoresis基因表达研究方法yDetection of mRNA expressionyDetection of protein expressionyDetection of promoter activity2、Western blot* 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。19Western Blot一般流程z转膜•蛋白样品的制备z封闭•SDS聚丙烯酰胺z一抗杂交凝胶电泳z二抗杂交z底物显色二抗与底物反应显色•辣根过氧化物酶法（HRP）•碱性磷酸酶法（AP）•化学发光显色法(HRP)3、免疫染色（Immunostainning）•免疫组织染色是将免疫反应的特异性与组织化学的可见性相结合，利用抗体在组织和细胞内直接定位特定蛋白抗原的方法。•它具有灵敏度高、特异性强、定位准确和简便快速等优点。•免疫组织染色根据检测方式不同可分为免疫荧光和免疫组化。•荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。20•直接法：是将酶/荧光物质直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。•间接法：是将酶/荧光物质标记在第二抗体上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体；immunofluorescence免疫荧光fluorescence localisinginsulin (green), HPAP(red) in islets.Tissue is counter stained with DAPI(blue) to show nuclei.Immunohistochemistry免疫组化ABC-complexedchromagen(red) localisingestrogen receptors in breast tumor.Tissue is counter stained with haematoxylinto show nuclei.基因表达研究方法yDetection of mRNA expressionyDetection of protein expressionyDetection of promoter activity21启动子活性分析构建一个带有报告基因的转基因载体Report GenePoly APositive and promoternegative regulators;tissue specific;enhancer elements通过报告基因的表达模式获得活体条件下基因表达的信息。神经前体细胞特性启动子的研究（neurogenin1）报告基因•常用的报告基因–E.colib-半乳糖苷酶(lacZ) –葡糖苷酸酶(gusA)–荧光素酶(luc)–绿色荧光蛋白(GFP)等22
