马铃薯不同品种(系)遗传多样性的ISSR分析

研究报告

ResearchReport

马铃薯不同品种(系)遗传多样性的ISSR分析

赵永秀1高茜1孙淑英1吴玉仙1张瑞霞1郝文胜2*

1内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特,010021;2内蒙古自治区马铃薯繁育中心,呼和浩特,010031*通讯作者,294181309@qq.com

摘要分析各品种本研究运用ISSR分子标记技术对30份马铃薯品种(系)材料进行多态性和聚类分析，

(系)间亲缘关系。结果表明：从56条ISSR引物中筛选出6条引物进行PCR扩增，共扩增出52条带，多态性条带为47个，多态性比率约为90.38%。通过UPGMA法对30份马铃薯品种(系)材料聚类分析显示，30份供试材料品种间遗传相似系数为0.40~0.95，平均相似系数为0.675；在相似性系数0.75附近，30份马铃薯品种(系)可分为6个大类，包括5大复合组和1个类。这些结果说明所选取的30个马铃薯品种(系)的遗传差异比较大，遗传多样性较丰富；该研究结果为马铃薯的遗传多样性利用及种质鉴定和杂交育种提供了有力的理论依据。

关键词

马铃薯,遗传多样性,ISSR

ISSRAnalysisonGeneticDiversityofDifferentVarieties(Lines)inSolanum

tuberosumL.

ZhaoYongxiu1GaoQian1SunShuying1WuYuxian1ZhangRuixia1HaoWensheng2*

1CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaUniversity,Huhhot,010021;2PotatoBreedingCenteroftheInnerMongoliaAutonomousRegion,Huhhot,010031

*Correspondingauthor,294181309@qq.comDOI:10.13271/j.mpb.014.003430

AbstractInthisresearch,weusedtheISSRmolecularmarker,inordertomakepolymorphism,clusteranalysisandanalysethegeneticrelationshipsof30differentvarieties(lines)inSolanumtuberosum.Theresultsshowedthat:Afteramplified6primersfrom56ISSRprimerpools,total52DNAbandswereamplified,ofwhich47werepolymorphic,andthepolymorphicratewas90.38%.Geneticsimilaritycoefficientof30potatovarieties(strains)changedfrom0.40~0.95,withanaverageof0.675.Clusteranalysisresultsindicatedthatthepotatovarieties(strains)couldbeclassifiedinto6groupsat0.75similaritylevel,including5compositegroupsand1independentgroup.Theseresultsindicatedthat30Solanumtuberosumvarietiesstrainsoftheselectedgeneticdifferences,andthegeneticdiversitywasabundant.Inaddition,theresultsofthisstudyprovidedastrongbasisfortheutilizationofgeneticdiversity,germplasmidentification,andcross-breedingofSolanumtuberosum.KeywordsSolanumtuberosum,Geneticdiversity,ISSR

中国是全球最大的马铃薯生产国，栽培面积和总产量分别占世界的28%和24%左右。生产中使用的马铃薯品种大多是由中国育种单位自主选育的(金黎平等,2015,马铃薯产业与现代化可持续农业,139-144)。随着2015年初马铃薯主粮化的推进(余欣荣,2015,聚焦,8-9)，培育优质、特色的新品种越来越

成为马铃薯发展的首要任务。ISSR(inter-simplese-quencerepeat)分子标记技术是一种很好的DNA指纹标记，它结合了RAPD与SSR技术的优点，在种质资源鉴定方面优越性更高(刘思泱,2010)。近年一些学者先后运用ISSR技术对来源不同的马铃薯种质资源进行遗传多样性分析(陈兆贵等,2009;张自

基金项目：本研究由农业良种补贴及良法推广项目(2130106)和内蒙古大学本科毕业论文设计经费共同资助

马铃薯不同品种(系)遗传多样性的ISSR分析

3431

ISSRAnalysisonGeneticDiversityofDifferentVarieties(Lines)inSolanumtuberosumL.

强等,2010;刘思泱等,2010;田大翠等,2010;何海旺等,2014;殷丽琴等,2016)，ISSR在马铃薯上的成功应用，对马铃薯育种中的亲本选择、品种鉴定、种质资源保存等方面发挥着重要作用。

本研究以实验室收集并保存的国内外30个马铃薯品种(系)为材料，利用ISSR分子标记技术，分析各马铃薯品种(系)间的遗传多样性及亲缘关系，以期在种质资源的鉴定、利用和杂交育种中亲本的选配等方面作为理论依据，进而加快育种进程。

之间，每个引物平均扩增获得的条带数为8.67个，47个条带具多态性，多态性条带比率约为90.38%，6个引物中，引物P4、P5、P6扩增出的条带数最多，为10条；引物P1扩增出的条带数最少，为6条。表明供试材料的遗传多样性较丰富。显示了引物P5、P6的扩增结果(图2;图3)。

1.330个马铃薯品种(系)的聚类分析1.3.1遗传相似系数

30份马铃薯材料的遗传相似系数为0.40~0.95(表2)，平均值为0.675，其中，菲律宾薯和ND、中心24和红玫瑰、菲律宾薯和红美人之间遗传相似系数最大，为0.95，其次是Atlantic和夏坡地、中心24和夏坡地、小红眼和冀张薯5号、中心24和Favorita、克新1号和Monana、中心24和Atlantic、乌盟601和Snowden、克新1号和小红眼、红美人和澳引2号、菲律宾薯和彩薯、红美人和ND，为0.90，说明它们的亲缘关系非常近。遗传相似系数最小的是紫花白和Desiree、陇薯3号和Desiree，为0.40，其次是紫花白和红玫瑰、紫花白和Monana、紫花白和彩薯、紫花白和粉吹雪、庄薯3号和Monana、庄薯3号和克新1号、彩薯和乌盟601，为0.45，表明它们之间的亲缘关系远。总体来说，30份马铃薯材料间的亲缘关系

1结果与分析

1.1马铃薯DNA的质量检测

30个马铃薯品种(系)提取检测结果显示(图1)，

的基因组DNA电泳条带清晰，说明提取的基因组DNA完整，可进行后续的ISSR分析。1.2ISSR引物的筛选及ISSR-PCR扩增

以提取的30个马铃薯品种(系)的基因组DNA为模板，通过对56个引物的扩增，筛选出条带比较清晰的引物6个，适合进一步试验，用于多样性分析(表1)。利用6个引物对30个马铃薯品种(系)进行PCR扩增，结果(表1)。6个引物经PCR扩增并分析共获得清晰的条带52个，这些条带均位于250~2500bp

图1供试材料基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图注:M:DL5000DNAmarker;1~30:见表3

Figure1AgeroseGelelectrophoresisofgenomicDNAtestedpotatomaterialsNote:M:DL5000DNAmarker;1~30:Seetable3

图2引物P5对30个马铃薯材料基因组DNA的PCR扩增注:M:DL2000DNAmarker;1~30:见表3

Figure2ISSRfingerprintingof30potatovarieties(strains)withprimerP5Note:M:DL2000DNAmarker;1~30:Seetable3

3432

分子植物育种

MolecularPlantBreeding

图3引物P6对30个马铃薯材料基因组DNA的PCR扩增注:M:DL2000DNAmarker;1~30:见表3

Figure3ISSRfingerprintingof30potatovarieties(strains)withprimerP6Note:M:DL2000DNAmarker;1~30:Seetable3表1ISSR引物的扩增序列与多态率

Table1SequencesofISSRprimersandthepolymorphismrate引物PrimerP1P2P3P4P5P6总数Total平均值Average

8.67

7.83

90.38

引物序列(5'－3')Primersequence(5'－3')(AG)8T(GA)8T(TC)8A(GT)8CA(CT)8AGC(GAC)5

扩增总条带数(条)Totalbands68810101052

多态性条带数(条)Polymorphicbands577991047

多态性条带比率(%)Polymorphicrate(%)83.3387.5087.5090.0090.00100.00

有一定差别，存在一定的遗传差异，这个结果为我们下一步进行品种间杂交提供借鉴。1.3.2聚类分析

聚类分析结果(图4)，在相似系数0.75附近，30份马铃薯材料分为六大类，第一类只有紫花白，第二类包括澳引2、黑美人、兴佳2号、红眼圈、陇薯3号粉吹雪、彩薯、ND、菲律宾薯、红美人、庄薯3号和中薯7号为第四类，NDR系列为第五大类，其余为第六大类，第六大类又可以分为两个亚类。

对国内外收集的30个马铃薯品种(系)进行了遗传多样性分析，从6条引物扩增出52个条带，多态性条带为47个，多态性比率约为90.38%。UPGMA聚类分析将30份马铃薯材料分为六大类，各材料遗传相似系数在0.40~0.95之间。研究结果表明30份材料间遗传变异较丰富，可作为种质资源进行亲本

获得有优势的杂交后代。和Burbank6个品种，中薯7号为第三大类，Desire、选配，

3材料与方法

3.1植物材料

试验所用的30个马铃薯品种(系)皆为内蒙古大学园艺植物生物技术实验室保存的脱毒试管苗，经扩繁后用于ISSR分析(图5)，表3为试验材料的品种和编号。

3.2DNA提取及检测

分别剪取离体快繁3周左右的各供试材料试管苗叶片，采用购自康为世纪生物科技有限公司的新型植物基因组提取试剂盒提取马铃薯DNA，用1%

2讨论

中国的马铃薯主栽品种整体上遗传基础相对狭窄，遗传组成上的差异较小，遗传多样性差，且存在地域差异性小的特点(邸宏等,2006)。ISSR标记因其引物设计简单，实验结果具重复性，且操作过程相对简单，实验中不使用同位素，就可获得高程度的DNA多态性，因而在植物遗传研究中前景非常广阔(王建波,2002)。本试验采用ISSR分子标记技术通过

表230份马铃薯品种(系)的遗传相似系数Table2Geneticsimilaritycoefficientof30potatovarieties(lines)111213141516171819202122232425262728293012345671011.0020.801.0030.700.801.00450.850.850.851.000.750.650.750.701.0061.000.801.000.600.600.400.450.551.0070.800.800.800.850.850.501.0080.850.650.650.800.800.450.851.0090.900.700.700.850.850.600.800.85100.700.500.600.650.750.600.600.75110.800.800.600.750.650.600.700.75120.800.700.700.750.650.500.700.850.800.701.000.800.700.801.00130.900.800.800.950.750.50140.800.900.700.850.550.50150.750.650.550.700.800.55160.800.800.800.850.750.501.000.701.000.700.601.000.800.600.801.000.750.550.750.751.00170.80180.60190.60200.650.900.850.900.700.800.801.000.700.750.700.600.900.800.801.000.750.900.850.750.850.850.750.751.000.700.750.800.700.700.800.800.800.750.700.500.650.650.600.600.750.800.700.900.800.700.800.850.700.700.750.550.600.600.550.700.500.700.700.700.700.650.600.600.650.650.600.500.550.700.600.600.600.600.600.650.550.750.700.600.450.550.600.650.550.450.650.650.550.50210.700.700.600.750.65220.550.650.550.700.50230.800.700.700.750.55240.750.650.750.800.600.600.600.650.800.600.700.700.550.550.600.650.550.750.650.600.600.650.700.500.600.700.550.650.700.750.550.550.750.600.650.800.601.000.801.000.800.701.000.750.750.651.000.500.450.600.50250.700.600.700.750.650.60260.600.600.700.550.650.60270.700.800.800.750.650.60280.650.650.750.700.700.450.700.650.700.500.650.600.650.550.700.700.750.800.700.800.800.651.000.650.750.700.650.650.850.850.600.751.000.700.700.550.700.600.800.700.850.700.651.000.750.650.600.750.550.850.750.900.750.700.951.000.600.700.700.600.650.700.600.900.800.850.800.750.900.950.500.500.500.500.450.600.500.700.800.750.600.650.800.750.600.800.700.700.650.800.600.800.700.750.800.650.800.750.650.550.650.650.600.650.550.750.650.700.650.600.750.70马铃薯不同品种(系)遗传多样性的ISSR分析

3433

ISSRAnalysisonGeneticDiversityofDifferentVarieties(Lines)inSolanumtuberosumL.

290.500.500.400.550.550.500.500.650.600.500.600.600.500.600.750.600.600.700.800.550.700.850.600.650.700.600.600.551.00300.700.700.600.750.650.500.700.750.700.500.600.700.700.700.750.800.600.700.800.650.800.750.700.750.700.600.800.650.801.00注:1~30:见表3Note:1~30:Seetable3434

分子植物育种

MolecularPlantBreeding

图430份马铃薯品种(系)的UPGMA聚类分析注:1~30:见表3

Figure4Dendrogramfor30potatovarieties(strains)basedonUPGMAanalysisNote:1~30:Seetable

琼脂糖凝胶电泳进行检测后置于冰箱中备用。3.3引物筛选及ISSR-PCR扩增反应

ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布

的引物序列设计，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

(1)扩增反应体系(25μL)：PremixTaqTM12.5μL，ddH2O10.5μL，引物1μL，模板DNA1μL。

(2)扩增反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸2min，共45个循环；72℃延伸10min。

(3)电泳检测：取扩增产物5μL，用1×TAE配制的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为80V，电泳时间40~60min。凝胶用EB(溴化乙锭)染色20min，照相并保存图像。3.4数据分析

根据凝胶电泳结果显示，对获得的清晰、重复性

图5马铃薯脱毒试管苗

Figure5Virus-freetubepotatoplantlets

好的条带进行统计记录。

(1)计算多态性条带比率(Percentageofpolymor-phicbands,记作P)：P＝(K/N)×100%，其中K表示多态条带数，N表示扩增出的总条带数。

(2)将成像的条带按有无分别赋值1和0，转换为数值矩阵，然后用NTSYS2.1软件中的DICE法计算遗传相似系数，UPGMA法进行聚类分析，绘制树状聚类图。

作者贡献

赵永秀是本实验执行人，完成材料的搜集、

保存、DNA的提取，论文初稿的写作；高茜参与材料的扩繁、引物筛选和多态性分析和论文初稿的写作；孙

表3供试验的30份马铃薯品种(系)Table3The30testedpotatovarieties(strains)编号品种(系)编号品种(系)编号品种(系)No.Variety(strain)No.Variety(strain)No.Variety(strain)

1Shepody13

中心2422

黑美人2冀张薯5号Zhongxin24HeimeirenJizhangshuNo.514小红眼23

ND3DisreeXiaohongyan24

菲律宾薯4红玫瑰15

克新1号FeilvbinshuHongmeiguiKexinNo.125红美人5乌盟85116春薯1号HongmeirenWumeng851ChunshuNo.126庄薯3号6紫花白17SnowdenZhuangshuNo.3Zihuabai澳引227粉吹雪7Favorita18Aoyin2Fenchuixue8Monana19兴佳2号28中薯7号9AtlanticXingjiaNo.2ZhongshuNo.710NDR－520彩薯29陇薯3号11

乌盟601CaishuLongshuNo.3Wumeng60121红眼圈30Burbank

12

Houma

Hongyanquan

马铃薯不同品种(系)遗传多样性的ISSR分析

3435

ISSRAnalysisonGeneticDiversityofDifferentVarieties(Lines)inSolanumtuberosumL.

张瑞霞负责植物材料的淑英、吴玉仙参与数据分析，

繁殖，郝文胜是项目负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

马铃薯品种的核型及ISSR分析,硕士学位论文,内蒙古农业大学,导师:于卓,pp.39-41)

LiuS.Y.,YuZ.,MengM.L.,MaY.H.,LiuY.J.,GanL.,Zhang

Z.Q.,andLiC.Q.,2010,ISSRanalysison6colorpotatova-rieties,HuabeiNongxuebao(ActaAgriculturaeBoreali-Sinica),25(5):117-120(刘思泱,于卓,蒙美莲,马艳红,刘宇杰,甘霖,张自强,李长青,2010,6个彩色马铃薯品种的ISSR分析,华北农学报,25(5):117-120)

致谢

本研究由农业良种补贴及良法推广项目(2130-

106)和内蒙古大学本科毕业论文设计经费共同资助。TianD.C.,ZhuH.B.,GuoJ.F.,andHuangJ.T.,2010,Geneticdi-

参考文献

ChenZ.G.,ZengX.W.,ZhangT.,DengH.C.,andSuH.K.,2009,

ISSRmarkersidentificationofintroducedpotatovarieties,Zhongzi(Seed),28(1):83-85(陈兆贵,曾秀文,张涛,邓汉超,苏鸿坤,2009,惠州引种马铃薯品种的ISSR分子鉴定,种子,28(1):83-85)

DiH.,ChenY.L.,andJinL.P.,2006,Geneticdiversityanalysis

ofChinesemainpotatocultivarsbyRAPDandAFLPmak-ers,ZuowuXuebao(ActaAgronomicaSinica),32(6):9-904(邸宏,陈伊里,金黎平,2006,RAPD和AFLP标记分析中国马铃薯主要品种的遗传多样性,作物学报,32(6):9-904)

HeH.W.,LiL.S.,TanG.N.,HeH.Y.,HeX.M.,WangH.,and

TangZ.P.,2014,Geneticdiversityanalysisofearlyandmid-dlematuritypotatovarieties(strains)usingISSRmarkers,NanfangNongyeXuebao(JournalofSouthernAgriculture),45(3):352-357(何海旺,李丽淑,谭冠宁,何虎翼,何新民,王晖,唐洲萍,2014,中早熟马铃薯品种(系)遗传多样性ISSR分析,南方农业学报,45(3):352-357)

LiuS.Y.,2010,KaryotypeandISSRanalysison6colorpotato

varieties,ThesisforM.S.,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Supervisor:YuZ.,pp.39-41(刘思泱,2010,6个彩色

versityanalysisbasedonpotatoISSR,ZhongguoMalingshu

(ChinesePotatoJournal),24(1):1-5(田大翠,朱宏波,郭建夫,黄建堂,2010,马铃薯遗传多样性的ISSR分析,中国马铃薯,24(1):1-5)

WangJ.B.,2002,ISSRmarkersandtheirappilicationsinplant

genetics,Yichuan(Hereditas),24(5):613-616(王建波,2002,ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的作用,遗传,24(5):613-616)

YinL.Q.,PengY.Q.,FuS.H.,YangJ.,ChenT.,HuangM.,Yu

Q.,WeiX.Y.,andNiuY.Z.,2016,GeneticdiversityandDNAfingerprintofpigmentedpotato(SolanumtuberosumL.)basedonISSRmarkers,Xi'nanNongyeXuebao(South-westChinaJournalofAgriculturalSciences),29(1):20-25(殷丽琴,彭云强,付绍红,杨进,陈涛,黄敏,余勤,韦献雅,牛应泽,2016,基于ISSR标记的彩色马铃薯遗传多样性分析及指纹图谱构建,西南农业学报,29(1):20-25)ZhangZ.Q.,LiuY.J.,YuZ.,MengM.L.,FanM.S.,ZhouY.X.,

GanL.,andLiC.Q.,2010,ISSRsystemoptimizationandgeneticdiversityanalysison7potatovarieties,NeimengguNongyeDaxueXuebao(JoumalofInnerMongoliaAgricul-turalUniversity),31(3):95-99(张自强,刘宇杰,于卓,蒙美莲,樊明寿,周亚星,甘霖,李长青,2010,马铃薯ISSR体系优化及其品种间遗传差异分析,内蒙古农业大学学报,31(3):95-99)