水稻散状穗突变体sp的遗传分析及基因初定位_刘丹

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.5705.Q.20150413.1620.008.html

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (2): 198–205, www.chinbullbotany.com

doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00198 ·研究报告·

水稻散状穗突变体sp的遗传分析及基因初定位

刘丹†, 王嘉宇†, 刘进, 马殿荣, 赵明辉, 陈温福*

沈阳农业大学水稻研究所/农业部东北水稻生物学与遗传育种重点实验室/北方超级粳稻育种教育部重点实验室, 沈阳 110866

摘要 水稻(Oryza sativa)是我国最主要的粮食作物之一, 其穗部形态直接影响着水稻产量和稻米品质。在秋光和七山占构建的重组自交系群体中发现了1个散穗突变体材料sp (spreading panicle), 田间表现为穗部一次枝梗向外延伸, 与穗轴夹角增大, 且向四周散开, 故暂命名为散穗突变体sp。与野生型相比, 突变体sp穗重、每穗粒重、千粒重、粒宽以及粒厚均极显著减少, 推测SP可能是1个参与穗部形态建成和颖花发育的基因。遗传分析表明, 该性状受1个显性核基因控制。利用sp与02428构建的F2群体进行基因定位, 将该基因定位在4号染色体长臂端, 位于E3和RM17578之间的62.9 kb区域内。该结果将为SP基因的图位克隆和揭示其作用机理奠定基础。 关键词 水稻, 散穗突变体, 遗传分析, 基因定位 刘丹, 王嘉宇, 刘进, 马殿荣, 赵明辉, 陈温福 (2015). 水稻散状穗突变体sp的遗传分析及基因初定位. 植物学报 50, 198–205.

水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一, 其穗部形态发育过程和分子机理一直是植物学研究的热点领域。水稻作为单子叶模式植物, 近年来尽管对其穗部发育过程研究取得了一定的进展, 但远不如对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)等研究得详细。水稻穗的形成过程是一个涉及腋生分生组织发育、花序结构建成和籽粒发育的复杂生理生化过程, 对其进行深入研究不仅有助于揭示水稻穗部形态建成的机理, 而且还将为水稻穗型改良提供理论指导。 突变体是功能基因组学研究的重要基础和资源, 水稻突变体的发掘和利用为研究复杂功能性状提供了一条捷径。目前, 有关水稻突变体的研究常有报道, 如叶色突变体(陈佳颖等, 2010)、叶形突变体(鞠培娜等, 2010; 李楠等, 2010)、株型突变体(Li et al., 2003; 杨德卫等, 2011)及穗型突变体(王赟等, 2003)等。水稻穗型突变体是一类容易鉴别和获得的突变体材料, 通过对其进行研究, 许多穗型相关基因被定位和克隆, 如稀穗基因LAX (LAX panicle)、短穗基因SP1 (Short Panicle1)、卷穗基因FZP (Frizzy panicle)以及直立穗基因DEP (Dense and Erect Panicle)等。LAX基因包括LAX1和LAX2, 它们分别定位在第1号和4号

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染色体上。其中LAX1编码1个植物特有的bHLH转录因子, 该转录因子是控制水稻腋芽原基形成的主要调节因子(Komatsu et al., 2003a)。LAX2编码1个核蛋白, 该蛋白含有植物特异的保守结构域, 与LAX1协同水稻AM (axillary meristems)形成的蛋白因子(Tabuchi et al., 2011)。SP1基因编码1个属于多肽转运蛋白家族的转运蛋白, 其编码产物包含一个具有12个跨膜域的保守PTR2功能域(Li et al., 2009)。FZP基因具有ERF转录激活因子的功能, 决定水稻小穗的发育(Komatsu et al., 2003b), 且FZP可能与BFL1为同一位点, 编码包含1个EREBP/AP2结构域的转录因子, 在水稻穗发育过程中, 介导小穗分生组织向小花分生组织转变(Zhu et al., 2003)。DEP基因包括DEP1、DEP2和DEP3。其中DEP1位点编码与磷脂酰乙醇胺结合蛋白有类似功能域的蛋白, 突变位点导致编码1个类似于磷脂酰乙醇胺结合蛋白的缺失, 从而促进细胞, 降低穗颈节长度并使稻穗变密、枝梗数增加及每穗籽粒数增多(Huang et al., 2009)。DEP2含有10个外显子, 编码1个由1 365个氨基酸组成的蛋白产物。由于第6外显子有31个碱基的缺失, 第2内含子有1个G/A的颠换, 导致编码框移动, 进而

收稿日期: 2014-04-01; 接受日期: 2014-05-14

基金项目: 辽宁省高等学校优秀人才支持计划(No. LJQ2013075) † 共同第一作者

* 通讯作者。E-mail: wfchen5512@126.com

刘丹等: 水稻散状穗突变体sp的遗传分析及基因初定位 199

移码(Li et al., 2010)。DEP3编码1个含有patatin样磷脂酶A2 (PLA2)超家族结构域的蛋白, PLA2 (pata-tin-like phospholipase A2)可能在维管束形成中发挥重要作用(Qiao et al., 2011)。

在籼粳杂交衍生的重组自交系群体中, 我们发现1个散穗自然突变体材料。通过对该突变体材料的表型进行鉴定并对其主要农艺性状进行调查, 进一步对散穗基因SP进行遗传分析和定位, 以期为散穗基因的图位克隆和功能分析奠定基础。

ant inbred lines, RILs)的遗传图谱, 发现SP基因定位区间来自粳稻秋光(图1)。因此, 本研究选取秋光为野生型。在成熟期, 从野生型秋光和突变体sp种植的小区中间行, 选取长势一致的5株, 考查穗重、每穗粒重、千粒重、粒宽、粒厚、株高、穗粒数、一次枝梗数以及二次枝梗数等主要农艺性状。性状调查参照《水稻田间试验方法与测定技术》(张龙步和董克, 1993)。同时, 利用TM-1000台式扫描电子显微镜对秋光、七山占和sp一次枝梗基部进行扫描观察。

1.2.2 定位群体构建

2011年正季, 将突变体sp与粳稻02428进行杂交, 获得杂交F1。2012年正季种植F1种子获得F2群体, 用于基因定位研究。同时, 分别对F1和F2表型进行调查, 统计正常表型和散穗表型的株数, 并进行卡方检验。

1.2.3 水稻基因组DNA的提取和PCR扩增

摘取苗期的幼嫩叶片, 采用2%的CTAB提取基因组DNA (Doyle and Doyle, 1987), 操作步骤略有改进, 并利用紫外分光光度计测定DNA浓度。PCR扩增总体积为15 μL, 包括DNA模板2 μL、引物(10 μmol·L–1)各2 μL、2×Mix 7.5 µL以及ddH2O 1.5 µL。扩增程序

1 材料与方法

1.1 实验材料

在秋光和七山占杂交组合构建的重组自交系群体中获得1个散穗自然突变体材料sp。对sp进行连续多代田间种植观察, 发现其散穗表型能够稳定遗传。利用sp与粳稻02428构建F2定位群体。参试材料均种植于沈阳农业大学水稻研究所辽中实验基地。

1.2 实验方法

1.2.1 突变体的表型鉴定及其主要农艺性状分析 分析秋光和七山占衍生的重组自交系群体(recombin-

图1 水稻突变体sp在12条染色体上的基因型

Figure 1 The genotype of rice sp distributing on the 12 chromosomes

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为: 94°C预变性5分钟; 94°C40秒, 55°C40秒, 72°C 40秒; 36个循环; 72°C延伸7分钟, 4°C保存。扩增产物用5%琼脂糖凝胶电泳或8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.2.4 基因定位

选取均匀分布于水稻12条染色体上的191对引物进行初定位研究。以杂交亲本sp和02428的DNA为模板, 进行PCR扩增, 筛选出突变体sp与02428间存在多态性的标记。使用Michelmore等(1991)提出的BSA (bulked segregant analysis)法构建基因池, 筛选连锁标记。即从F2群体中分别选取20个显性单株和20个隐性单株分别构建显性和隐性混池, 检测亲本间多态性引物在混池中的连锁情况, 进行sp初定位。基于初定位筛选到的与基因连锁的引物, 对sp/02428的F2群体隐性单株进行检测, 从而确定控制散穗性状的基因在染色体上的位置。

1.2.5 数据分析 将与显性亲本sp相同的带型记为A, 与亲本02428相同的带型记为B, 具有双亲带型的记为H。使用Map- Maker/EXP3.0作图软件, 构建目标基因区域的分子标记连锁图谱(Lander et al., 1987)。利用SPSS20.0软件进行表型性状方差分析。 粒重、千粒重、粒宽以及粒厚5个性状均显著低于野生型。其中, sp株高为野生型的126.69%; 穗重、每穗粒重、千粒重、粒宽和粒厚分别为野生型的80.17%、78.55%、90.65%、83.33%和.04%。同时, 还发现突变体与野生型在一次枝梗数、二次枝梗数和穗粒数3个性状上无显著差异。

2.2 遗传分析

为了分析突变体sp的遗传表型, 对sp/02428杂交组合的F1和F2表型进行鉴定, 发现其F1均表现为散穗型, 与突变体sp穗型相同, 表明散穗性状为显性性状, 控制该性状的基因为显性基因。对F2群体单株进行田间鉴定, 发现F2均存在明显分离, 且散穗和紧穗植株的数量比符合3:1的孟德尔分离规律, 表明sp受1对显性核基因控制(表2)。 2.3 基因初定位 对SP基因进行初定位, 发现在191对引物中, 59对在sp和02428间表现出多态性。基于BSA群体分离分析法, 利用59对多态性引物对散穗基因混池和隐性基 表1 水稻突变体sp与亲本的主要农艺性状分析(平均值±标准差) Table 1 Main agronomic traits of the rice sp mutant and the parents (means±SD) Characters sp 2.75±0.34** 2.60±0.31** 20.06±0.12** 6.98±0.28 2.90±0.15** 2.03±0.04** Akihikari 3.43±0.14 3.31±0.13 22.13±0.41 7.34±0.24 3.48±0.10 2.28±0.10 Panicle weight (g) Grain weight per panicle (g)1 000 grain weight (g) Grain length (mm) Grain width (mm) Grain thickness (mm) 2 结果与讨论 2.1 sp突变体的表型分析 自然生长条件下, 对比亲本和sp在田间植株的表型, 可知sp植株显著高于双亲, 且穗型松散(图2A)。进一步与野生型相比, 发现sp在灌浆期之前穗型与野生型相似(图2B), 而随着灌浆的进行, sp一次枝梗慢慢向外伸展, 至成熟期表现为散状穗型(图2C, D)。野生型秋光在整个生育期穗型都保持紧凑。在扫描电子显微镜下观察, 发现成熟期sp一次枝梗基部内侧形成了一个膨大的细胞组织, 导致一次枝梗慢慢向外伸展(图3), 亲本秋光和七山占一次枝梗基部则均未形成这样的膨大细胞组织。

比较分析突变体sp与野生型之间的主要农艺性状可知(表1), sp植株显著高于野生型, 而穗重、每穗

Plant height (cm) 145.40±2.86** 114.77±4.28Spikelet number per panicle 146.80±17.09 160.80±13.61(ea) Primary branch number (ea)13.60±0. 12.80±0.45 Second branch number (ea)21.60±4.28

25.80±2.68

**P<0.01

表2 水稻散穗突变体sp的遗传分析

Table 2 Genetic analysis of rice spreading panicle mutant Phenotype Observed Expected χ2-test

(3:1) value value

Wild-type (compact panicle)70 85 3.30 sp (spreading panicle) 270 255

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图2 水稻散穗突变体的表型特性及穗部形态

(A) 散穗突变体sp的表型(Bar=30 cm); (B) sp和秋光开花期穗部形态(Bar=5 cm); (C) sp灌浆后期穗部形态(Bar=5 cm); (D) sp成熟期穗部形态(Bar=5 cm)

Figure 2 Phenotype of rice spreading panicle mutant and parents (A) Phenotype of the sp mutant (Bar=30 cm); (B) Panicle phenotype of sp and Akihikari at anthesis stage (Bar=5 cm); (C) Panicle phenotype of sp at late grain filling stage (Bar=5 cm); (D) Panicle phenotype of sp at ripening stage (Bar=5 cm)

图3 成熟期水稻sp和其亲本的一次枝梗基部扫描电子显微镜观察

(A) sp; (B) 秋光; (C) 七山占。Bar=1 mm

Figure 3 Scanning electron microscope (SEM) observation of rice sp and parents at ripening stage (A) sp; (B) Akihikari; (C) Qishanzhan. Bar=1 mm

因混池进行检测, 发现引物L4121和M2表现为偏态扩增, 推测可能与SP基因位点连锁。在该区间合成26对引物, 其中有5对引物亲本之间存在多态性(表3), 利用这5对多态性引物对sp/02428构建的F2群体中的

70个隐性单株进行检测, 将基因SP定位于E3和RM17578之间的62.9 kb区域, 其中引物F1与SP基因共分离(图4)。根据国际水稻基因组计划(The Inter-national Rice Genome Sequencing Project, IRGSP)

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图4 分子标记F1在sp/02428 F2隐性群体中表现为共分离

P1: sp; P2: 02428; 单株1–70: F2代群体中隐性单株

Figure 4 Co-separation of F1 marker in sp/02428 F2 recessive plant population P1: sp; P2: 02428; Plants of 1–70: Recessive plants in F2 population

表3 用于SP基因定位的7对多态性引物

Table 3 Seven polymorphic markers for SP mapping Primer name Forward sequence (5′–3′) Reverse sequence (5′–3′) L4121 AACTCGTTAGAGGTGCAG GGAACCAAAGGTAGATGA M2 cttcagcttggacaggcgatg gaaaagagatgtctggacg RM348 ccgctactaatagcagagag ggagctttgttcttgcgaac E3 GTGCATCATCATCAGCCATC AAAATCGACTGCGATTGGAC F1 CATGGAACAGCGTGTATTGG TTTTCAGTTGATCAACGCCA RM17578 TGGATTGTTAATTTCCTGTCTACAA TGGACGTACACACATGCTGA RM17579 GCGTACGCTTTCTAAACTTTTG AATGGCTGGTGAATAATGTGTG

图5 SP基因在第4号染色体上的连锁图谱

Figure 5 Linkage mapping of SP on the chromosome 4 of rice

(http://rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/)上的物理图谱, 2个标记E3和RM17578之间的62.9 kb区域, 跨越OSJ- NBb002-2F16和OSJNBa0071I13两个BAC克隆群(图5)。

2.4 讨论

水稻穗型是作物驯化和遗传改良的目标性状之一。研究表明, 野生稻具有典型的散穗性状, 穗型松散有利

刘丹等: 水稻散状穗突变体sp的遗传分析及基因初定位 203

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水稻散穗性状是一类较为典型的突变性状, 目前已有对其进行基因定位研究的相关报道。截至目前, 共报道了7个散穗性状基因, 即spr1 (Kinoshita and Takamure, 1986)、spr2 (Mitra and Ganguli, 1932)、spr3 (Eiguchi and Sano, 1990; Luo et al., 2008)、spr4 (Sanchez and Khush, 1997)、spr5 (Xu et al., 2008)、spr8 (陈萍萍等, 2013)以及OsLG1 (Oryza sativa Liguleless Gene1) (Zhu et al., 2013; Ishii et al., 2013)。其中, spr1和spr8受1个隐性核基因控制, 其余5个散穗性状基因均受显性基因控制。在这些已报道的散穗基因中, spr1、spr3和spr5分别位于第4号染色体的100–154 cM、L4355和L42以及RM5879和RM255之间, 对比分析发现这3个基因均位于第4号染色体长臂端的同一区间, 推测可能为同一基因。进一步检索发现, OsLG1基因也参与水稻的散穗穗型性状。OsLG1区的碱基差异影响Os- LG1基因的表达水平, 从而导致穗型变异(Zhu et al., 2013; Ishii et al., 2013)。本研究表明, SP受1个显性核基因控制, 定位于水稻第4号染色体长臂端E3和RM17578两个引物之间, 为散穗基因的定位和克隆奠定基础。对比前人研究结果, 发现SP基因初定位区间与前人的研究类似, 但是否为同一基因或等位基因有待于进一步的测序分析。同时, 由于本研究中构建的F2群体所获得定位单株数仅70株, 远达不到精细定位的要求, 需进一步扩大定位群体的隐性单株数量, 增加突变体基因的重组频率, 方能达到精细定位SP基因的目的。

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刘丹等: 水稻散状穗突变体sp的遗传分析及基因初定位 205

Genetic Analysis and Gene Mapping of a Rice Spreading-

panicle Mutant

Dan Liu†, Jiayu Wang†, Jin Liu, Dianrong Ma, Minghui Zhao, Wenfu Chen*

Rice Research Institute of Shenyang Agricultural University/Key Laboratory of Northeast Rice Biology, Genetics and

Breeding of Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Northern Japonica Super Rice Breeding, Ministry of

Education, Shenyang 110866, China

Abstract Rice is the most important crop in our country, and the panicle traits determine the yield and quality of rice. From recombinant inbred lines derived from a cross between Akihikari (japonica) and Qishanzhan (indica), a spreading-

panicle mutant (sp) was found that had panicle branches extending outward, increased angle between primary branch and rachis and the panicle grew around this. As compared with the wild-type parent, sp showed significantly reduced panicle weight, grain weight per panicle, 1 000 grain weight, grain width and grain thickness, which implied that the sp gene participated in regulating panicle formation and glumous flower development. Genetic analysis showed that the sp phenotype was controlled by a single dominance nuclear gene. Primary mapping based on the F2 line between sp and 02428 showed that the sp gene was on the long arm of chromosome 4 and at a 62.9 kb region between markers E3 and RM17578. This information provides a basis for cloning this gene and functional mechanism analysis. Key words rice, spreading panicle mutant, genetic analysis, gene mapping Liu D, Wang JY, Liu J, Ma DR, Zhao MH, Chen WF (2015). Genetic analysis and gene mapping of a rice spreading- panicle mutant. Chin Bull Bot 50, 198–205.

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† These authors contributed equally to this paper.

* Author for correspondence. E-mail: wfchen5512@126.com (责任编辑: 孙冬花)