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ROS

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基因组学与应用生物学,2015年,第34卷,第l期,第12—16页 Genomics and Applied Biology,2015,Vo1.34,No.1,1三二 鱼 研究论文 Research Article ROSMMPs对子宫内膜崩解的作用 刘书言, 武斌z陈西华,王树芳 刘建兵 , 王介东 贺斌 徐祥波 1广西医科大学基础医学院,南宁,530021;2山东大学附属济南市中心医院生殖医学科,济南,250031;3国家人口计生委科学技术研究所生殖 生理室,北京,100081;4北京协和医学院研宄生院,北京,100730 通讯作者,s ̄iu0098@126.com;xiangboxuhappy@126.com 摘要子宫内膜周期性的剥脱是高等灵长类动物特有的生理现象。活性氧(ROS)在女性生殖系统的生理 过程具有重要的作用。本研究的目的是试图弄清ROS是否对子宫内膜的剥脱起作用以及通过金属基 质蛋白酶(MMPs)起作用。本研究采用雌性C57小鼠去势,序惯性地给予雌孕激素模拟增殖期和分泌期,花 生油注射至宫腔以人工诱导蜕膜化,将孕酮皮埋管移除以造成孕酮的撤退,建立小鼠月经样模型,并在孕 酮撤退前1 h、3 h和7 h给予抗氧化剂NAC消除ROS;利用大体和组织形态学方法检测子宫内膜的状态, 显示350mg/kgNAC能够抑制子宫内膜的剥脱;利用Western方法检测ROS在月经发生过程中对MMP一2、 MMP一9和MMP一13的作用,显示NAC处理组与对照组比,NAC能够抑制MMP一9在24 h的表达,也能 够抑制MMP一13在16 h和24 h的表达,但并不能抑制MMP一2在16 h和24 h的表达。因此,ROS在小鼠月经 样模型中通过MMPs特别是MMP一9和MMP一13对子宫内膜的崩解起至关重要的作用。 关键词月经,子宫内膜,剥脱,活性氧,金属基质蛋白酶 RO S Regulated MMPs to the Endometrial Breakdown Liu Shuyan XuXiangbo 1 School of Pre-clinical Sciences,Guangxi Medical University,Nanning,530021;2 Reproductive medicine,Jinan Central Hospital Afilifated to Wu Bin Chen Xihua Wang Shufang 3,4 Liu Jianbin 3,4 Wang Jiedong He Bin Shandong University,Jinan,25003 1;3 Reproductive Physiology Laboratory,National Research Institute for Family Planning,Beijing,1 0008 1; 4 Graduate School,Peking Union Medical College,Beijing,100730 Corresponding authors,syliu0098@126.com;xiangboxuhappy@126.corn DOI:10.13417/j.gab.034.000012 Abstract Endometrial breakdown is an unique physiological character to primate.Reactive oxygen species(ROS) plays an important role to female reproduction.Our aims did attempt to understand whether the ROS regulates matrix metalloproteinase(MMP)on endometrial breakdown in mouse menstrual—like mode1.In this study,female C57 mice were ovariectomized and treated with the hormone to mimic the proliferation and secretory period.Atier oil was iniected into uterus 1umina1.49 h later.P4 explant was removed to mimic the P4 withdrawal to build the mouse menstrual—like mode1.The dose ofNAC(350 mgCkg)was administrated to mice at一1 h(P4 withdrawal was regarded as 0 h),3 h,7 h and 11 h to exclave the ROS.The uterus was assayed by morphological and histomorphological method,which showed that 350 mg/kg NAC inhibits the endometrial breakdown.Further,the eff-ect of ROS on the expression of MMP一2.^压M【P一9 and A M【P一1 3 by Westem blot assay in the uterus were measured,which showed that NAC inhibits MⅣ 一9 protein at 24 h.ⅣIMP一1 3 at 1 6 h and 24 h.but does not inhibit MMP一2 at 1 6 h and 24 h.Therefore we concluded that ROS may regulate the MMPs.especially MMP一9 and MMP一1 3。on the endometrial breakdown. Keywords Menstruation,Endometrium,Breakdown,Reactive oxygen species(ROS),Matrix metalloproteinase (MMPs) 基金项目:本研究由广西壮族自治区教育厅高校科研项目(YB2Ol4079)和广西医科大学青年科学基金项同资助 (GXMUYSF201318) ̄ ROSMMPs对子宫内膜崩解的作用 ROS Regulated MMPs to the Endometrial Breakdown 果相一致,即MMP一9在人的月经周期中的分泌晚期 蛋白上样到15%SDS.PAGE凝胶电泳,电泳结束后 和月经期中表达(Hampton and Salamonsen.1994)。 综上所述,ROS通过^ 将凝胶上的蛋白电转移至NC膜,以5%脱脂奶粉 s对子宫内膜剥 4 ̄C封闭过夜,其后,分别加一抗兔多抗MMP一2和 脱起着至关重要的作用。本研究将有助于理解月经 MMP一9(1:200,Beijing Biosynthesis Biotechnology B— 复杂的生理机制,子宫内膜周期性的剥脱和修复是 eijing,CHN),兔多抗MMP一13(1:250,Biovision CA, 高等灵长类动物为妊娠准备的进化特性,了解这其 USA)4 ̄C过夜孵育,同时,兔多抗B—actin(1:1 000,Bei. 中的机制也将理解妊娠机制具有重要意义。 3材料与方法 3.1动物 雌性C57小鼠(8~l2周龄)购于中国医学科学院 实验动物中心。小鼠在可控的条件下给予充足的水和 食物饲养(光照从600到1 800;温度(21±1)℃)。所有 的实验步骤均由国家人口计生委科学技术研究所动 物伦理委员会同意。 3.2小鼠月经样模型的建立 3.2.1小鼠月经样模型的建立 小鼠月经样模型的建立根据以往的研究报导进 行(Birkeda1.Hansen et a1.,1993)。具体如下,小鼠在麻 醉下行双侧卵巢切除,恢复2 W以清除体内雌激素和 孕激素,然后按图1进行操作:去势小鼠在第1天、第 2天和第3天的09:30皮下注射E2 0.37nmol;在第 4~6天不做处理;在第7天的09:30,皮下注射P4 0.16 nmol和E2 0.02 nmol,并将P4硅胶管埋植于小 鼠背部皮下;在第8天和第9天的09:30分别皮下注 射E2 0.02 nmol,在第9天的1 1:30,将20 L花生油 注射双侧子宫角以诱导蜕膜化。49 h后(即在第1 1天 的l1:30)去除P4皮埋管(记为P4撤退0 h),所有的 处理组小鼠和对照组小鼠在P4撤退的0h、8h、12h、 16 h和24 h(n:15-20只/时间点)处死,收集子宫以 进行组织形态学检测。 3.2.2抗氧化剂N一乙酰半胱氨酸(NAC)干预小鼠月 经样模型 小鼠模型按照上述方法建立,小鼠在第11天 1 1:30(孕酮撤退的1 h)将NAC(NAC,Sigma—Aldrich; 350 mg/kg溶于无菌的PBS)腹腔注射小鼠。随后孕酮 皮埋管被去除,且NAC分别在孕酮撤退的3 h、7 h和 11 h进行干预,子宫在P4撤退的16h和24h收集以 用于形态学分析以及Westernblot检测。 3.2_3 Western blot检测MMPs 组织中表达的差异将30 ̄50 mg组织提取的总 蛋白,用Bicinchoninic acid(BCA)法定量,取50 g jing Kangwei Biotechnology Beijing,CHN)0.1%TBST 液漂洗PVDF膜10min,洗3次,随后取出PVDF膜, 加入二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗 1:10 000,37℃孵育1 h,TBST洗膜后加入ECL试剂 曝光进行显影定影,并对光底片拍照。 3.2.4统计学分析 数据结果以means+_SD的方式显示,数据分析应 用ANOVA,口<0.05为差异有统计学意义。 作者贡献 刘书言负责课题设计和实验工作;陈西华、王树 芳和刘建兵负责实验工作;王介东和贺斌负责课题 指导;徐祥波负责课题总体设计和和指导。 致谢 本研宄由广西壮族自治区教育厅高校科研项目 (YB2014079) ̄广西医科大学青年科学基金项(GX- MUYSF201318)共同资助。 参考文献 Agarwal A.,Gupta S.,and Sharma R.K.,2005,Role of oxidative stress in female reproduction,Reprod.Bio1.Endocrino1..3:28 Behrman H.R.,Kodaman P.H.,Preston S.L.,and Gao S.,2001,Ox- idative stress and the ovary,Reproductive Sciences,8(S1): ¥40.¥42 Birkeda1.Hansen H.,Moore W.G.,Bodden M.K.,Windsor L…J Birkedal—Hansen B.,DeCarlo A.,and Engler J.A.,1993, Matirx metalloprotei nases:a review,Crit.Rev.Oral Bio1. 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