生物工程下游技术复习题及解答

一、名词解释

1、连续培养反应器：不断地往反应器中加入营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。在良好的控制下，罐内菌体的增殖速度可以与采出速度相同而达到稳态。

2、菌体比生长速率（μ）：单位浓度菌体在一定条件下引起的反应速率, 其值反映了培养菌体增长的能力, 受菌株及各种物理化学环境的影响. 表示为μ=dx/x.dt

3、得率系数：两种物质得失之间的计量比。Yx/s,Yp/s

4、贴壁培养: 贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.

5、蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。

6、浓差极化：指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。溶剂向膜面流动引起溶质向膜面的流动，这种流动如果与浓度梯度所驱动的溶质向本体溶液扩散的速度平衡时，在膜面附近就形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域就称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化。浓差极化是一个可逆的过程；

7、膜污染：物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。

8、排阻色谱（Size exclusion chromatography，SEC）：又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。

9、分配色谱：是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。

10、有效柱长（有效迁移距离）：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称为有效迁移距离，也称为有效柱长。

11、吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

12、切向流过滤：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。（实际是维持了Ｒc).目前几乎所有的膜固液分离都采用切向流方式

13、包含体: 存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，一级结构正确，立体结构错误，没生物学活性。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。

15、双水相萃取：利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、ＰＥＧ／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。

16、反渗透：在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中的大分子、小分子有机物及无机盐全被截留。理想的反渗透膜应被认为是无孔的，它分离的原理是溶解扩散（或毛细孔流学说）。

17、分配系数一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示

18、色谱曲线基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。

19、保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。

20、死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。

调整保留时间（tR ＇）：tR＇= tR－tM

21、容量因子k：平衡时，组分在各相中总的质量比

23、排阻色谱：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

24、亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

25、正相色谱法：亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，极性柱也称正相柱。

26、反相色谱：若流动相的极性大于固定液的极性，非极性柱也称为反相柱。

27、非线性色谱:Cm与Cs不存在线性关系的色谱.

28、吸附等温线：一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

29、全交换容量:每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量.是一个定值.

30、工作容量:每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量.是一个变值.

31、疏水性色谱:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用.高浓度

的盐条件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降.当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱.

32、径向流色谱技术：即样品和流动相沿径向流动,可从色谱柱的周围流向圆心,也可从圆心流向柱的周围.通常采用从柱的周围流向圆心的方式.

33、泳动度(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度即:U=V/E=(d/t)/(V/L)

34、变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进生

45、非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂

37、 线性色谱:样品的浓度流动相中与固定相中之间是线性关系

38、 生物过程动力学:定量地描述过程的速率以及影响过程速率的诸多因素.包括细胞生长速率、各种基质消耗的速率、代谢产物的生成速率。

39、 悬浮培养：是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程.主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等。

40、 固定化培养：利用吸附或包埋等固定化的方式将细胞在一定的空间内,然后以固定化的颗粒进行悬浮培养.该方法对贴壁性和非贴壁依赖性细胞都是适合的。

41、 膜分离技术：以半透膜为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中的其他组分，从而达到分离目的的技术。

42、 离子交换法：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法。主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。

43、肽谱：指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。

二、填空题

1、超声波破碎细胞的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关。

2、目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种: 微孔过滤(微滤)、超滤、 反渗透。

3、在生物工程下游技术领域， 色谱 和 电泳 是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。

4、在生物物质分离中，可以依据一次进样量多少，将色谱分为： 分析色谱、 半制备色谱（中等规模制备色谱）、制备色谱 和工业生产规模色谱 4大类。

5、无论是什么类型的液相或气相色谱,其色谱装置均应包括: 流动相供给、 进样、 色谱柱、 检测器 等四大部分。

6、在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法： 一种是维持流动相热力学参数不变的 等梯度洗脱法，另一种叫 梯度洗脱法。

7、径向色谱填料主要有： 离子交换树脂 和 亲和色谱填料 两种。

8、评价HPLC色谱填料性能的主要表征指标包括：

保留值，选择性，柱效率，填充柱的总空隙度和穿透性，分离度。

11、羟基磷灰石在原理上一般被认为是一种无机基质高效色谱。

请列举二种测量蛋白质含量的方法：双缩脲法，考马斯蓝法。

12、常见的无机色谱填料主要包括：多孔硅胶、可控孔径玻璃、氧化铝、氧化钛、 羟基磷灰石 以及 碳 和 石墨 等基质。

13、无机HPLC填料最常见的是以多孔大硅胶为基本材料的填料；含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃经过热处理引起相分离，生成可溶于酸的Na2O-B2O3相及不溶于酸的高硅相。将酸可溶相浸析出来后剩下的另一相就制成了可控孔径玻璃，可控孔径玻璃的主要化学成份就是SiO2。

17、根据离子交换树脂官能团的性质，将其分为（强酸型）、（弱酸型）、（强碱型）、（弱碱型） 、 （鳌合型）、（两性）及（氧化还原）等 7 类。

18． 指出三种交联葡聚糖的微载体：Cytodex1微载体；Cytodex 2微载体；Cytodex 3微载体

19．指出蛋白质复性的三种方法：稀释法，透析法，液相色谱法等

20．固液分离的主要方式包括：离心法，微孔膜过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。

21．膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜

22 色谱的保留值可以用保留时间也可以用保留体积来表示。

23．色谱的峰宽可以用半峰宽、峰底宽、标准偏差表示。

24．指出下列情况下色谱系统对容质的柱效和分配系统差的关系：

① 柱效较高，△K较大,完全分离；

② 柱效较高，△K不是很大峰较窄，基本上完全分离；

③ 柱效较低，△K较大,但分离的不好；

④ 柱效低， △K 小，分离效果更差。

25．线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形。从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、S形的色谱图是波浪形的。

27．Shephadex G100是一种凝胶排阻色谱，主要用于蛋白质的纯化。

28．DEAE-Shaphdex A25是一种离子交换层析介质。

29．CM-纤维素是一种弱阳离子交换介质。

30．离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。

一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。

31．QAE-葡聚糖是强碱阴离子交换剂，SP—是强酸阳离子交换剂。

33．蛋白质含量和纯度测定方法。含量测定:克氏定氮法，TCA比浊度法、双缩脲法、福林-酚法和紫外线法，考马斯兰法（Bradford法）。

纯度衡量:电泳法，层析法，质谱法等。一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。

34．细胞破碎法包括：机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括：液体剪切力和固体剪切力方法，液体

剪切力包括：高压匀浆法和超声破碎法；

固体剪切力包括：高速珠磨法和压榨法。

35．高压匀浆法的主要困难包括：温控和堵塞问题

26．高压匀浆法的破碎率决定于：匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数。

34．蛋白质的分子量测定：超离心法、光散射方法、凝胶过滤法、SDS-PAG电泳法。

三、判断题

3.絮凝剂须有长链的线性结构，越长越好（×）。

4.细胞壁破碎的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键（√）

6.离子交换的推动力是离子浓度差。（√）

9.凝胶过滤操作中，通常上样量越小，分辨率越高。×

16.层析过程中,有效柱长是随层析条件的变化而变化的. ∨

17.层析过程中,可以通过改变洗脱剂的浓度变化梯度改变有效柱长和最短柱长. ∨

23.HPLC填料的颗粒粒度的分布应该是越小越好的，最好是能实现颗粒的单分散。∨

28.葡聚糖凝胶排阻色谱中，上样量越大，分辨率越高。×

29.同一蛋白质在不同种类的缓冲液中，只要缓冲液的pH值相同，则30.蛋白质所带的电荷数量也相同。×

37.为了减小样品在洗脱过程的轴向扩散，可采取增大进样浓度减少进样量的方式。∨

40.动物细胞培养微戴体的密度应略大于培养基。×

42.一般讲，亲水性膜及膜材料电荷与溶质相同的膜较耐污染。∨

43.色谱过程中试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础。∨

44.色谱过程一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢。∨

47.色谱柱效高说明该色谱对物质的分离度高。×

51.分离度由色谱柱的柱效率和物质间的分配系数的差异共同决定。∨

53.在凝胶排阻层析中，流动相的速度越慢越有利于色谱分离和分析。∨

55.两性的生物大分子所带电荷的性质和数量由其等电点及溶液环境(pH值)所决定。∨56.聚丙烯酰胺浓缩胶的原理包括其pH值=6.9为甘氨酸的等电点。∨

59.样品溶解不好容易造成拖尾。∨

60.Monod常数随菌体的浓度的变化而变化。×

61.Monod常数是细胞培养过程中的一个对菌体性质的特征性常数。×

62.色谱柱效可从峰宽得到，色谱峰越宽，柱效越低，峰宽相同，柱效相同。×

63.决定柱效的因素是分配系数。×

.决定柱效的因素是容量因子。×

66.可以说“A柱子的柱效高于B柱子。×67.分配系数与柱效没有关系。×

68.容量因子与柱效有关系。∨

69.柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。∨

70.用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。∨

72.发酵反应器设计要求有尽量高的传氧系数。∨

73.生物放大器的常用控制方法是反馈调节。∨

75.动物细胞培养就操作而言，深层培养可分为批式、流加式，半连续式、连续式和灌注式5种。∨80.明胶涂覆的多孔微载体适应于一切的细胞系。∨

86.产物提纯过程包括初级分离阶段和纯化精制阶段两个阶段。∨

93．溶液pH对蛋白质在水中溶解性，荷电性及构型有很大影响。∨

94.膜分离技术中清洗过程中主要考虑膜的化学特性和污染物的特性二个因素。∨

96.气液色谱的固定液在常温下不一定为液体，但在使用温度下一定呈液体状态。∨

98.用来衡量色谱峰宽度的参数有标准偏差()、半峰宽(Y1/2)和峰底宽(Wb)三种表示法。∨

99.气相色谱中容量因子越大，保留时间越长。∨

100.离子交换色谱对于大分子和小分子的保留机理基本相同。∨

101．示差折光检测器是除紫外检测器之外应用最多的检测器，此检测器灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。∨

102.液-固吸附色谱中非线形等温吸附常引起峰的拖尾。∨

104.非线性色谱基本理论包括吸附平衡热力学、吸附平衡动力学和色谱基本特料平衡方程。∨

106.在非线性色谱中，峰高增加的速率随浓度的增加而逐渐降低，因而峰高不能作为定量分析的指标。×

109.凝胶过滤中进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的。∨

110.膨化的凝胶可以直接高温烘干。×

112.一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。∨

113.离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。∨

115.Superdax是葡聚糖与交联琼脂糖的结合，而Superose是珠状琼脂糖经两次交联。∨

116.反相色谱以硅胶基质的键合相填料为主，特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。∨

117.不同填料的化学结构是通过对基质材料的化学改性而实现的。∨

118.疏水性相互作用色谱是为了适应活性生物大分子特别是蛋白质的分离而发展起来的种液相色谱方法。∨

120.作为分离材料的硅胶，其颗粒的形状与大小、孔的结构、孔径及其分布、总孔容、比表面积及机械强度等，均为重要的物理参数。∨

121.硅胶的化学修饰大致可以三种不同的方式进行，即整体修饰、通过表面硅羟基的化学修饰以及涂层法。∨

122.物理吸附水的去除是硅胶衍生反应中不可或缺的一步。∨

123.硅胶一般有耐受高压力,耐压能力随孔径及孔度而下降。∨

129.泳动度(迁移率)只取决于带电质点的性质。×

131.丙烯酰胺浓度和交联剂浓度决定胶的物理状态及分子筛的孔径的大小。∨

132.电泳中缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量,同时还影响蛋白质分子间的相互作用。∨

138.选择具高选择的填料可以克服径向色谱直径短的缺点,发挥径向色谱柱速度快,处理量大的优点。∨

四．单选题

12. 在理想状态下,下列哪种色谱对二种物质的分离度可以随柱长的延长而无限增加:

(A) 凝胶排阻色谱;(B) 离子交换色谱;

(C) 亲和色谱;(D) 分配色谱;

17. 聚合物型基质材料中，下列哪种是应用最为广泛的：

（A）交联聚苯乙烯树脂；

18．对于硅胶而言，其表面的硅羟基是进行化学修饰的基础，硅胶表面的硅羟基的主要存在形式是：

（A） 硅三羟基； （B） 硅二羟基；

（C）邻位硅羟基；（D）单硅羟基；

19．不经过化学修饰或改性的硅胶本身可以做为：

（A）正相色谱填料；（B）反相色谱填料；

（C）离子交换色谱填料；（D）亲和色谱填料；

29、目前细胞培养产物的收率很低，不及总蛋白的1%，主要原因不包括：

(A) 血清蛋白质的污染

(B) 细胞表达产物浓度低

(C) 产物在培养条件下不稳定

(D)分离技术

30、生化分离用离子交换剂的特点不包括

（A）粒径小，分布均匀

(B)疏水性

(C)生物相容性

(D)适当的电荷密度

31、微囊化使一下哪个受到消极影响

（A）抗剪切力

（B）细胞生长环境

（C）传质效率

（D）产物浓度

33、表征膜对某一大分子溶质的截留能力的是：。

A. 孔道特征 B. 水通量 C. 截留率σ D. 截留分子量

35、无机盐对蛋白质盐析效果，下列选项错误的是。

A. 柠檬酸盐＞磷酸盐＞硫酸盐 B. 硫酸盐＞醋酸盐＞盐酸盐

C. 盐酸盐＜盐＜硫氰酸盐 D. 盐酸盐＞盐＞硫氰酸盐

38、可测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的电泳技术有。

A. CE B. HPLC C. IEF D. SDS-PAGE

39、可用于了解蛋白组成，蛋白分子和等电点的电泳技术是。

A. 凝胶电泳 B. 等电点聚焦电泳 C. 毛细管电泳 D. 双向电泳

41、强酸性阳离子交换树脂的功能基团是。

A. 一SO3H B. 一PO(OH)2 C. －COOH D. －OH

42、与离子交换树脂的总交换容量有关的是。

A. 树脂种类 B. 溶液的pH C. 溶液的溶质浓度 D. 溶液中溶质的电荷数

45、在采用离子交换技术时，对弱酸性树脂pH应选择。

A. pH＞pK产物＞pK树脂 B. pK产物＞pH＞pK树脂

C. pK产物＞pK树脂＞pH D. pK树脂＞pH＞pK物质

47、在低浓度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，其吸附等温表现为。

A. 凸形 B. 凹形 C. S形 D. 阶梯形

49、当溶质浓度增加时，分子在固相表面逐渐吸附，趋于稳定后被吸附的分子又吸附其他分子，其吸附等温表现为。

A. 凸形 B. 凹形 C. 正S形 D. 反S形

50、被吸附的分子在吸附剂表面随液相中溶质浓度的增加会发生吸附取向的变化或吸附状态的改变，其吸附等温表现为。

A. 凸形 B. 凹形 C. S形 D. 阶梯形

51、在应用吸附分离技术时，根据经验，吸附剂孔径等于溶质分子直径的多少较适合。

A. 1倍 B. 2倍 C. 4倍 D. 6倍

52、检测蛋白质是否变异的常用方法有。

A．肽谱 B. HPLC C.等电聚焦 D.毛细管电泳 E.以上都对

53、下列蛋白质含量测定法，哪项灵敏度最高。

A．凯氏定氮法 B. 考马斯亮蓝法 C.Folin－酚试剂法 D.紫外吸收法

55、在有机相中添加下列哪项，将在表面活性剂总浓度不变的情况下可以提高反胶团尺寸，增大反胶团萃取的操作pH范围。

A. 助溶剂 B. 带溶剂 C. 稀释剂 D. 助表面活性剂

56、双水相萃取技术与生物转化过程结合，下列哪项不是其优势。

A. 消除产物反馈抑制 B. 细胞（酶）可循环使用

C. 生产能力、收率及分离效率高 D. 传质面积增大

57、关于温度对双水相萃取的影响，下列说法正确的是。

A. 在临界点附近，对蛋白质分配系数影响较小

B. 远离临界点时，对蛋白质分配系数影响较大

C. 影响双水相黏度和密度，从而影响蛋白质的分配系数

D. 大规模的双水相萃取操作需在冷却状态下进行

58、下列哪个组合不可能形成双水相系统。

A. PEG/ Dex B. PEG/Inorganic salt C. 乙醇/硫酸盐 D. 磷酸盐/硫酸盐

59、在溶剂萃取中，在水相中加入无机盐，下述哪项不是其目的。

A. 由于盐析作用，使产物在水中的溶解度下降，而有利于转入有机相

B. 增加两相间密度差，减少有机溶剂和水之间的互溶度

C. 减轻乳化现象，使其容易分离

D. 沉淀杂质

60、萃取剂对目标产物和杂质的分离能力可用下列哪项来表征。

A. 分离因素（β） B. 萃取因素 C. 分配系数 D. 活度系数

65、在GC和LC中, 影响柱选择性的不同的因素是

A.固定相的种类；B. 柱温； C．流动相的种类；D．分配比。

66、在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？

A．组分与流动相；B．组分与固定相；C．组分与流动相和固定相；D．组分与组分。

68、在液相色谱中，梯度洗脱最宜于分离：

A．几何异构体；B．沸点相近，官能团相同的试样；

C．沸点相差大的试样；D．分配比变化范围宽的试样。

五、简答题

1. 高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的？

从气相色谱的高效、高速和高灵敏度得到启发，采用5-10μm微粒固定相以提高柱效， 用高压泵加快液体流动相的流速；

设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱的缺点，从而达到高效、快速、灵敏。

2. 简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谱带扩宽，提高柱效？

因素:涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。

减少填料颗粒直径，减小填料孔穴深度，提高装填的均匀性，

采用低黏度溶剂作流动相，流速尽可能低，

同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。

3. 色谱柱A柱长为15cm，载体粒度为5μm。另一B柱长为30cm，载体粒度为10μm。两柱的柱效相等吗？

∵l=L/dp ∴lA=15/0.0005=30000 lB= 30/0.0010=30000

A柱的折合柱长为30000，B柱的折合柱长也为30000，表明组分在两根柱内从柱入口到出口都经过30000

个载体颗粒，两柱的柱效相等。

4. 为什么体积排阻色谱中任何组分的分配系数必须符合0≤K≤1？如果K>1说明什么问题?

因为组分的分配系数为K=Cs/Cm,Cs与Cm分别为组分在固定相和流动相中的浓度,当分子直径大于孔径时,此时Cm=0,∴K=0。当分子直径小于固定相孔径时,组分向空隙内流动相扩散,达到平衡时,一半组分在空隙内,一半组分在空隙外,此时K=1,若分子直径介于以上两种极限情况之间,K一定介于0与1之间,可见体积排阻色谱中,任何组分的分配系数为0≤K≤1,如果K>1说明此时的分离方式已不是纯粹的体积排阻色谱,其分离过程受到其他作用力(如吸附)的支配.

5.HPLC操作中，流动相为什么要脱气？常用的脱气方法有拿几种？

害处：（1）气泡进入检测器，引起光吸收或电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测；

（2）溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应；

（3）溶解气体还会引起某些样品的氧化降解，对分离和分析结果带来误差。

脱气法:（1）加热脱气法（2）抽吸脱气法；

（3）吹氦脱气法；（4）超声波振荡脱气法。

6. 生物工程下游技术的基本步骤。

（1）建立分析方法：

①生物测定方法；②理化测定方法；③理化方法与生物学方法结合测定；

（2）选择提取材料；

（3）选择提取方法；

（4）分离纯化方法的探索；

(5）均一性的鉴定。

7、生物工程下游技术按生产过程划分几个阶段？各阶段的任务是什么？

①发酵液预处理、固液分离、细胞破碎：

除去发酵液中的不溶性固形物杂质和分离菌体细胞；

分离胞内产物，收集细胞后进行细胞的破碎和细胞碎片分离。

②提取：除去与产物性质差异较大的杂质

③浓缩：主要去除水分，提高产物浓度

④纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。

⑤成品化：根据质量标准和产品剂型制作产品。

8. 发酵液预处理的目的是什么，如何选择发酵液预处理过程？

①去除部分杂质

②改善理化性质，有利于固液分离

③使产物转入便于后处理的一相中

如何选择发酵液预处理过程：

①胞外产物，发酵通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；

②胞内产物，先通过离心或过滤收集细胞并洗涤，然后细胞经破碎或整体细胞萃取使目标产物释放，转入液相，再进行细胞碎片分离。

③细胞本身，通过离心或过滤获得细胞，然后对细胞进行洗涤、干燥。

9. 超临界CO2破碎细胞技术的原理是什么？

超临界流体CO2在高压条件下渗透到细胞内，突然降压后，CO2变成气体，使细胞内外压力差增加，细胞急剧膨胀发生破裂。另外CO2对脂质有萃取作用，细胞碎片较大。

10. 在溶剂萃取时，为什么要进行破坏乳化？

乳化是水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。

有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带：①发酵废液（萃余液）中夹带有机溶剂（萃取液）微滴，使目标产物受到损失；②有机溶剂（萃取液）中夹带发酵液（萃余液），给后处理操作带来困难。

产生乳化有时即使采用离心机也往往不能将两相分离完全，所以必须破坏乳化。

11. 超临界萃取的原理是什么？

溶质在超临界流体中的溶解度，与其密度有关，密度越大，溶解度越大。在临界点附近，微小的压力增加或

温度下降，则超临界流体的密度大幅度增加，对溶质的溶解度将大幅度增加，有利于溶质的萃取。而在临界点附近，微小的压力下降或温度上升，则超临界流体的密度大幅度减少，对溶质的溶解度将大幅减少，有利于溶质的分离和溶剂的回收。

12. 膜的浓差极化对生产有何影响？减少浓差极化有哪些措施？

浓差极化：在膜过滤时，随溶剂不断透过膜，大分子溶质被带到膜表面，但不能透过，就被截留在膜的表面上，造成膜面浓度升高，产生膜面到主体溶液之间的浓度梯度，这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体溶液中的现象称为浓差极化。

影响：①提高渗透压，降低水通量；②降低膜的截留率；③产生结垢现象，造成物理阻塞，使膜逐渐失去透水能力。

措施：对处理液搅动、振动、错流以及加快液流速度等。

13. 有机溶剂沉淀法原理是什么？

加入有机溶剂于蛋白质溶液中可产生多种效应，这些效应结合起来，使蛋白质沉淀。

①有机溶剂，使溶液介电常数降低，蛋白质、核酸、多糖等带溶质间静电引力增大，从而相互吸引、聚集而沉淀。

②有机溶剂减小水的极性，使两性溶质在溶液中的溶解度降低。

③由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，从而降低了亲水溶质表面水化层的厚度和溶质的亲水性，导致脱水凝聚。

④极性有机溶剂破坏溶质的某种键（如氢键），使其空间结构发生变形，使原来包在内部的疏水基团结合形成

疏水层。

14. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

由于聚丙烯酰胺凝胶是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。

因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度学（电荷效应），还取决于蛋白质的大小（分子量）和形状（分子筛效应）。

15. 简述SDS－PAGE电泳测定未知蛋白分子量的方法。

以不同的标准分子量蛋白MARK，与未知蛋白样品一同进行SDS－ PAGE电泳。染色后分别计算未知蛋白、标准分子量蛋白MARK的迁移率，然后根据标准分子量蛋白MARK迁移率与其分子量的对数值作图，可得一标准曲线并拟合方程。将未知蛋白迁移率代入拟合方程，求出未知蛋白的分子量。

16. 影响离子交换能力和选择性因素有哪些？

离子交换能力和选择性的好坏集中反映在离子交换常数K上，K值越大，说明离子交换能力和选择性越好。影响K值的因素有：

（1）被交换离子的水化半径和化合价：树脂对水化半径小的离子和化合价高的离子选择性好。

（2）溶液浓度：树脂对离子交换吸附的选择性，在稀溶液中比较大，而在浓溶液中选择性较小。

（3）溶液的pH：pH必须满足使树脂和生化物质都呈离子状态。

（4）交联度：对凝胶树脂，交联度小，树脂的孔径大，选择性降低。

（5）有机溶剂：当有机溶剂存在时，常会使树脂对有机离子的选择性降低，而容易吸附无机离子。因此进行交换吸附时，料液中不应存在有机溶剂。但在解吸附（洗脱）时，可采用有机溶剂来提高解吸的收率。

18. 色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理

（1）按溶质分子与固定相相互作用的机理不同，色谱分离可大致分成如下 5 大类：吸附色谱分离，分配色谱，离子交换色谱，凝胶色谱，亲和色谱。（2）根据固定相的形状不同，色谱分离技术可分为柱色谱分离、纸上色谱分离、薄层色谱 分离。

（3）根据流动相的物态不同，色谱分离技术可分为气相色谱分离、液相色谱分离、超临 界色谱分离。

（4）根据操作压力不同，色谱分离技术不同可分为低压色谱分离、中压色谱分离、高压色谱分离。

19. 在吸附分离技术中，如何选择洗脱剂？

（1）洗脱剂：选择与吸附剂溶解度参数相近的试剂作为洗脱剂；

洗脱剂对被吸附物有较大的溶解度；

（2）洗脱剂为水溶液时，需考虑洗脱pH：对于弱酸性物质，在偏酸性条件吸附，洗脱应为碱性水溶液；弱碱性物质则相反。

（3）如果吸附在高浓度盐溶液中，则洗脱可仅用水。

（4）易挥发性物质，可用热水或蒸汽解吸。

20. 蛋白质含量/浓度测定方法有哪些？各有什么特点？

蛋白质含量（浓度）测定，是生化检测中的基本内容，常见的测定方法有：凯氏定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。考马斯亮蓝法（Bradford法）。

1）凯氏定氮 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时

8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

2）双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低 1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似

3）紫外吸收法 较为灵敏 50～100μg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；

4）Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 ～5μg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化

5）考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高 1～5μg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；

21. （重组）蛋白质量检测方法有哪些？

（重组）蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标包括：

1）重组蛋白的鉴别（序列）

2）重组蛋白的纯度（杂质的类型）

3）重组蛋白的活性（检测方法）

4）重组蛋白的安全性

5）重组蛋白的稳定性

6）重组蛋白的一致性（构象与构型）

具体的检测项目和方法有：

1）产品是否含内毒素 家兔热原法

2）蛋白质是否变异 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳

3）甲硫氨酸是否被甲酰化 肽谱、质谱、HPLC、Edman分析

4）蛋白质是否变性、聚合、脱氨基 SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析

5）配体是否脱落 SDS-PAGE、免疫分析

6）氨基酸是否发生取代 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳

7）产品是否被细菌、病毒、支原体等污染 微生物学检测

22、生物技术产品的分离提取工艺应考虑那些因素？

某一具体产品的分离提取工艺与下列情况有关： (1)是胞内产物还是胞外产物；

(2)原料中产物和主要杂质浓度；(3)产物和主要杂质的物理化学特性及差异；

(4)产品用途和质量标准；(5)产品的市场价格；(6)废液的处理方法等。

23、“清洁生产”应该包括哪三方面的内容？

(1)清洁生产工艺技术和过程：含先进的无废少废技术、高效的装备和完善的管理；

(2)清洁产品：使用中和使用后对人体和环境无害；

(3)清洁能源：包括常规能源清洁利用、采用节能技术、再生能源和新能源的开发利用。

六、 综合题

1． 试述非线性色谱的概念及其特点?

非线性色谱: 流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)不呈线性关系的色谱.分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱

非线性色谱的特点

①. 样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化;

②. 峰形的不对称性:不是高斯正态分布的;

③. 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降.

2． 什么叫吸附等温线?研究吸附等温线有什么意义?

附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

研究吸附等温线可以提供得到以下方面的信息：

①. 预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状；

②. 为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件；

③. 反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。

④. 建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。

3． 做为优良的凝色谱介质应该具备什么基本特点?

①. 介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生任何作用；

②. 应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少特异性吸附，提高蛋白质的收率；

③. 介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。

④. 凝胶珠粒大小均匀；

⑤. 介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒。

4． 做为优良的HPLC填料应具备什么基本的物理化学特性?

在物理结构上的要求:

① 合适的颗粒大小及较窄的粒度分布;

② 一定的颗粒强度;

③ 一定的孔径大小和孔径分布,避免复杂的微孔结构;

④ 一定的溶胀及收缩水平;

优良的HPLC填料目前的主要发展方向:

① 颗粒单分散的填料;

② 贯穿性超大孔结构的填料;

③ 小颗粒的非多孔填料;

▪ 在化学结构上的要求:填料的化学结构,特别是颗粒表面和内孔表面的化学结构(如连接在基质上的官能基团或链段)是影响色谱热力学行为(保留值,选择性等)的主要因素

① 特定的选择性;

② 良好的化学稳定性;

③ 避免不可逆吸附;

5． 试述羟基磷灰石做为一种有广阔发展前途的色谱填料的主要特点.

羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)是一种弱阳离子或弱阴离子交换层析材料.其材料本是骨骼和牙齿等生物硬组织的主要无机成分,与生物组织有特异性的亲和力和相容性.其优点是:能精确地分离,纯化结构上只有微小差别的生物大分子.

做为一种优良的色谱填料,羟基磷灰石具有以下特点:

①. 高机械强度:可以耐受15MPa以上压力,陶瓷HAP可以耐受几十MPa的压力.

②. 高柱效:球形HAP颗粒大小,形状及孔隙大小均适合HPLC的要求.其颗粒及孔径小,有比较高的柱效.

③. 化学和热稳定性:是磷酸钙盐中最稳定的,在中性和碱性不相中非常稳定,溶解度很低,热稳定性很高,可采用高温制备方法生产.

④. 低的非可逆性吸附:HAP有非常低的非可逆性吸附.

⑤. 表面修饰性:HAP表面比较容易进行各种化学修饰.

⑥. 总之HAP:高选择性,高键合容量,低的非可逆吸附,良好的化学和热稳定性。

6． 与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：

①. 在进样后可很快的除去变性剂；

②. 色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；

③. 在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；

④. 便于回收变性剂，降低废水处理成本。

7． 在对包含体蛋白质进行增溶和复性的过程中为什么要加入还原剂,同时为什么还必须加入金属螯合剂?常用的还原剂有哪些?在复性后为什么要加入氧化剂?常用的氧化剂有哪些?（见21）

8． 什么叫双水相萃取?在双水相萃取中为什么要尽量将细胞碎片集中在下相?可以采取什么可能的措施在使细胞碎片尽量集中在下相的同时,使目标蛋白质尽可能集中在上相?

9． 什么是径向色谱?径向色谱应用于生物物质分离有什么优点?

采用径向流技术的色谱，即样品和流动相沿径向流动，可以从色谱柱的周围流向圆心，也可以从圆心流向柱的周围。通常采用从柱的周围流向圆心的方式。

优点：

可以在较小的柱床层高度时使用较大的流动相速度；

在较高流动相速度时，反压降低；

可以线性地增加样品处理量，样品可以在完全相同的色谱条件下直接放大。

10． 利用微载体进行动物细胞培养的优点有哪些？

微载体培养的优点:

① 表面积/体积比大;

② 微载体悬浮于培养基中,细胞生长环境均一,便于监测和控制;

③ 培养基利用率高;

④ 采样重演性好;

⑤ 收获过程不复杂;

⑥ 放大较容易;

⑦ 劳动强度小,占用空间小.

11． 为什么动物细胞培养要用血清培养基？血清培养基使用有何缺点？

答：1）因为动物细胞正常生长所需要的一些必要成份均存在于血清中，而且这些成份的组成及其含量至今没有被阐明，因此只能直接采用血清进行培养，而目前寻找无血清的制品代替进行培养并没有获得广泛的成功。

2）采用血清培养基有以下缺点：

① 血清是培养基成本的主要部分；血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代；

② 血清的存在是产物纯化的主要障碍；

③ 血清是病毒污染及其他未知因素影响的主要来源，增加了细胞培养产品潜在的使用危险；

④ 血清同时也有生长抑制的作用；

⑤ 血清使用使实验和生产过程标准化变得困难。

12． 试述聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）微囊化的原理：

原理是：海藻酸的水溶液以钙盐形式存在是呈凝胶状态，用螯合剂去除钙离子后又恢复溶液状态，当海藻酸钙用聚赖氨酸预先处理后，就不再被螯合剂去钙而溶解。

据此，先将动物细胞与海藻酸混合，滴入CaCL2溶液中成微珠，用聚赖氨酸处理表面，再用螯合剂处理，则

表面还是呈凝胶状态而中间成液态。

13． 影响聚赖氨酸/海藻酸微囊化的一些因素：

答：1）半透膜的孔径大小是关键，由PLL的分子量所决定；

2）海藻酸的纯度、黏度及甘露糖醛酸/古罗糖醛酸比例都会影响微囊化的形成及机械性能；

3）动物细胞的存活率与微囊化过程的时间及温度pH、渗透压等有关；

14． 高压匀浆法的作用机理：

作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的

15． 化学渗透法破碎细胞的原理及其优缺点。

答：作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。

优点（相对机械破碎）：

对产物释出有一定的选择性；

细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；

核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。

缺陷：

时间长，效率低；

化学试剂有毒；

通用性差。

16． 酶溶法破细胞的原理、优缺点是什么？

机理：就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。

优点：

一定的选择性；

细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程

缺点：（只能用于实验室）

产物抑制造成效率低下；

溶酶价格高；

通用性差， 不易确定最佳条件；

17． 微波加热法胞的原理、优缺点是什么？

机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液

态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。

优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。

缺陷：

一般只适合对热稳定物质的分离；

被处理的物料要具有良好的吸水性；

不适于富含淀粉和树胶等的天然植物。

18． 包含体蛋白溶解的主要方式是什么？在溶解过程中为什么要加入还原剂

答：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。

19． 包涵体蛋白质含有二个以上二硫键应该如何处理？为什么要在复性完成后再加入氧化剂？

包涵体蛋白首先用高溶度的变性剂促进蛋白质的溶解，为了曾溶往往在溶液中加入一定量的还原剂打开蛋白质的二硫键，如DTT、GSH或巯基乙醇（β-ME）等，同时也加入金属螯合剂，络合高价金属例子，防止其与-SH结合。

复性时，加入氧化剂可以引发变性蛋白质形成正确的S-S键而复性，并与前面加入的还原剂形成氧化还原对，能促进非正确折叠的二硫键快速交换，达到正确配对与折叠，促进正确配对的产率。

20． 根据流体各组分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，过滤分离微米级的细胞、细胞碎片和生物大分子的过程，叫微孔膜过滤。

▪ 优点：

① 容易做到封闭式操作，不受环境污染

② 设备投资少，操作安全；

③ 加工量可大可小，十分方便；

④ 有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。

▪ 缺点：

① 技术难以掌握，影响因素多；

② 稳定性和重复性不好；

③ 膜堵塞问题是最难以解决的问题

21． 双水相萃取的一般原则：

▪ 一般的原则是将碎片分配在下层(调节ＰＥＧ和无机盐浓度比例，可以控制细胞碎片在上下层间的分配)其好处有：

① 核酸等大部分杂质一般处于下相，可以一并除去；

② 下相是无机盐富集相，作为废弃物成本低些；

③ 蛋白质保持于上相的ＰＥＧ层有利于其活性的保持；

④ 碎片在下相有利于离心机的连续分离；

22． 试述包含体复性的基本过程,复性过程错误发生的主要原因是什么?举例分析主要的复性方法的优缺点,为什么LC复性是最好的?

包含体复性的基本过程：

① 分离包含体：第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离

② 洗涤：包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解

③ 溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。去污剂可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。

复性过程错误发生的主要原因是：在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争。

复性方法的优点：透析、稀释和超滤复性法，这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度。

复性方法的缺点：复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大。

LC复性是最好的原因：与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：

① 在进样后可很快的除去变性剂；

② 色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在

脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；

③ 在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和

纯化同时进行；

④ 便于回收变性剂，降低废水处理成本。

23． 写 出斯托克斯公式,分析其基本意义.从该公式分析离心的主要条件.

斯托克斯公式(Stokes)：Uc=d2(ρs-ρL)rω2/18μ。

其意义是：

① 密度差(ρs-ρL)越大，离心沉降速度越快；

② 在密度差(ρs-ρL)存在下，固体颗粒尺寸越大，越容易离心；

③ 液体黏度μ越大，越不容易离心；

④ 离心力（rω2 ）的大小对固液分离很有影响，要增大离心力来提高分离效率。

离心的主要条件是：转速和时间。

24． 从达西公式分析利用膜进行固液分离要注意的问题,其目前存在的主要困难是什么?

达西公式：V=ΔP/[μ(Rc+Rm)] 。从式中可见，在ΔP恒定下，滤饼厚度的增加会降低过滤速度。因此宝座过滤速度不变的一个办法是设法阻止滤饼的生成，或者维持滤饼的厚度不增加。

其目前存在的主要困难是：膜堵塞问题。

25． 双水相萃取的概念?为什么要进行双水相萃取?双水相萃取的主要操作原则是什么?有何注意事项?

双水相萃取：利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、ＰＥＧ／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。

进行双水相萃取的原因：

 核酸等大部分杂质一般处于下相，可以一并除去；

 下相是无机盐富集相，作为废弃物成本低些；

 蛋白质保持于上相的ＰＥＧ层有利于其活性的保持；

 碎片在下相有利于离心机的连续分离。

双水相萃取的主要操作原则是：将碎片分配在下层(调节ＰＥＧ和无机盐浓度比例，可以控制细胞碎片在上下层间的分配)。

做的时候要考虑以下几点：ＰＥＧ浓度；ＰＥＧ分子量；盐和pH值。

26． 膜分离技术的优点？

①. 处理效率高，设备易于放大；

②. 可在室温或低温下操作，适宜于热敏感物质分离；

③. 化学与机械强度最小，减少失活；

④. 无相变，省能；

⑤. 选择性好，可在分离、浓缩的同时达到部分纯化的目的；

⑥. 选择合适膜与操作参数，可得到较高的回收率；

⑦. 系统可密闭循环，防止外来污染；

⑧. 不外加化学物，透过液可循环使用，降低了成本，并减少了对环境的污染。

27． 膜污染与浓差极化的主要区别？

膜污染与浓差极化的主要区别是浓差极化是一个可逆的过程，膜污染是一个不可逆的现象。应该说，一旦料液与膜接触，膜污染即开始；也就是说，由于溶质与膜之间相互作用产生吸附，开始改变膜特性。操作运行开始

后，由于浓度差极化产生，尤其在低流速、高溶质浓度情况下，在膜面到达或超过溶质饱和溶解度时，便有凝胶层形成，导致膜的透量不以来于所加压力，一起膜透过通量的急剧降低，在这种情况下运行的膜，使用后必须清晰，以恢复其性能。

28． 超滤亲和纯化：将超滤技术优点和亲和技术优点结合起来的一种分离技术。具有分离纯度高和易于大规模工业化的优点。

①. 其原理是：

②. 亲和结合，利用与待分离物质有亲和力的大分子物质亲和结合待分离物质；

③. 洗涤：选择合适的超滤膜进行透滤；

④. 解离：使大分子亲和复合物分离，选用合适膜进行超滤使待分离物质透过膜并进一步浓缩；

⑤. 再生：使大分子亲和基再生并进入下一轮超滤亲和过程。

29． 非线性色谱的特点：

①. 样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化;

②. 峰形的不对称性:不是高斯正态分布的;

③. 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降.

30． 凝胶色谱介质应具备的条件有哪些？

介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生任何作用；

应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少非特异性吸附，提高蛋白质的收率；

介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。

凝胶珠粒大小均匀；均一系数?颗粒粗细?

介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒。

31． 填料性能评价

物化性质指标:

① 颗粒大小及其分布(dp);

② 比表面积S(m2/g);

③ 骨架密度ρg(g/ml);

④ 溶剂吸收量Sγ(ml/g);

⑤ 溶胀因子f;

⑥ 比孔体积Vp(ml/g);

⑦ 孔度Ψ

▪ 填料的色谱性能表征:

① 保留值:

▪ 三个概念:保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K`)

② 选择性:相邻二物质保留时间之比,与固定相、流动相及温度有关。

③ 柱效率：理论塔板数（N），或理论塔板高度（H）表示。

④ 填充柱的总空隙度和穿透性：

⑤ 分离度（R）：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰底宽度一半之和的比值。

32． 表面硅羟基的化学修饰：

1）通过氯化反应：可以将硅羟基转化成硅氯基，硅氯基性质活泼可以与各种化合物反应而引入相应的基团。这种方法引入的基团是单分子层的，具有较好的传质能力和色谱性能，但成本较高。

2）通过氯硅烷与硅羟基的反应：

▪ 通过氯硅烷可以将各种烷基链引入硅胶表面。氯硅烷包括一氯代型，二氯代型和三氯代型等。

3）通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应：

▪ 烷氧基硅烷与硅胶进行缩合反应，使硅胶表面带上环氧基或氨基等基团，在此基础上可以很方便地进一步进行反应或修饰。这一健合反应可以在水相，也可以有机介质中进行。

33． HAP的色谱机理

是一种弱离子交换色谱,实验结果表明其对DNA,多肽,蛋白质的分离机理合乎离子交换色谱的机理.

▪ HAP的色谱机理可能包括以下几个方面:

1. 存在两种不同的吸附晶面;

2. 两种不同晶面吸附方式不同;

3. 两种不同吸附点的起因:Ca2+离子和PO43-

4. 色谱历程为离子间的竞争过程

34． 泳动度(迁移率)取决于带电质点的性质，即质点所带的净电荷的量、质点的大小和质点的形状。

同时决定于：电泳介质阻力、溶液黏度.

35． Monod公式的物理意义，Monod常数的意义，公式的适应范围？

Monod方程的物理意义：

① 其中μm 为最大比生长速率；Ks为Monod常数（饱和常数），取决于环境条件（pH,温度，离子强度等）；

② 基本上反映了比生长速率与底物浓度的关系，由Ks值又反映了比生长速率与环境的关系；

③ 不适合于比较黏稠的发酵液，有不同模型表示；

④ 有二个以上性底物，有抑制性底物或抑制性产物存在时有不同的模型表示；

Monod常数，等于比生长速率达到最大比生长速度一半时的基质浓度。

对于高密度培养，特别是丝状菌培养过程，应用该公式常得到满意的结果。

36． 生物反应器中基质包括什么？基质的消耗主要用于什么方面？如何用模型公式表示？

生物反应器中基质包括：碳源、氮源、氧及其他营养源。

基质消耗包括：细胞生长（合成新细胞）、细胞维持生命、合成次级代谢产物。

用数学模型公式：ds/dt = - 1/Yx/s * dx/dt - mxx - 1/Yp/s * dp/dt表示。

37． 写出细胞培养过程的产物生成的模型公式。

产物生成的模型公式：dp/dt=αdx/dt+βx

38． 动物细胞培养对生产生物工程产品,特别是功能蛋白质方面的优势？

1）同源性直接进行翻译后加工蛋白质可直接折叠成正确的构象；2）有利于产品的分离纯化，市场需求:目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。生产产品:动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台以缩短产品工艺研发的时间加快工业化进程。

45. 微囊化动物细胞及其应用

目前微囊化细胞可以在两方面应用，意识培养微囊化动物细胞以生产一些药物；二是作为药物直接用于治疗或作为筛选药物之用。

生产药物上的应用：

1. 单克隆抗体的生产

微囊化哺乳动物的主要应用是单克隆抗体的生产。微囊工艺已生产以克计的单克隆抗体。

2. 高值生化药物的生产

一些生化药物的生产，总生产率可达培养瓶生产的5倍以上。而且，产物在电泳上显示纯度明显高。

3. 干扰素的生产

通过对一些培养生产干扰素发现，细胞在微囊中生长比悬浮胖或单层培养更旺盛。

在治疗及药物筛选上的应用：

1. 人工器官

微囊化动物细胞在排除免疫反应上可能有普遍意义。人们已将某些器官的细胞微囊化并植入体内以期待能代替这些器官的功能。

2. 抗癌药物的筛选

微囊化的肿瘤细胞用于估价抗癌药物对活体的作用。人的肿瘤细胞经微囊化后注入小鼠腹腔中，服用受检的抗癌药，检测微囊化的肿瘤细胞对药物的反应，结果发现抗癌药能穿透微囊的膜作用于微囊中的肿瘤细胞，抑制和杀灭的水平与其他体外和体内测定的药效一致。

39． HPLC色谱柱的关键在于填料，填料的物理化学参数有什么要求？

▪ 在物理结构上的要求:

① 合适的颗粒大小及较窄的粒度分布;

② 一定的颗粒强度;

③ 一定的孔径大小和孔径分布,避免复杂的微孔结构;

④ 一定的溶胀及收缩水平;

▪ 目前的主要发展方向(研究热点):

① 颗粒单分散的填料;

② 贯穿性超大孔结构的填料;

③ 小颗粒的非多孔填料;

▪ 在化学结构上的要求:填料的化学结构,特别是颗粒表面和内孔表面的化学结构(如连接在基质上的官能基团或链段)是影响色谱热力学行为(保留值,选择性等)的主要因素

① 特定的选择性;

② 良好的化学稳定性;

③ 避免不可逆吸附;

不同填料的化学结构是通过对基质材料的化学改性而实现的.

46. HPLC柱对介质的要求和羟基磷灰石填料的性能。

HPLC柱对于介质的要求和羟基磷灰石作为色谱填充介质的性能主要表现在以下几个方面：

1） 高机械强度 在HPLC柱中流动相一般在高压下通过柱，因而要求填充介质具有高的机械强度。现在使用的羟基磷灰石，尤其是球型颗粒可以在15MPa压力下使用，通过强化方法制备的羟基磷灰石既所谓陶瓷羟基磷灰石可在几十兆帕以上的压力下使用。

2） 粒子大小、形状和孔隙 填充介质的粒子大小、形状以及表面结构与HPLC柱的理论塔板数直接相关，通常要求有高的理论塔板数。球型羟基磷灰石颗粒大小、性质和孔隙可满足HPLC柱的要求。

3）化学和热稳定性

色谱过程是流动相与固定相既填充介质之间频繁强烈接触中完成的，因此要求填充介质在流动相中有很好的化学稳定性。

羟基磷灰石是磷酸钙盐中最稳定的相，在中性或碱性水相中非常稳定。羟基磷灰石在1400℃才发生相变，热稳定性好。

4） 非可逆吸附 为有稳定的柱效和足够长的使用周期，HPLC柱要求填充介质具有低的非可逆吸附。羟基磷灰石的非可逆吸附非常低，满足这一要求。

5） 表面化学修饰 为用于高效亲和色谱，要求在填充介质表面配接相应的功能基团。羟基磷灰石表面较易进行各种化学修饰。

总之，羟基磷灰石作为色谱柱填充介质能提供专一的选择性、高的键和容量、低的非可逆吸附以及化学稳定性和热稳定性好，完全满足HPLC柱的要求。

47. 在物质的分离纯化中，和其它方法相比，色谱法基本特点

色谱学是一门以物理化学为基础的分离与纯化科学，与其他分离纯化法相比，它具有以下几个基本特点。

1） 分离效率高 色谱分离的效率之高是其他分离技术所无法相比的，尤其是细颗粒多孔球型的高效填料问世后，使色谱柱的柱效有更大的提高。每米可达几十万的理论塔板数。

2）应用范围广 HPLC的应用范围之广也是其他分离技术无法相比的，从极性到非极性，离子型到非离子型，

小分子到大分子，无机到有机及生物活性物质，以及其他热稳定性或热不稳定性的化合物，可以说无所不包。尤其是对生物样品的分离分析，是其他方法无法代替的。

3）操作参数多 色谱的可变操作参数之多也是其他分离技术无法相比的。流动相可用气体、液体或超临界流体。在气、液、流体中又有许多不同的物质可选用。固定相可用液、固两大类。在加上流动相的pH值、离子强度、有机溶剂的含量、分离温度等参数的变化，使整个分离过程随着上述各种参数的变化适应于各种不同的样品分离的需要，应用于各种困难复杂的场合。

4） 高灵敏度在线检测 与其他分离手段相比，色谱具有高灵敏度在线检测的特性。根据不同的物理与化学的原理，HPLC具有不同的高灵敏度的检测器，适用于多种千差万别样品的需要。这些检测器不但稳定性好，信噪比高，同时都能进行连续的在线检测，及时掌握分离与纯化过程中的情况，保证在要求的纯度下得到最高的产率。

5） 快速分离 HPLC由于采用了高压溶剂传输系统，即使采用高效细颗粒填料，也能保证分离过程在一定的线速下进行，而且由于单位柱长的柱效提高，柱长可以大大缩短，更加快了分离的速度，从而可以提高单位时间的产量。

6） 连续自动化操作 电脑用于色谱分离过程以后，从最初的简单数据处理发展到目前作为控制操作的中心，使大量的样品可以按照事先设置好的程序进行完全自动连续的操作。

色谱法正是由于上述这些特点，在生物技术蓬勃发展、迫切需要有效的分离纯化方法的今天，人们还是认为色谱是最理想的也是最有发展前景的一种分离与纯化生物大分子的方法。

48. 同无机基质的填料相比较，有机高分子类型填料的普遍特征？

同无机基质的填料相比，有机高分子类型填料普遍具有如下特征：

①它们的基质微球可以广泛选择各种天然的多糖为原料来制备，也可以广泛使用各种的单体和交联剂来制备。

这些高分子材料一般都容易进行化学改性处理，所得到的填料普遍具有良好的色谱选择性。

②它们对于被分离样品有较强的负载能力，有较高的色谱容量。这对于规模的制备色谱来说是尤为适宜的。

③他们具有良好的耐酸、耐碱和耐溶剂处理的化学稳定性，可以在广泛的pH值范围内使用，并且有较长的柱寿命和较好的再生能力。

④它们不易产生不可逆的非特异性吸附作用，特别对于生物大分子的分离有较好的相容性，能有效地保持样品的生物活性。

有机高分子类型填料的颗粒刚性还普遍不如无机基质填料那样好，孔结构也往往比较复杂，在淋洗体系的变化过程中可能或多或少的会产生膨胀或收缩现象，所有这些影响色谱性能的因素，仍然有待于研究解决。

49. 超临界流体萃取与CO２萃取比较有哪些优点? 超临界流体取萃取剂优点有哪些？

用超临界萃取方法提取天然产物时，一般用 CO2 作萃取剂。这是因为： (1) 临界温度和临界压力低(Tc=31.1℃，Pc=7.38MPa)，操作条件温和，对有效成分的破坏少，因此特别适合于处理高沸点热敏性物质，如香精、香料、油脂、维生素等；(2) CO2可看作是与水相似的无毒、廉价的有机溶剂；(3) CO2在使用过程中稳定、无毒、不燃烧、安全、不污染环境，且可避免产品的氧化：(4) CO2的萃取物中不含盐和有害的重金量，并且无有害溶剂的残留；(5)在超临界CO2萃取时，被萃取的物质通过降低压力，或升高温度即可析出，不必经过反复萃取操作，所以超临界CO2萃取流程简单。因此超临界CO2萃取特别适合于对生物、食品、化妆品和药物等的提取和纯化。

50. 利用离心法和过滤法进行固液分离的原理、常用设备及优缺点？

（1）离心法：原理：离心机是利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液分离或浓缩的机械，由于离心力场所产生的强大离心力，所以利用离心分离可分离悬浮液中极少的固体微粒和大分子物质。

常用设备：按其作用原理不同，可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。前者转鼓上开有小孔，有过滤介质。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量较高的场合。后者转鼓上无孔，不需过滤介质。主要用于处理固液、液液固等分离。

优点：具有分离速率快，分离效率高、液相澄清度好。

缺点：设备投资高、能耗大，此外连续排料时，固相干度不如过滤设备。

（2）过滤法：原理：悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。根据过滤机理不同，过滤操作分为澄清过滤和滤饼过滤。’

（3）在澄清过滤中，所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭等，填充于过滤器内即构成过滤层；也有用烧结陶瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管子等组成的成型颗粒滤层，当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清。此法适用于固体含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5~100um的悬浮液的过滤分离。

（4）滤饼过滤中，过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布,玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。滤饼过滤按推动力的不同可以分为四种，即重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。

（5）优点：固相干度好，无需设备，能耗低，经济成本低。

（6）缺点：容易形成滤饼，分离效率低。