２ ０ １ ２年２月 蚪碑学院擎稚 Ｆｅｂ．２０ｌ ２ 第１卷第１期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｅｎｇｂｕ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｖｏ１．１．Ｎｏ．１ 富硒酵母选育及无机硒生物转化发酵条件研究 刘培丽 ，王大雁 ，朱秀明 ，水晓燕 （１．合肥学院基础实验与实践教学中心，安徽合肥２３００２２； ２．安徽省思达新材料科技有限公司，安徽合肥２３００４１； ３．合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥２３００２２） 摘要：对啤酒酵母进行ＤＥＳ诱变，抗性平板的初筛和复筛，获得富硒能力较强的酵母菌株，利用正交试验进行发 酵条件优化，研究富硒酵母菌株的选育与富硒酵母摇瓶培养条件优化。筛选到一株富硒能力较强的酵母菌株Ｎ－５－ ｌ，其耐无机硒（ｓｅ ）最高浓度为２５Ｉｘｇ／ｍＬ。正交试验表明，影响酵母Ｎ一５－１菌株硒含量的因素是：加硒量＞接种 量＞培养时间＞装液量。富硒酵母摇瓶培养的优化条件为：酵母培养液中加硒（ｓｅ ）终浓度为２５ｍｇ／Ｌ，接种量为 １０％，培养时间为４８ｈ，装液量为５０ｍＬ／２５０ｍＬ，酵母发酵物中硒含量最高可达２４５４￣ｇ／ｇ。通过富硒酵母菌株的选 育与摇瓶阶段培养优化条件的研究，为富硒酵母的工业化生产提供了较高富硒能力的发酵菌株和基础试验数据。 关键词：无机硒；富硒酵母；诱变；生物转化；正交试验 中图分类号：ＴＱ９２６．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：（２０１２）叭一００１５～０５ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔｓ ＬＩＵ Ｐｅｉ．１ｉ ，ＷＡＮＧ Ｄａ—ｙａｎ ，ＺＨＵ Ｘｉｕ—ｍｉｎｇ ，ＳＨＵＩ Ｘｉａｏ．ｙａｎ （１．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｅｆｅｉ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｆｅｉ，２３００２２，Ａｎｈｕｉ； ２．Ａｎｈｕｉ Ｓｔａｒ Ｎｅｗ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｈｅｆｅｉ，２３００４１，Ａｎｈｕｉ； ３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｆｅｉ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｆｅｉ，２３００２２，Ａｎｈｕｉ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｈｅｓｉｓ，ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｓｅｌｅｎｉｕｍ—ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｙｅａｓｔ．Ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ＤＥＳ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ｆｉｒｓｔ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ ｓｃｒｅｅｎ ｆｒｏｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｌａｔｅｓ，ｏｂｔａｉｎｅｄ ａ ｒｉｃｈ ｓｅ．ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｈａｋｅ ｌｆａｓｋ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ａ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ Ｌ９（３ ），ｇｉｖｉｎｇ ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｙｅａｓｔ．Ｓｅｌｅｎｉｕｍ—ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ Ｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓｅｌｅｎｉｕｍ（Ｓｅ ）ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ２５ Ｉｘｇ／ｍＬ．Ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ Ｎ－５—１， ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｅｒｅ ａｓ ｂｅｌｌｏｗ：ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ａｄｄｅｄ ｓｅｌｅｎｉｕｍ＞ｉｎｏｃｕｌｕｍ＞ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ＞ｍｅｄｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｂｅｌｌｏｗ：ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅＵｉｕｍ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａ２ＳｅＯ３（Ｓｅ ）ｗａｓ ２５ｍｇ／Ｌ，１０％ｉｎｏｃｕｌｕｍ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ４８ｈ，ｍｅｄｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ ５０ｍＬ／２５０ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ ｗａｓ ２４５４ １．￣ｇ／ｇ．Ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｏｔａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ．Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ｂｙ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｔａｇｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｙｅａｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓｅｌｅｎｉｕｍ；ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｙｅａｓｔ；ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｏ￣ｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ 收稿日期：２０１１—１１—１０ 作者简介：刘培丽（１９６５一），女，上海人，实验师。 １６ 刘培丽等 富硒酵母选育及无机硒生物转化发酵条件研究 硒作为人体的必需微量元素，对人体有重要的 生理功能。无机硒和有机硒都可以作为硒源来预防 和治疗人体的硒缺乏，但无机硒毒性大，吸收率低， 不适宜作为一种有效的硒的补充来源。酵母细胞培 养在含硒的培养基中，经过一系列生化过程将无机 硒转化到有机大分子上，形成具有较高生物活性和 较低毒性的有机硒 Ｊ。富硒酵母可以作为一种安 全的硒源，是一种非常理想的功能性食品原料，具有 广阔的市场应用前景 ｊ。本研究通过化学剂诱变 筛选到一株富硒能力较强的Ｎ－５．１酵母菌株，对其 富硒发酵条件进行了优化研究，利用硒与３，３’．二 氨基联苯胺（ＤＡＢ）反应比色法建立了富硒酵母中 硒含量的定量测定方法，具有一定的工业化应用前 景 １材料和方法 １．１材料 １．１．１ 菌种 本研究室保藏的啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ— ｖｉｓｉａｅ）。 １．１．２培养基 ＹＥＰＤ培养基（ｇ／１００ｍＬ）：葡萄糖２，酵母膏１， 蛋白胨２，琼脂２。自然ｐＨ。 １．１．３仪器 ７２１分光光度计：上海博迅实业有限公司医疗 设备厂； 净化工作台：ＳＷ－ＣＪ－１Ｇ型，上海博迅实业有限 公司医疗设备厂； 立式压力蒸气灭菌锅：ＹＸＱ．ＬＳ－５０ＳＩＩ型，上海 博迅实业有限公司医疗设备厂； 数显不锈钢电热培养箱：ＸＰＸＯ０８２ＭＢＥ型，上 海博迅实业有限公司医疗设备厂； 台式高速离心机：ＴＤＬ一５－Ａ型，５０００ｒ／ｍｉｎ，上海 博迅实业有限公司医疗设备厂； 电子天平：德国赛多利斯股份有限公司； 恒温振荡器：ＴＨＺ．８２Ａ型，国华企业； 快速混匀器：ＳＫ．１型，常州国华电器有限公司。 １．１．４试剂 亚硒酸钠（Ｎａ２ＳｅＯ３）；硫酸二乙酯（ＤＥＳ）；ＤＬ－ 乙硫氨酸；葡萄糖；酵母膏；蛋白胨；硫代硫酸钠；磷 酸二氢钾；氢氧化钠；盐酸；甲苯；甲酸；；双氧 水；Ｌ－胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ．２Ｎａ）；３，３一二氨基联 苯胺（ＤＡＢ）。以上均为分析纯。 １．２方法 １．２．１ ＤＥＳ诱变和亚硒酸钠抗性平板筛选 １．２．１．１ ＤＥＳ诱变 移取培养至对数期的酵母培养液５ｍＬ到１５ｍＬ 离心管中，５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，去离子水洗涤２ 次，添加５ｍＬ已灭菌的葡萄糖缓冲液制成菌悬液， 混匀后加入终体积为０．８％的ＤＥＳ诱变剂，放入转 速为１８０ｒ／ｍｉｎ的摇床中震荡培养８ｍｉｎ，培养温度 ３０％。在上述菌悬液中移入终体积为０．６％的ＤＬ． 乙硫氨酸终止反应。去离子水洗涤２次，再加入 ５ｍＬ ＹＥＰＤ培养基培养过夜。离心收集菌体，去离 子水洗２次 。 １．２．１．２亚硒酸钠抗性平板筛选与摇瓶培养富硒 酵母 将上述洗涤后的菌体进行１０倍稀释，浓度分别 为１０～一１０～。将每一个浓度的菌液分别涂布于 亚硒酸钠抗性平板上，培养４８ｈ进行筛选。观察平 板上菌落的生长状态，菌落形态及颜色。 将经诱变获得的菌种按其稀释浓度分别命名为 Ｎ．１，Ｎ一２，…，Ｎ．８。通过亚硒酸钠抗性平板的筛选， 获得了２株富硒能力较强、单菌落形式出现的酵母 菌株Ｎ－５－１和Ｎ一５－２，分别进行菌种保藏备用（见“１． ２．２．５富硒酵母的保藏方法”）。 分别取上述２株富硒酵母菌株在不同的亚硒酸 钠浓度下（１５、２Ｏ、２５、３０、３５、４０ｐｐｍ）进行摇瓶培养， 培养４８ｈ后观察菌液颜色变化，分别测定ＯＤ值。 离心分离菌体、水洗、干燥至恒重后称量干重。比较 菌株Ｎ－５—１和Ｎ．５，２在不同加硒量条件下酵母细胞 的生长量。 １．２．２ 富硒酵母培养方法、生长曲线与菌种保藏 １．２．２．１斜面培养 挑取一环富硒酵母原种于斜面培养基中，培养 温度３０℃，培养时间４８ｈ。 １．２．２．２平板培养 挑取菌体置于装有蒸馏水和玻璃珠的三角瓶 中，振荡打散菌体，然后吸取２ｍＬ菌液置于平板培 养基上，涂布器涂布均匀，待菌液干后将平板培养基 倒置放入恒温培养箱中３０％，培养４８ｈ。待菌落长 出后，挑取单个菌落进行斜面培养。 １．２．２．３摇瓶培养 挑取一环斜面菌种于种子培养基，３Ｏ℃振荡培 养１６ｈ，作为种子菌种，以１０％的接种量接种到摇瓶 中，装液量５０ｍＬ／２５０ｍＬ，培养一定时间后加入一定 浓度的亚硒酸钠，３０℃摇瓶振荡培养４８ｈ。酵母培 养液离心收集菌体，去离子水洗３次，烘干至恒重， 定量测定酵母细胞中硒含量。 １．２．２．４生长曲线测定 蚌埠学院学报２０１２年２月 第１．卷 第１期（总第１期） 将斜面保存的Ｎ－５．１富硒酵母接人种子培养基 中，装液量５０ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶，培养基初始ｐＨ为 ４．０，置于３０℃，２００￣ｍｉｎ摇床上培养，在培养过程 中分别在４ｈ，８ｈ，１６ｈ，２４ｈ，３２ｈ，４０ｈ，４８ｈ，５６ｈ，６４ｈ， ７２ｈ，８０ｈ取样，５０００￣ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集酵母菌 体，蒸馏水洗涤３次，６５ｃＩ＝烘干至恒重获得干酵母， 称量 Ｊ。绘制富硒酵母生长曲线。 １７ 高压蒸气１２１℃，灭菌２０ｍｉｎ。待冷却后无菌操作， 将离心分离后的富硒酵母Ｎ．５－１菌株和Ｎ一５－２菌株 分别加入到灭过菌的甘油中，摇匀，做好标记后放人 冰箱中，一７０％低温冷冻保存。 １．２．３正交试验 设计摇瓶培养阶段酵母的正交试验因素水平编 码表。选取加硒量、接种量、培养时间和装液量４个 因素，采用Ｌ。（３ ）进行正交优化试验。设计如表１ 所示。 １．２．２．５富硒酵母的保藏方法 用移液器将甘油加入到１ｍＬ的ＥＰ管中，密封， 表１酵母正交试验Ｌ （３ ）因素水平编码表 摇床转速１５０￣ｍｉｎ，培养温度２８％，分２次添 加亚硒酸钠，分别在摇瓶培养后第８ｈ时和第１３ｈ时 加人。 １．２．４硒含量的测 ］ 取甲苯层滤液于１ｅｍ比色皿中，在波长４２０ｎｍ处测 定吸光度。以标准硒工作液浓度为横坐标，吸光度 为纵坐标来绘制硒标准曲线。 １．２．４．４样品的测定 １．２．４．１消化液的选择 选择４组富硒酵母的消化体系（体积比），试验 证明，Ａ消化体系对富硒酵母的消化作用最佳。 Ａ．双氧水：高氯酸：硫酸＝３：３：１； Ｂ．高氯酸：硫酸＝３：１； 精确量取经消化预处理的富硒酵母消化液和等 量的空白消化液，分别于１２５ｍＬ分液漏斗，加水适 量，用５％ＮａＯＨ溶液调ｐＨ至中性，加入２ｍｏ￣Ｌ甲 酸溶液３ｍＬ，然后加水至３５ｍＬ，摇匀，各加０．５％ ＤＡＢ溶液５ｍＬ，摇匀，置暗处反应３０ｍｉｎ，用５％ Ｃ．：高氯酸：硫酸＝３：２：１； Ｄ．双氧水：硫酸＝１：ｌ ＮａＯＨ溶液调至中性，加入甲苯１０ｍＬ，震摇萃取 ｌｒａｉｎ，静置分层。取甲苯层滤液于ｉｅｍ比色皿中， 在波长４２０ｎｍ处测定吸光度，与标准曲线对照并计 算供试品中硒含量。 １．２．４．２样品消化 分别称取１ｇ干燥至恒重的富硒酵母Ｎ一５—１和 Ｎ－５—２，分别于１５０ｍＬ的烧杯中，加少量的水湿润样 品，加适量的消化液，摇匀，待气泡平息后，置通风橱 内的电炉上消化至终点（即加热至发烟，待溶液变 为淡黄色后，再加热２—３ｍｉｎ，此时溶液变为元色）。 ２结果与分析 ２．１ 亚硒酸钠抗性平板筛选富硒酵母抗性菌株 经稀释后进行抗性平板筛选后的酵母诱变菌株 Ｎ．１～Ｎ．８经４８ｈ培养后观察到的结果如下： Ｎ．１～Ｎ＿４菌落较多且密集，难以分离出单菌 落。Ｎ＿５有两个单菌落出现，分别命名为Ｎ－５—１和 Ｎ－５＿２。Ｎ－６一Ｎ一８无菌落出现。进一步将Ｎ６—１与 Ｎ一５．２分离纯化，并作为种子进行研究与保藏。 ２株富硒酵母生长经比较研究后发现，不同亚 冷却后用１ｍＬ水冲洗烧杯壁，加２ｍＬ ５％的ＥＤＴＡ－ ２Ｎａ，摇匀，用氢氧化钠溶液调ｐＨ至中性，定容至 ｌＯ０ｍＬ，待做萃取。同时做一个空白对照（消化方法 同富硒酵母）。 １．２．４．３硒（Ｓｅ ）标准曲线的制作 精确量取标准硒（Ｓｅ ）工作液０ｍＬ、２．０ｍＬ、 ４．０ｍＬ、６．０ｍＬ、８．０ｍＬ、１０．０ｍＬ，按顺序加到６个洁 净的分液漏斗（１２５ｍＬ）中，添加适量的去离子水，用 ５％氢氧化钠溶液调ｐＨ至中性，加２ｍｏ￣Ｌ甲酸溶 液３ｍＬ，然后加水至３５ｍＬ（此时溶液的ｐＨ在２～３ 硒酸钠浓度下，Ｎ－５—１菌株在亚硒酸钠浓度范围内 （６０ｐｐｍ～１６０ｐｐｍ），菌落颜色由淡黄色到微红色， 差异不明显，几乎无单质硒析出。而Ｎ一５－２菌株在 亚硒酸钠浓度范围内（６０ｐｐｍ一１６０ｐｐｍ），菌落颜色 逐渐加深，尤其在亚硒酸钠浓度分别为１４０ｐｐｍ和 １６０ｐｐｍ时，其菌落颜色几乎呈深红色，表明有大量 左右），再各加５ｍＬ ０．５％的ＤＡＢ，摇匀后置暗处反 应３０ｒａｉｎ。反应完成后，用５％氢氧化钠溶液调ｐＨ 至中性，加入甲苯１０ｍＬ，振荡萃取２ｒａｉｎ，静置分层， 单质硒析出。此结果说明Ｎ－５．１菌株转化无机硒的 １８ 刘培丽等 富硒酵母选育及无机硒生物转化发酵条件研究 结果显示，Ｎ．５—１菌株的耐无机硒（Ｓｅ ）最高浓度 为２５１￣ｇ／ｍＬ。 １ ２ ３能力强于Ｎ－５－２菌株。将Ｎ一５．１和Ｎ－５．２培养液离 心分离在于燥至恒重后，获得菌体干重见表２。表２ 表２不同亚硒酸钠浓度下２株富硒酵母生长量 ２．２富硒酵母生长曲线 硒（Ｓｅ ）标准曲线线性方程为Ｙ＝０．１０２６ｘ一 ０．０９７３，线性相关系数Ｒ ＝０．９９９１。硒含量的计算 Ｎ－５－１酵母的生长曲线如图１所示。 从 ［ ．ｘ－一 ± ：Ｑ ２ 厶 Ｔ ● ！ ． １７３ ’ ‘一０１０２６ 。 ．２ ３其中， 为酵母的硒含量；Ｙ为吸光度Ａ值；Ｗ 为实验取量； 为稀释倍数。 ２．４酵母正交试验结果与讨论 喇 簿 剖 表３结果显示，影响酵母硒含量的因素是：加硒 ●●量＞接种量＞培养时间＞装液量。结合表２分析， 培养时间 图１ Ｎ－５—１酵母生长曲线 酵母在试验编号７（Ａ Ｂ ｃ Ｄ ）的培养条件时，也即 酵母细胞生物转化无机硒可优化的培养条件为（即 最佳富硒条件）：酵母发酵液添加Ｎａ：ＳｅＯ，终浓度 为２５ｍｇ／Ｌ，接种量为１０％，培养时间为４８ｈ，装液量 ０ ２ 由图１可以看出，富硒酵母Ｎ－５．１延迟期大约 为５０ｍＬ／２５０ｍＬ，酵母细胞硒含量出现最大值 ２４５４￣ｇ／ｇ；酵母在试验编号３（Ａ１Ｂ。ｃ Ｄ１）的培养条 件下，也即酵母细胞生长量可优化的培养条件为：酵 ８ｈ左右，延迟期较短，这是因为富硒酵母在经高浓 度的亚硒酸钠驯化后对其产生了较高的抗性，因而 再转入含较低浓度的亚硒酸钠的培养基中培养时， 能较快地适应环境，使得延滞期大大缩短，８—６４ｈ 为对数生长期，稳定期大约在６４～７２ｈ，之后进入衰 亡期。 母发酵液添加无机硒Ｎａ ＳｅＯ。终浓度为１５ｍｇ／Ｌ，接 ２５０ｍＬ，酵母生长量出现最大值１１．８４ｇ／Ｌ。 叭∞玛种量为２０％，培养时间为４２ｈ，装液量为５０ｍＬ／ ２．３硒（Ｓｅ¨）标准曲线 表３酵母正交试验结果 试验号 Ａ加硒量 ／ｍｇ・Ｌ Ｂ接种量 ／％ Ｃ培养时间／ｈ Ｄ装液量 ／ｍＬ・２５０ｍＬ～ 硒含量 ／ｌａ，ｇ・ｇ一 细胞干重 ／ｇ．Ｌ一 ７．６０ ８．００ ｌ１．８４ ７．９２ ８．８Ｏ ７．８Ｏ ６．４４ ８．０４ ９．７２ 蚌埠学院学报２０１２年２月 第１卷 第１期（总第１期） １９ 啤酒酵母经化学诱变剂ＤＥＳ诱变后，筛选出２ 株富硒能力较强的Ｎ．５ １酵母菌株和Ｎ．５．２酵母菌 株，经过比较研究后发现Ｎ－５－１菌株比Ｎ－５－２菌株 版社，１９８４：１５—２０． ［２］Ｗｏｆｆｆｒａｍ Ｓ，Ａｎｌｉｋｅｒ Ｅ，Ｓｃｈａｒｒｅｒ Ｅ．Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｓｅｌｅｎａｔｅ ａｎｄ ｓｅｌｅｎｉｔｅ ｂｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ 具有更高的生长量和较强的无机硒转化能力。通过 正交试验，影响酵母Ｎ．５－１菌株硒含量的因素是：加 ｐｉｇ，ｓｈｅｅｐ ａｎｄ ｒａｔ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ［Ｊ］．Ｂｉｌ．Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍ．Ｒｅｓ．， １９８６（１）：２９３—３０６． 硒量＞接种量＞培养时间＞装液量。酵母富硒可优 化的摇瓶培养条件为：酵母培养液中加硒（Ｓｅ ）终 浓度为２５ｍｇ／Ｌ，接种量为１０％，培养时间为４８ｈ，装 液量为５０ｍＬ／２５０ｍＬ，所测酵母发酵物中硒含量最 高可达２４５４１ｘｇ／ｇ。通过富硒酵母菌株的选育与摇 ［３］蒋守群．有机硒在动物营养上的研究与应用［Ｊ］．饲料 工业，２００５，２６（２０）：４３—４５． ［４］朱昌雄，马爱民，刘代武，等．富硒酵母菌株的选育［Ｊ］． 酿酒科技，２００７（１）：４６—４９． ［５］刘曲滨，刘康，包惠燕，等．富硒酵母中硒含量的测定 ［Ｊ］．广州食品工业科技，２０００，１６（３）：３３—３５． 瓶阶段培养条件的研究，为富硒酵母的工业化生产 提供了较高富硒能力的发酵菌株和基础试验数据。 ［６］李明春，张丽，邢来君．富硒酵母的筛选［Ｊ］．天津轻工 业学院学报，２０００（３）：２５—２８． 参考文献： ［１］徐辉碧．生物微量元素一硒［Ｍ］．武汉：华中理工大学出 （上接第１４页）中焦糖色用量在２５％一５０％之间的 油食醋中的应用［Ｊ］．中国调味品，１９９７（２）：１４－２２． 有１．１３％，低于２５％的有２２．６７％；未标注“老抽” 和“生抽”的酱油中焦糖色用量大于５０％的比例为 ４．６６％，在２５％到５０％之间的比例为６．６７％，小于 ２５％的比例为５６．６７％。未标注“老抽”和“生抽” 的酱油中的焦糖色的使用情况比较复杂，是需要我 们重点监控的对象。 ［２］张国瑛．顾正彪，洪雁．焦糖色素生产及应用的进展 ［Ｊ］．食品工业科技，２００７（４）：２３２—２３８． ［３］ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆ ｏＨｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏ— ｇＹ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ４一Ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ［Ｊ］． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２２３３ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉ－ ａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ ＮＣ ２７７０９，２００７（５）：２７４． ［４］ＧＢ８８１７—２００２中华人民共和国国家标准食品添加剂 ・３建议 ４－甲基咪唑是焦糖色的特征性副产物，可以用 焦糖色（亚硫酸法、氨法、普通法）［ｓ］．北京：中国标 准出版社，２００２：１—１０． ［５］陈洁．酱油专用焦糖色的工艺研究［Ｊ］．酿造与检测， ２００９（５）：２７—２９． ４一甲基咪唑的检出量反推酱油中焦糖色的使用情 况。特别是集散农贸市场中，假冒伪劣的酱油产品 ［６］ＧＢ２７６０—２００７中华人民共和国国家标准・食品添加 层出不穷，更有甚者，使用不合格的焦糖色、蛋白水 解液和食盐水混合后冒充酿造酱油，因此，可通过对 酱油中４一甲基咪唑含量的分析，作为对市场中酱油 产品监管的依据之一。同时，建议在未来酱油产品 的标准中，增加４一甲基咪唑的含量，以规范酱 油产品中焦糖色的使用，保护广大消费者的利益。 剂卫生使用标准［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００７：１４８ —１７２． ［７］国家质量监督检验检疫总局．ＣＣＧＦ１２１．１—２００８产品 质量监督抽查实施规范・酱油［ｓ］．北京：中国标准出 版社，２００８：１—５． 参考文献： ［１］赵宝国，于瑞琪，冯裕新，等．焦糖色素的研究及其在酱
