蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析

来源：五一七教育网

Vol.7　No.2第7卷　第2期生命科学研究

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　June2003

2003年6月LifeScienceResearch

刘健平,陈国华,陈本美,周　平,唐瑶云

(中南大学湘雅医学院分析测试中心,中国湖南长沙　410078)

摘　要:从以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS2PAGE电泳为第二向进行的蛋白质组双向电泳实验中挑选了一些常见的银染色22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.关键词:固相pH梯度;蛋白质组;双向电泳中图分类号:Q5233　　　　　　　　　文献标识码:A

文章编号:100727847(2003)0220177204

AnalysisofTroublesin22DimensionalGels

ElectrophoresisofProteomicStudies

LIUJian2ping,CHENGuo2hua,CHENBen2mei,ZHOUPing,TANGYao2yun

(TheCentralTestingLab,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410078,Hunan,China)

2dimensionalgelelectrophoresisofproteomicstudieswerecollectedand

classified.Possiblereasonsfortroubleswereanalyzedandthemethodstoovercomethemwerediscussed.Keywords:immobilizedpHgradient;proteome;two2dimensionalgelelectrophoresis

(LifeScienceResearch,2003,7(2):177～180)Abstract:Somefailureimagesin2

　　蛋白质组学是新近形成的生命科学研究热点,一般包括双向电泳分离技术和质谱检测鉴定技术两大部分.双向电泳分离技术所涉及的环节较多,一般包括蛋白质提取、等电聚焦、蛋白质转移、SDS2PAGE电泳、凝胶银染色等环节,每一环节又包括若干步骤,如蛋白质提取环节又可以细分为裂解液组成配方、裂解方式选择、抑制蛋白酶降解活性、使蛋白质溶解、去折叠、变性及解聚合、除去核酸、离子、脂类、多糖类、酚类等杂质步骤.由此可见双向电泳分离技术是一个受多种因素控制的技术,其中任何一种因素没有理想地控制好都有可能引起整个实验的失败,而且这种失败往往要等到双向电泳图谱银染色显影之后才能看到,此时不但已耗费大量人工和试剂,而且

Ξ收稿日期:2002212229;修回日期:2003202225

有时还难以迅速和准确地找到失误的真正原因.我们从实际工作中挑选了一些典型的22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.

1　取图方法

根据蛋白质斑点的有或无、斑点是否规则清晰、斑点是否有横向或纵向条纹、斑点在整张图谱中的分布是否扭曲或倾斜或团聚或离散、凝胶的背景色是否清晰均匀、凝胶图谱中非斑点处是否有横向或纵向的条纹及条纹出现的位置等标准,从大量22DE凝胶银染色结果图谱中挑选出一些典型的失误图谱作为分析研究的对象.

作者简介:刘健平(19712),男,湖南溆浦人,中南大学助理研究员,硕士,主要从事蛋白质组学和蛋白质化学研究,Tel:+862073124805312,E2mail:hnljp888@hotmail.com

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2　失误图谱

图1～10中,从左到右为第一向等电聚焦阳

性到阴性的方向,从上到下为第二向SDS2PAGE

电泳高分子量蛋白质到低分子量蛋白质的方向.

图1　仅图谱下端能看到少量斑点

Fig.1　Onlylittlespotsarevisibleinlowpartofthegel

图4　图谱上端非斑点处有较多垂直方向条纹或团块

Fig.4　VerticalstreakΠsmearoragglomerateinthegel

图2　部分斑点在垂直方向向某条纵轴倾斜

Fig.2　Spotsconcentratetoaverticalaxislineofgel

图5　有黑色颗粒和手印等杂质,看不到斑点

Fig.5　Spotsareinvisible,contaminatedbyblackparticlesandfingerprint

图3　部分斑点在局部区域团聚

Fig.3　Somespotsaggregateandcrowdinthegel

图6　图谱上端非斑点处有水平方向的浓条纹

Fig.6　Horizontalstripesacrossthewholeuppartofgel

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图7　在垂直方向单个斑点变成双点Fig.7　Spotsverticallydoubled图9　图谱在非斑点处有垂直方向的“∧”型纹、空白间隙或斑点不规则扭曲

Fig.9　Vertical“∧”streakorgaporspotsdistortionacrossthewholegel

图8　斑点在水平方向有拖迹条纹

Fig.8　Spotsstreakhorizontally

图10　部分斑点有垂直方向拖迹条纹,背景色很深

Fig.10　Somespotsstreakverticallyandhighbackground

3　原因分析及讨论

对于图1,可能的原因及解决办法:1)蛋白质从第一向转移到第二向时不完全,应该在第二向电泳开始时按单片凝胶10mA先跑30min的低电流电泳,然后再升高到单片凝胶20mA电泳至溴酚蓝迁移到底部为止;2)平衡时间不充分,蛋白质被重新氧化,应该延长胶条的平衡时间至15min,平衡液需要新鲜配制;3)蛋白质在水化时没有充分进入胶条,应该新鲜配制并且添加足够体积的水化液进入第一向电泳槽中,如在18cm规格的第一向电泳槽中应该添加350μl的水化液,另外还可提高IPG缓冲液的浓度,如由0.5%提高到

2%及延长等电聚焦的时间;4)蛋白质在高重力场

下(>10g)长时间离心会使高分子量的蛋白质非

特异性地丢失,应该避免对样品的这种离心处理.

对于图2,可能的原因及解决办法:1)凝胶聚合太快或聚合时发生泄露引起左下角局部区域不均匀,应该将凝胶混合均匀再灌胶并且检查是否泄漏后再封一层薄水层;2)第二向凝胶顶端不平整引起胶条与它接触不好,使得琼脂糖固定液渗入两者之间的接触面空隙,或气泡或杂质渗入,应该平整好第二向凝胶顶端,放置胶条时要排除气泡或杂质.

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　　对于图3,可能的原因及解决办法:1)凝胶浓

度不合适,或聚合不均匀,应该调整分离胶的浓度并正确灌制凝胶;2)电泳时电流过大,电泳过程太快,应该降低电泳的电流至单片凝胶20mA;3)琼脂糖固定液浓度过高,或杂质阻止高分子蛋白质顺利进入第二向凝胶,应该使用新鲜配制0.5%的琼脂糖固定液,或除去杂质.

对于图4,可能的原因的解决办法:1)蛋白质样品中含有较多的核酸,它们增加样品的粘性并造成非斑点处的背景拖迹,甚至还可能封闭凝胶孔,应该使用DNaseI和RNAaseA酶降解它们;2)核苷酸、磷脂、代谢物等内源性的小离子杂质常常造成胶条阳性端等电聚焦不理想,应该用TCAΠ丙酮法、透析等方法除去它们;3)两性电解质被银染上色,应该使用IPG缓冲液作为两性电解质,必要时可将其浓度降低至0.5%.

对于图5,可能的原因及解决办法:1)银染步骤中银试剂失效,应该使用新鲜配制的银溶液染色,要戴干净的塑料手套并使用新鲜过滤的双蒸水;2)敏化、显影等步骤中的试剂含较多杂质,应该使用高纯度的试剂.

对于图6,可能的原因及解决办法:1)第二向电泳缓冲液中含有杂质,或电泳装置不干净,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使用干净的玻璃板和电泳槽电泳;2)琼脂糖固定液含有杂质,应该使用新鲜配制的琼脂糖固定液.

对于图7,可能的原因及解决办法:1)胶条在第二向凝胶顶端没有正确放置,应该以胶条的塑料保护膜面紧贴长玻璃板的方式放置胶条入两玻璃板的空隙内;2)水化液体积不够,或水化液在等电聚焦槽内分布不均匀使得胶条或胶条的局部区域水化不充分,应该确保足够的体积的水化液在整个第一向等电聚焦槽内均匀铺开,排除胶条胶面与槽面之间的气泡.

对于图8,可能的原因及解决办法:1)等电聚焦不充分,应该延长等电聚焦的时间,可以使用3500V或8000V的高电压以便取得良好的等电聚

焦效果;2)过度等电聚焦(>10Vh)能够造成电

渗和蛋白质飘移,应该减少等电聚焦的时间;3)蛋白质样品中含有离子,或离子型去污剂如SDS,应该将水化液的离子浓度控制在10mmolΠL以内,可以采用透析、层析、TCA沉淀等方法脱去离子,或使非离子型去污剂的浓度至少8倍于SDS的浓度;4)离子等杂质影响等电聚焦,尤其在酸性端如此,应该除去样品中的杂质.

对于图9,可能的原因及解决办法:1)对水平SDS2PAGE而言,凝胶上面的水滴,或下面的气泡会引起热传导不均匀,应该使凝胶稍干燥或排除气泡后再电泳;2)气泡或水化液中的杂质存在于胶条与第二向凝胶顶端的接触面之间,应该排除气泡或杂质;3)电泳时热传导不均匀,或温度过高,应该调节电泳时恒温水循环仪温度为16℃;4)蛋白质没有充分溶解,应该增加裂解液中尿素或CHAPS等试剂的含量使蛋白质尽可能完全地、稳定地溶解.

对于图10,可能的原因及解决办法:1)银染色中显色时间太长导致凝胶背景底色过深,应该减少银染和显色时间;2)第二向电泳缓冲液配制不当,SDS含量不足,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使SDS含量达到0.1%;3)对水平SDS2PAGE而言发生了电渗现象,应该在平衡液中添加甘油和尿素.

蛋白质组双向电泳分离技术是受多种因素影响的多步骤实验,只有处理好样品的裂解、蛋白质的提取、溶解和变性、杂质的去除、胶条的水化、蛋白质的等电聚焦、胶条的平衡、SDS2PAGE、凝胶的银染色显影等步骤,才有可能获得较高重现性、可比性和稳定性的22DE图谱,蛋白质组双向电泳分离技术的实验条件才算成功建立.):参考文献(References

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