生物技术试验讲义

生物工程专业实验讲义

(适用于生物工程专业)

曹飞

制药与生命科学学院 二零零九年四月

目 录

实验一 发酵种子的制备…………………………1 实验二 E.coli和 Pseudomonas dacunhae 2014发酵培养………2 实验三实验四实验五 实验六 实验七 实验八 实验九高速冷冻离心机的使用方法……………….3 固定化生物催化剂的制备…………………4 游离细胞与固定化细胞酶活比较…………………5 定化生物催化剂的连续生产………………6 Ｌ－Asp的分离…………………………………7 Ｌ－Asp脱羧反应制备L-Ala……………………6 离子交换树脂分离L-Ala…………………8

固 一、实验原理与实验流程

实验原理：

NH2HOOCCOOH+NH3Enzyme 1HOOCCOOHEnzyme 2HOOCNH2

实验流程：

清洗发酵罐 培养基配制 灭菌 接种 微生物发酵 离心 湿菌体 过程检测（菌体浓度、形态、pH） 卡拉胶 固定化细胞 转化 脱色 等电点结晶 干燥 固定化细胞与游离细胞酶活测定 富马酸溶液配制 L－天冬氨酸 标准曲线绘制 离交分离L-丙氨酸 脱色 离心 转化 浓缩 重结晶 离子交换树脂预处理纸层析检测反应进程 过程检测（菌体浓度、形态、pH） 微生物发酵 PS20147 接种 L－丙氨酸 培养基配制 灭菌

实验一 发酵种子的制备

一、

目的要求

了解实验室种子制备过程。 二、 原理

种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养、摇瓶液体培养和种子罐培养等多级扩大培养。在实验室里，一般只进行到摇瓶液体培养获得发酵用种子。不同菌种其具备方法不同，下图是菌种子制备过程示意图。

生产种子制备的一般流程

斜面 沙土管 冷干管 液氮管 菌种保藏 二级斜面 一级斜面 米孢子 一级种子罐 发酵罐 二级种子罐 三级种子罐 生产现场种子制备

母瓶 子瓶 实验室种子制备 三、 试验及器材

1．菌种：斜面低温保藏的大肠杆菌（E.coli）和Pseudomonas dacunhae 20147 2．培养基：E.coli种子培养基：牛肉膏 0.5% 、NaCl 0.5%、 蛋白胨 1%、

pH 7.6~7.8 P.dacunhae 20147种子培养基：15g/L谷氨酸钠、蛋白胨8g/L 、玉米浆5.5 g/L , KH2PO4 0.5g/L ,MgSO4 0.1g/L 。

3．器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶（500mL） 四、 操作方法

1．按种子培养基配方分别配制1000mL液体培养基，分装于三角瓶中，每

瓶100mL，压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出。 2．挑一环斜面低温保藏的E.coli和 P.dacunhae 20147接于各自的种子培养

基中，37℃培养24hs，转速约150rpm。

3．种子瓶摇好后，及时接种到发酵罐。也可以在冰箱中短时间保藏。 五、 思考与讨论

1. 实验室种子制备的原则是什么？

2. 哪些参数对于实验室种子制备产生影响？

实验二 E.coli和 Pseudomonas dacunhae 2014发酵培养

一、 目的要求

1．了解发酵罐的结构，掌握发酵罐的基本操作技术。 2．了解发酵罐中微生物生长的生长特征。

3．掌握实验室中微生物从斜面→摇瓶→发酵罐的无菌操作培养技术，对工

业化微生物生产过程作出初步了解。 4．掌握酶合成代谢机制。 5．掌握发酵工艺控制工艺。 二、 原理

一定数量的微生物，接种于合适的新鲜培养基中，在适宜的培养条件下，所表现出的群体生长特征可分为四个时期，即延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。微生物在各个时期的生理特征各不相同。

微生物的生长过程是其总的代谢活动的综合体现，每一种代谢途径均由一些特有的酶的反应组成，同时微生物代谢具有高度的调节作用，通过本实验了解酶合成的调节机制之一―――酶合成的诱导。 三、 试剂及器材

1．菌种：实验一液体培养24h的E.coli和 P.dacunhae 20147的实验室种子 2．发酵培养基：

E.coli发酵培养基: 玉米浆4%、富马酸1%、K2HPO40.5%、MgSO40.25%、NaCl0.1%（用氨水溶解富马酸后再加入玉米浆和其他成分，用稀盐酸调节pH为7.5），消泡剂1-2mL，pH 7.5。

P.dacunhae 20147发酵培养基：20g/L谷氨酸钠、蛋白胨10 g/L 、玉米浆20 g/L , KH2PO4 0.5g/L ,MgSO4 0.1 g/L、消泡剂1-2mL，用氨水调pH 至7.0-7.2。

121℃，灭菌20min。通气，冷却至37℃（E.coli）或30℃（P.dacunhae 20147）。 4．器材：发酵罐、灭菌锅、721分光光度计、超净工作台、台式高速离心机、离心管、移液管。 四、操作方法

1．按配方先后配制1000mL发酵培养基，调pH7.5，装入发酵罐中，包扎好

各个进气口、出气口和取样口，保持121℃下灭菌30mins，结束后取出放在发酵罐台上冷却。

2．待发酵点中的培养基冷却至37℃（E.coli）或30℃（P.dacunhae 20147）

左右时，用火环接种法将E.coli和 P.dacunhae 20147种子液接发酵罐中，接种量10~15%，控制温度37℃或30℃，转速约为300rpm，空气流速1L/min，发酵培养时间E.coli约12h、20147约18h，其中每间隔1-2hr取样测pH值和OD660值（样品进行适当稀释）纪录发酵全过程中pH值和发酵液颜色变化，过程中镜检菌体生长形态变化情况。 3．发酵结束后放罐、收集发酵液并测量其总体积（V）。吸取1 mL发酵液

于离心管中，放入台式高速离心机中离心，转速8000 rpm，时间10 min，测湿菌体重（W’）计算发酵产菌率。

五、实验记录

E.coli发酵： 时间（h） 0 2 4 6 7 8 9 10 11 12 OD0 pH 颜色

发酵初始时 发酵6h 发酵结束时

20147发酵： 时间（h） OD0 pH 颜色 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

发酵初始时 发酵6h 发酵结束时 六、思考与讨论

1．发酵培养基中碳、氮源是什么？为什么采用富马酸、L-谷氨酸为碳源？ 2．如何提高发酵效率。

3．讨论酶合成生产的调节方式。

实验三 高速冷冻离心机的使用方法

一、 目的要求

1．了解高速冰冻离心机的结构、使用方法及注意事项。 2．掌握生物物质、微生物菌体离心分离的原理。 二、 原理

离心机是利用离心力对混合溶液进行分离和沉淀的一种专用仪器，高速冰冻离心机在实验室分离和制备工作中是必不可少的工具，其最高速度可以达到25000 rpm，最大离心力可达000g。这类离心机通常带有冷却离心腔的制冷设备，温度控制是由装在离心腔内的热电偶检测离心腔的温度。高速冰冻离心机有多个内部可变换的角式或甩平式转头，它们大多用于收集微生物菌种细胞碎片，大的细胞器以及一些沉淀物等。 三、 试剂与器材

E.coli发酵液、天平、高速冰冻离心机、离心管 四、操作方法

1． 使用前先检查调速旋钮、定时旋钮等是否在“0”处，离心管是否泄漏。 2． 选择合适的转头安装到离心腔内承载转头的轴上。 3． 接通电源，打开电源开关。

4． 将待离心的液体装入合适的离心管中，盛量不宜过多（占管的2/3体积）

以免益处，盖上离心管盖，精密平衡离心管，并对称的放入转头中。

5． 调节速度旋钮和定时旋钮，至所需的速度和时间。

6． 打开起动开关，并观察离心机上的各个指示仪表是否正常工作。 7． 离心结束后自动关机、关闭冷冻开关、电源开关、切断电源。 8． 将转头取出，将离心机的盖子敞开放置。 9． 收集离心物，洗净离心管。

五、实验记录： 发酵液体积 ，

湿菌体重量 ， 单位体积菌体得率 ，

六、注意事项

1． 高速离心机的转头是镶置在一个较细的轴上，因此精密的平衡离心管及内含物是十分重要的。

2． 当转头只是部分装载时，管子必须相互对称的放在转头上，以便使负载均匀地分布在转头的周围。

3． 装载溶液时，要根据离心管的具体操作说明进行，要根据离心液体的性质、体积选择合适的离心管，液体不得装的过多，以防离心时甩出，造成转头生锈或者腐蚀。

4． 每次使用时，要仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时不能碰撞，避免造成伤痕。转头长时间不用时，要涂一层光蜡保护。

5． 转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

6． 离心过程中不得随意离开，应随时观察李新机上仪表是否正常工作，并注意声音有无异常，以便及时排除故障。

实验四 固定化生物催化剂的制备

一、 目的要求

1．学会卡拉胶固定大肠杆菌的操作方法 2．了解工业化固定生物催化剂的工艺过程 二、 原理

酶和细胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。本实验通过卡拉胶包埋法固定大肠杆菌细胞，掌握包埋法固定细胞的操作方法。

+

卡拉胶是由角叉菜提取的一种多糖，它含有许多硫酸根多糖，在K存在下，它能立即发生凝胶作用，由此形成的固定化颗粒能在磷酸缓冲液和其他电解质溶液中使用，其稳定性不受影响。卡拉胶包埋法即温和又简单，可供多种酶和细胞固定化使用。

三、 试剂及器材

大肠杆菌细胞、卡拉胶、KCl、电炉、天平、恒温水裕锅、量筒、小刀、烧杯

四、 操作方法

1．配制4%卡拉胶水溶液（A），并冷却至55~60℃。 2．配制菌悬液（B），按湿细胞重与蒸馏水为1：1（g/mL）配制，并预热至

55~60℃。

3．将A与B按4：1（mL/mL）混匀，冷至10℃使凝胶强化，把所形成的

凝胶浸在0.3MKCl溶液中。

4．取出凝胶切成5×5mm大小的小块。

5．测定固定化细胞颗粒的密度、床层空隙率、计算单位体积或重量固定化

颗粒中细胞包埋量。

五、实验记录：

固定化细胞重量 ，

六、 思考与讨论

影响卡拉胶固定化细胞颗粒机械强度的因素有哪些？

实验五 游离细胞与固定化细胞酶活比较

一、 目的要求

掌握酶活测定和计算方法 二、 原理

天门冬氨酸酶是催化富马酸和氨转化形成L-Asp的酶：

NH2HOOCCOOH+NH3EnzymeHOOCCOOH

测定发酵过程中游离细胞酶活和固定化E.coli细胞酶是评价发酵培养条件和固定化方法对大肠杆菌生产L-Asp能力影响的重要指标之一。 三、试剂与器材

1．试剂：富马酸、氨水

2．器材：752分光光度计、离心机、电炉、三角瓶、烧杯 四、 操作方法

1. 富马酸标准曲线制作（测定范围5~25μg/mL）

精确称取0.5000g富马酸，配制成0.5mg/mL母液，分别吸取母液0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mL母液，定容至10mL，即成5，10，15，20，25μg/mL富马酸标准溶液，测定各标准液OD240值，绘制成标准曲线。 2. 1M富马酸铵底物配制：内含1mM MgCl2, pH为8.5 3. 游离细胞酶活力测定

称１ｇ湿细胞，加入30ｍＬ底物溶液，于37℃下振荡反应1h，取出沸水灭活，终止反应，离心，取上清液，进行适当稀释，测OD240。

4. 固定化细胞颗粒酶活力测定

称相当于1g湿细胞的固定化细胞颗粒，加30ML底物，于37℃振荡反应1h，取样离心，适当稀释，测OD240。

5. 酶活定义：与上述反应条件下，每小时消耗1μg分子底物的酶量定

义为一个酶活单位。

五、实验记录： 富马酸标准曲线：

浓度（ug/mL） 0 5 10 15 20 25 30 OD240 游离酶活力 ， 固定化细胞活力 ， 有效因子 ，

六、思考与讨论

1. 为什么采用紫外吸收能够测定酶活力？

2. 计算游离细胞和固定化细胞酶活力，并进行比较，讨论影响固定化细胞

的酶活力的因素。

实验六 固定化生物催化剂的连续生产

一、 目的要求

了解固定化生物反应器的性能与反应器操作之间的关系 二、 原理

添装于固定床反应器中的具有天门冬氨酸酶活性的固定化大肠杆菌颗粒能连续的利用富马酸和氨作为底物，使之转变为L-Asp，其实验流程如下：底物贮槽→恒流泵→恒温固定床反应器→产品液贮槽在其它反应条件不变的情况下，反应器的性能随反应器的操作流量（即原料液在反应器中的停留时间）而变化。 三、 试剂及器材

１M富马酸铵底物（内含1m MgCl2 pH8.5）、固定床反应器、恒流泵、超级恒温水浴锅、752分光光度计、烧杯、乳胶管。 四、 操作方法

1. 将具有天冬氨酸酶活性的固定化大肠杆菌颗粒装入固定床反应器中。

连续底物贮槽、循环水等，控制恒温37℃

2. 调节恒流泵至一流量，待反应器流动稳定后测体积流量，并每隔0.5h

取样测OD240值。

3. 连续转化4-6h生产L-Asp，测定最终OD240，计算富马酸转化率。 五、 实验记录：

反应器体积 ， 固化细胞体积 ， 床层空隙率 ， 时间（h） 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 OD240 根据表中数据绘制固定化细胞连续生产OD240变化图（稀释10000倍测定）

实验七 Ｌ－Asp的分离

一、 目的要求

掌握发酵液（转化液）预处理方法 掌握等电点沉淀法分离氨基酸的方法 二、 原理

富马酸铵底物在天冬氨酸作用下转化为L-Asp，转化液在低离子强度下，调pH值至等电点（pI2.8）使L-Asp所带的静电荷为零，可大大降低L-Asp溶解度，使L-Asp沉淀出来。所得L-Asp结晶用水洗涤，不需进行重结晶，即可制得纯品。 三、 试剂及器材

60% H2SO4、活性炭、布氏漏斗、电炉、烘箱、烧杯 四、 操作方法

1. 过滤转化液，除去其中颗粒状杂质，加入活性炭脱色，然后过滤，收集溶液、测定其体积。 2. 加热滤液至90℃，用60%H2SO4调pH至2.8，然后在15℃下保温2h, 即有L-Asp结晶析出。

3. 过滤收集L-Asp晶体，用蒸馏水淋洗，过滤得L-Asp纯晶体。 4. 于烘箱中60℃烘干至恒重，称重。 五、 实验记录：

L-Asp质量 ， 单位时间生产能力 ，

六、 思考与讨论

１． 计算L-Asp理论得率和实际收率，并对结果进行讨论。 ２． 计算固定化反应器生产L-Asp能力并讨论之 单位时间反应器生产L－ASP量 固定化反应器中生产能力＝ 反应器中颗粒床层总体积

实验八 Ｌ－Asp脱羧反应制备L-Ala

一、 目的要求

掌握L-Asp生物脱羧反应制备L-Ala的方法，以及反应-分离耦合方法制备L-Ala的基本原理。 二、 原理

NH2HOOCCOOHEnzymeHOOCNH2

采用具有L-天冬氨酸脱羧酶的P.dacunhae 20147发酵液，在pH5-6的条件下，不断催化L-天冬氨酸脱羧产生L-丙氨酸。L-天冬氨酸在水溶液中溶解度较小，以固体形式存在，反应过程中伴随着脱羧产生大量的CO2气泡，而产生的L-丙氨酸的溶解度较大，能够部分溶解在发酵液中。但随着L-丙氨酸的不断生成，超过其饱和溶解度，就会在反应器内析出。此后再添加L-天冬氨酸进行脱羧反应，就会形成边底物溶解反应、边产物生成析出的、连续的反应-分离耦合过程。 三、 试剂及器材

P.dacunhae 20147发酵液、L-Asp、三角瓶、摇床。 四、 操作方法

1. 取两个三角瓶，各放置P.dacunhae 20147发酵液100mL，加入0.05gEDTA； 2. 各称取5g L-Asp加入到发酵液中，控制pH5-6，放置在摇床上，控制37℃，

转速低于50rpm，进行转化；

3. 待反应2h后，测定转化液pH值，观察摇瓶内底物是否溶解完全，是否产生

气泡。若已经完全溶解并产生大量气泡，则补加2g L-Asp，调节pH5-6。 4. 此后，每隔1h观察一次，并补加2g L-Asp；

5. 待反应10h后，将其中一瓶取下，准备进行离交分离，另外一瓶继续进行补

加L-Asp至出现L-Ala晶体。 五、 实验记录：

1、加入L-Asp量 ，

2、取初始加入L-Asp 、转化6h和12h的转化液进行纸层析，观察转化

情况。

六、思考与讨论

1. 反应-分离耦合反应过程有哪些类型？ 2. 加入EDTA的目的是什么？

实验九 离子交换法分离L-Ala

一、 目的要求

1. 学会离子交换树脂的预处理方法。

2. 掌握离子交换树脂的作用原理和操作技术。 二、 原理

离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱(＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。 离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。

本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。 三、 试剂与器材

层析柱；磨口滴液漏斗；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂（732树脂，交换容量4.5mmol/g）、 2mol／L HCl、2mol／L NaOH 、0.1mOl／L HCl 、0.1mol／L NaOH 、0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮、转化液，内含混合氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸 四、 操作方法 1．树脂的预处理

500mL烧杯中置约100g树脂，加25mL 12mol/L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。加25mL 12mol/L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。 2. 装柱

取层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至距层析柱顶2～3cm高度即可。加磨口滴液漏斗，滴加蒸馏水，使流出液pH中性为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。 3．转化液预处理

转化液用稀盐酸调节pH 2.8-3.0，经离心去除菌体以及不溶物，准备上柱。 4. 加样

打开出口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将转化液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。不断补加转化液，直至出口处pH由1转变为3.0。滴加蒸馏水，使流出液pH中性为止。

6、洗脱及洗脱液收集

从树脂顶部滴加2mo1／L NH4OH，出口处用三角瓶收集洗脱液。检测洗脱过程中pH变化，当pH转变为碱性时停止洗脱。 6、洗脱液脱色、浓缩和结晶

洗脱液中加入活性炭脱色，过滤，收集滤液。经旋转蒸发浓缩至5-10mL，

加入5mL甲醇，0-5℃下保温2h, 即有L-Ala结晶析出,过滤，烘干得L-Ala晶体。

五、 思考与讨论

1. 为什么混合氨基酸能从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来? 2. 树脂为什么要进行预处理? 六、