细菌多重耐药性的转移与基因盒_整合子系统

微生物学免疫学进展2004年第32卷第2期

细菌多重耐药性的转移与基因盒-整合子系统

杜 艳 综述;陈 端 审校

(昆明医学院第一附属医院检验科,昆明 650032)

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摘 要:细菌的多重耐药已成为临床治疗的难题,近年来耐药基因转移的新机制与基因盒-整合子系统密切相关。本文就该系统的发展历史、整合子的结构与分类、基因盒的种类与表达、基因盒-整合子的检测方法及其多重耐药性传递的相关性作一全面阐述。关键词:多重耐药;转移;基因盒-整合子

分类号:R379 文献标识码:A 文章编号:1005-5673(2004)02-0068-04

多重耐药(Multidrugresistance,MDR)可由染色

体上多重耐药决定簇或基因突变介导;也可由识别耐药基因或水平转移的一组耐药基因而发展形成。这种耐药基因的扩散已引起临床抗生素耐药菌株的快速出现。传统认为耐药基因通过质粒、转座子传递;近年来有关抗生素耐药机制还涉及整台子(Inte-gron)基因结构的存在112。耐药基因能通过位点特异性重组插入质粒和转座子,即传递的另一种机制为基因盒-整合子系统。本文就该系统的发展历史、整合子的结构与分类、基因盒的种类与表达、基因盒-整合子的检测方法及与多重耐药性传递的相关性进行详述。1 历史

20世纪60年代抗生素的广泛使用,人和动物源的病原菌逐渐对许多抗生素产生耐药。80年代初,发现不同抗菌耐药基因位于而不相关的质粒或转座子的同一位置。后来认为这些基因可能整合于某一结构的同一位点。1991年Hall对转座子Tn7上不同耐药基因的分析,提出了基因盒-整合子系统的概念122。整合子在革兰阴性菌多重耐药的传播中发挥重要作用,最近在革兰阳性菌中也见报道。

2 整合子的结构与分类

整合子是保守、可移动的转座子样DNA元件,能捕获和整合耐药基因,形成巨大的多基因座(loci)。整合子包括两端的高度保守片段(Conservedsegment,CS)和中间的可变区(Variableregion)。整合

y132

子由DNA整合酶基因(int)和2个重组位点attI和attC组成。Int位于5c-末端,属于酪氨酸整合酶家族,催化基因盒在aatI和attC上的整合及切除;5c-保守区还有基因转录的启动子;3c-保守区则因整合子类型不同而异。根据整合酶基因的结构与功能可分为4类整合子。

1类最常见,结构类似于缺陷型转座子,5c-端有编码整合酶的基因intI及一个增强启动子Pant或使插入基因盒表达的启动子P2;3c-端有3个开放读码框(ORF):磺胺类耐药基因su-l1;对消毒剂和防腐剂的耐受基因qacEv1及功能不明的ORF5。据报道欧洲医院内肠杆菌科分离株中,1类整合子中最常见三种DNA插入片段(800、1000和1500bp)142。

2类位于Tn7转座子及其衍生物左端,3c-端含5个tns基因,与转座子移动有关。intl2是缺陷的intI基因,其产物与intI1有40%同一性。编码整合酶基因含保守的终止密码子,可见于大肠埃希菌和沙门菌152。而在多重耐药的末内志贺菌中也检测到2类整合子(Tn7)。另有报道还存在一种嵌合整合子,表明自然界中可能发生1、2类整合子间的重组172。

3类携带有编码B-内酰胺酶的基因盒balCIMP,整合酶基因位于5c端,与intI1有61%相同。Goldstein等在兽医分离物中检测到3类整合酶152。

4类又称为超级整合子,远大于传统整合子。整合酶也有位点特异性重组活性及类似59碱基单元(Baseelement以下简写成be)结构,含100多种基因盒,是一种新型霍乱弧菌基因组中的整合子,与抗

162

收稿日期:2003-10-27;修回日期:2003-12-22

作者简介:杜艳(1974-),女,硕士,现攻读四川大学华西基础医

学与法医学院博士研究生,主要从事临床细菌学检验及细菌耐药机制的研究。微生物学免疫学进展2004年第32卷第2期

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生素耐药无关,编码生化功能或毒力182。这种基因获得机制在细菌基因演化中比以前认为的影响大得多,而且演化中多组分系统很可能出现在抗生素时代之前。最近假单胞菌中发现的In55044被认为介于多重耐药整合子与霍乱弧菌超级整合子之间192。3 基因盒的种类与结构

基因盒(Genecassette)是小的可移动DNA分子,含基因编码区和3c端59碱基单元的重组位点。59be由整合酶识别,在attI插入基因盒,attI是邻近整合酶基因的整合酶识别位点。已确定60多个基因盒,编码对氨基糖甙类、青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、磺胺及其增效剂、氯霉素、利福平、红霉素和四价铵化合物等的耐药性。59be的长度从57到141个碱基不等,含1个60bp共同序列(Consensussequences)的不完全倒转重复序列,一旦转录RNA能形成茎-环结构;该结构也参与基因盒的移动。1个整合子可捕获1个或多个基因盒,被捕获的基因盒5c-端与attI结合,3c-端的59be结构与aatC发生位点特异性重组。常见以下几类:aad基因:编码氨基糖甙类的耐药性。已发现15种能传递不同耐药性。铜绿假单胞菌多重耐药株中发现的aacA29b属于1类整合子。AAC(6c)-29b能因紧密接合隔绝药物,而介导药物抗性。

dfr基因:编码甲氧磺胺嘧啶类的耐药。肠道细菌中已发现16种二氢叶酸还原酶基因(dhfr),大多以基因盒插入1、2类整合子,尤以高频插入到含su-l1的1类整合子中。有报道含dfrVII的整合子可能来源于IncHI1质粒1112。

编码B-内酰胺酶和超广谱B-内酰胺酶ESBL的基因:这类基因发现得越来越多。IBC-1是一种新的A类ESBL,能水解复达辛和头孢呋辛,被他唑巴坦、克拉维酸和泰能抑制1122。IBC-2是IBC-1和GES-1的突变体,与这些B-内酰胺酶仅一个氨基酸不同1132。NassT等发现一奇异变性杆菌Li-l1分离株对头孢菌素耐药,且头孢菌素与克拉维酸有明显协同并伴随头孢西丁和头孢呋辛的协同;PCR分析存在blaVEB-1基因1142。从意大利南部胃肠炎病人分离的6株散在肠炎沙门菌,5株产SHV-12,1株编码C类B-内酰胺酶。BlaSHV-12位于两种不同的自我可转移质粒上,其中之一可能携带新的1类整合子。

其它基因盒:cat编码对氯霉素的耐药性;aac编码对氨基糖苷类的耐药性,如Mark等用PCR对所有耐药株进行筛分,发现编码氨基糖苷修饰酶的基因aadA、aadB和aacA7,作为基因盒插入某些整合子1152

1102

内1162;oxa编码对苯唑西林的耐药性,如OXA-20是一种克拉维酸抑制的性苯唑西林酶,其转译起始密码子为细菌中少见的TTG。oxa20的表达可能

在转录、转译起始信号和插入位置的基础上都相当低;aar编码对利福平耐药;ere编码对红霉素耐药。4 基因盒的表达

绝大多数基因盒本身无启动子,以相同方向插入时基因的表达主要依靠上游5c端共同启动子P1。已知3种P1,和共同序列相比-35和-10序列有不同的结合。它们是TTGACAN17TAAACT(强启动子),TGGACAN17TAAGCT(弱启动子)和TGGACAN17TAAACT(杂合启动子)。这些序列的变化可能是基因表达的粗略机制。此外,在P1启动子119碱基下游插入鸟三苷,产生下游的第二弱启动子,导致转录的第二起始点,增强了插入基因盒的表达。少数整合子还有P2启动子,位于Pant的下游,属强启动子。尽管启动子的多样性、质粒拷贝数和其它内源启动子的存在会影响表达,但邻近共同启动子P1的基因都能高效表达。因为整合子插入基因盒的耐药基因表达,受插入位置的影响;任一特异基因盒介导的耐药水平当其位置邻近P1时最高;当位于一个或多个其它基因盒下游时会下降;抗生素耐药的精确度取决于上游基因盒的数目和性质。高效基因捕获和表达系统合并耐药基因的垂直传播和水平传播,成为细菌抵抗抗生素药效的一个强有力武器。处于弱启动子下或基因盒队列下游的耐药基因在抗生素选择下,可借助整合酶介导的基因重组,插入到强启动子下或靠近P1,由低水平转为高效表达,其耐药水平随之增强。5 基因盒-整合子系统的检测

迄今,最常见的检测方法是多聚酶链式反应(PCR)技术。White等用针对1、2和3类整合酶基因保守区变性的引物,PCR扩增检测肠杆菌科尿道分离物的整合子,发现120株有59株检测到1类和12株检测到2类整合子;未检测到3类整合子。KoelemanJohannesGM等用两种PCR方法调查48株不动杆菌菌株中整合子的存在情况1182:整合子PCR可产生假阴性结果,因为插入基因可超过PCR延伸量,DNA产物最大量为<2.5kb;菌株可能为无基因盒的整合子;2类整合子5c保守区不含su-l1基因。而整合酶基因检测是扩增特异的小产物,比整合子PCR更敏感。另还见一种通过扩增整合子5c末端短小保守序列的实时(Rea-ltime)PCR快速筛选技术,比传统方法更敏感和特异;该技术在现研究中携带1172

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整合子的临床菌种间未见交叉反应1192。BassL等根据整合子及常见基因盒设计引物或探针,地高辛标记后与转入尼龙膜的待检菌株基因组DNA酶切片段作DNA-DNA杂交(Southern或Colony),判断整合子及相应基因盒的存在,发现1类整合子标志物intI1和qacEv1的阳性率为63%;intI1、qacEv1和aadA1的阳性率为50%。也有学者将整合子已知位点的酶切片段克隆到质粒上,获得的重组体用于对整合子的各基因盒进行分析1212。

6 与多重耐药传递的相关性

革兰阴性菌的多重耐药似乎是由于水平转移获得耐药基因。有学者选整合子为转移标志物,在不同收集时间的同一基因型分离物具不同的整合子,提示整合子的获得与丢失;携带多菌种的几个病人具同一整合子,可能是由于病人整合子的种间转移;菌株的接合试验导致高频率完全耐药形式的转移

1222

1202

和整合细菌的耐药基因,在耐药基因的获得与传播中有重要作用;检测这一系统能快速准确获得细菌多重耐药的信息,为阐明细菌耐药机制指明了新方

向,提供了新思路,也向临床治疗多重耐药菌提出了严峻挑战。只有慎用抗生素,才能有效避免细菌多重耐药性的发生。参考文献:

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异位点(59be)和次级重组位点之间;整合到次级位

点时,如靶位附近存在适当启动子就可表达,否则为沉默基因。这种重组发生率极低,但对耐药基因的传播及质粒和细菌基因组的演化仍有意义。耐药基因的水平传播导致临床细菌产生耐药性,而移动性的基因盒一部分加速基因的传播。游离基因盒被整合子捕获后得到表达,产生耐药性。携带重组基因盒的整合子插入到转座子或接合性质粒中,负责耐药性在不同菌种间的传播。阴沟肠杆菌临床菌株中可见位于多重耐药可转移质粒上的整合子,内酰胺选择性压力有利于这些基因的传播。多重耐药性与整合子相关而与菌种或来源无关;对磺胺、磺胺增效剂、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林、哌拉西林和头孢呋辛的耐药预示整合子的存在;对氨苄西林和磺胺-磺胺增效剂的联合耐药是发展为耐其它B-内酰胺酶、氨基糖甙类、头孢菌素类和环丙沙星的起点;也增强了整合子的流行和传播。Mark等发现耐药性可通过转化转移给大肠埃希菌,说明整合子可由质粒携带。许多耐药株携带1或2个整合子,出于能在不同菌种间传播和整合几种耐药基因盒,整合子可在院内细菌中播散多重耐药性

11621122

。In34和

In7位于含同一六种耐药基因的质粒上,但质粒主要部分不相关,表明发生了多重耐药决定区的置换和水平转移。

7 结束语

基因盒-整合子系统是近年在细菌中发现的天然克隆与表达系统,是新的可移动基因元件,能捕获微生物学免疫学进展2004年第32卷第2期

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