基础研究
食品研究与开发FoodResearchAndDevelopment2011年3月第32卷第3期
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酶法提取芋艿蛋白质工艺
常银子，王丽霞，仲山民，沈潇滢
（浙江林学院农业与食品科学学院，浙江临安311300）
摘
要：探讨木瓜蛋白酶对提取芋艿蛋白质的影响，获得最佳提取工艺。以木瓜蛋白酶为酶试剂提取芋艿蛋白质，以
考马斯亮蓝法为蛋白质含量测定方法，采用单因素实验分别研究提取温度、酶量、pH值、提取时间对芋艿蛋白质提取率的影响，再通过正交试验对提取条件进行优化筛选，结果表明：提取温度是影响提取率的关键因素，其次分别是pH值、酶量，影响最小的因素是提取时间。此次研究得出的最佳工艺参数组合为：提取温度55℃，酶量3mg/g、pH值6.5、提取时间1h，在此条件下蛋白质提取率为10.20%。关键词：芋艿；蛋白质；酶法；提取
ExtractionProteinfromtheTarobyEnzymaticMethodCHANGYin-zi,WANGLi-xia,ZHONGShan-min,SHENXiao-ying
（CollegeofandFoodFoodandAgriculture，ZhejiangForestryUniversity，Lin＇an311300，Zhejiang,China）Abstract:Tostudyinfluenceofpapayotinonthetaroproteinextraction.Thesinglefactorexperimentswereusedtostudytheinfluenceoftheextractiontemperature,enzymeamount,pHandextractiontimeonthetaroproteinextraction.Beforethis,weextractedthetaroproteinusingChinesefloweringquinceenzymereagentandadoptedtheCoomassiebrilliantbluemethodfordeterminationoftheproteincontent.Thenwedidtheoptimizedscreenoftheseextractionconditionsthroughtheorthogonaltest.Results:theextractiontemperatureisakeyfactorintheextraction,followedbypHvalue,enzymeamount,andtheextractiontime.Thebestextractionconditionisasfollows:extractiontemperature55℃,enzymeamount3mg/g,pHvalue6.5,extractiontime1h.Theproteinextractionrateis10.20%undertheseconditions.Keywords:taro;protein;enzymaticmethod;extraction
作者简介：常银子（1977—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：保健食品的开发与评价。
777777777777777777777777777777777777777777777777科学,2006,25(12):0-3的罗非鱼鳞作为原料。结果发现得到的产品颜色偏黑(主要为残留在鱼鳞表面的鱼皮无法除去)，鱼鳞脆而无韧性，灰分含量最低只能到达4％左右，完全达不到企业要求。可能是由于烘干过程中的高温改变了鱼鳞的结构（如蛋白质变性等），使得很多物质无法除去。因此，在生产中要注意采用自然风干的方式对罗非鱼鳞进行干燥和保存。参考文献：
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常银子，等：酶法提取芋艿蛋白质工艺
基础研究
芋艿俗称“芋头”，富含淀粉，可供食用。芋艿的营养价值很高，在新鲜芋艿球茎中，水分占82.25%，脂蛋白质占1.78%，无氮浸出物占14.04%，肪占0.14%，
粗纤维占0.%，灰分占0.88%。含有18种氨基酸，其中11种氨基酸如天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸等含量均超过0.5%。芋艿含有一种黏液蛋被人体吸收后能产生免疫球蛋白，或称抗体球蛋白，
白，可提高机体的抵抗力，能解毒，对人体的痈肿毒痛包括癌毒有抑制消解作用，可用来防治肿瘤及淋巴结核等病症[1]。
目前国内外关于芋艿蛋白质的提取与利用的研究报道不少[2-5]。传统的蛋白质提取方法有：水溶法（如清蛋白）、盐溶法（如球蛋白）、稀酸或稀碱溶法（如谷蛋）、醇溶法（如醇溶蛋白）等。酶法提取蛋白质是利用白
而被抽提出来[5]。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶，与其他蛋白酶相比，具有较高的热稳定性，且具有从蛋白质的水解物再合成蛋白质类物质的能力[6]。选用木瓜蛋白酶提取芋艿蛋白质反应条件比较温和，同时其反应的固液比较小，可以减少水的消耗量，也避免了传统方法提取蛋白质的所造成的负面效应，可以为芋艿的利用开辟新的途径[7-10]。因此拟采用木瓜蛋白酶酶法来提取其蛋白质，对影响其提取率的各个因素进行系统的研究，以供实际生产提供参考。11.1
材料和方法材料
市售新鲜芋艿；木瓜蛋白酶（活力≥100000U/g）：上海华蓝化学科技有限公司；牛血清蛋白：上海贝基生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250：上海科端生物科技有限公司；等。1.2
仪器
JJ-2（2003-61）组织捣碎匀浆机：北京康达顺业科技有限公司；FA-N/FC电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；PHB-4数显酸度计：上海天呈科技有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；DGG-9053AD型电热恒温鼓风干燥箱：上海托莫斯科学仪器有限公司；LXJ-IIB低速大容器多管离心机：上海安亭科学仪器厂；紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；等。1.31.3.1
方法工艺流程
芋艿→去皮洗净→捣碎→称取→加水→调整温蛋白酶对芋艿蛋白质的降解和修饰，使其变成可溶肽
度、pH→加酶→反应→灭酶→离心→收集上清液→测定
芋艿去皮后洗净，清除表面泥沙杂质，再捣碎，过100目筛后，准确称取5.0000g加水5mL，再调整温度、用缓冲液调整pH、控制加酶量和提取时间，具体参数设置如下：酶解温度为35、45、55、65℃，加酶量：1%、2%、3%、4%，pH值控制在3.5、5、6.5、8，提取时间1、1.5、2、2.5h。待反应完全后，将反应液迅速加热至90℃，并保温5min，以钝化蛋白质中掺杂的酶，在以转速4000r/min离心15min，再去上清液等待测定。1.3.21.3.2.1
指标测定标准曲线的制作
吸光度值蛋白质含量（/μg/mL）图1标准曲线
Fig.1Standardcurve
称取10mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，配制成0.1mg/mL的牛血清蛋白标准品溶液。同时称取0.1g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%的乙醇中，加入100mL85%的磷酸，最后用蒸馏水定容至1000mL，制成0.01%的考马斯亮蓝染液。取8支具塞试管，编号后，加入试剂，盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照，在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量（μg/mL）为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘出标准曲线，并得到回相关系数R2=0.9980[10]。归方程y=0.0056x+0.0012，1.3.3.2
样品中蛋白质含量的测定
按照标准曲线方法进行测定吸光度，代入回归方程得出样品中蛋白质含量，并计算提取率：
·n·V×100提取率/%=C
W式中：C为蛋白质浓度，（μg/mL）；n为稀释倍数；V为溶液体积；W为原料中蛋白质质量，μg。22.1
结果与分析
酶法提取工艺条件的单因素试验
单因素实验中，分别固定3个因素，分别改变酶
基础研究
常银子，等：酶法提取芋艿蛋白质工艺
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解温度、酶量、pH值和提取时间，结果如图2、3、4、5所示。
最佳温度，充分发挥蛋白酶的活力。加酶量对提取率的影响变化规律相似，当加酶量为2mg/g，其提取率最说明此时酶与底物的作用达到饱和。pH值的变化高，
规律为先增加到6.5时提取率最高，之后逐步降低，说明本实验用酶的最适pH值在6.5左右。提取时间达2h提取率达到最高值12.5%，之后趋于平缓。
另外，从单因素试验可获知，温度对提取率的影响不大，但考虑到交互作用的影响，因此在正交试验中
提取率/%温度/℃
图2温度对蛋白质提取率的影响
Fig.2Effectsoftenmpretureonextractionrateoftaroprotein
仍然选用提取温度、用酶量、酶解pH值和提取时间作为实验因素。2.2
正交试验
为使试验更加科学，根据上述单因素试验，继续
提取率/%以蛋白质提取率为考察目标，设计正交试验，选用正交表L16（45）研究工艺因素间的相互影响，不同温度、酶量、pH值和提取时间对蛋白质提取率的影响试验结果见表2和表3。
酶量（/μg/g）
表1试验因素水平表
Table1FactorsandLevelintheorthogonaltest
水平A提取温度/℃B酶量（/mg/g）C酶解pH值D提取时间/h1234
35455565
1234
3.556.58
1234
图3加酶量对蛋白质提取率的影响
Fig.3Effectsofenzymeamountonextractionrateoftaro
protein
提取率/%表2正交试验结果
Table2Resultsandrangeanalysisoforthogonalteston
extractionconditionsoftaroprotein实验
序号A提取温度1121314152627282931031131231341441541K110.71K231.16K336.58K431.781K12.681K27.791K39.151K47.95R6.47
B酶量
123412341234123426.1428.4932.6522.956.547.128.165.742.42
因素
C酶解pH值D提取时间
1122334423144132344312214231241320.8330.4723.7629.6034.21.31.0028.525.217.625.947.408.665.417.757.133.452.21
空列1
23443212143341228.9224.4331.2325.657.236.117.816.411.70
提取率/%1.711.695.162.154.537.509.879.2610.029.108.778.699.8810.208.852.85
pH值
图4pH值蛋白质提取率的影响
Fig.4EffectsofpHonextractionrateoftaroprotein
提取率/%提取时间/h
图5提取时间对蛋白质提取率的影响
Fig.5Effectsofextractiontimetonextractionrateoftaro
protein
根据单因素试验可知，随着提取温度升高，提取率先增加，当达到45℃时蛋白质提取率最高，之后，提取率降低再缓慢上升，原因是酶可能在45℃时，达到
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方差来源酶量（B）
SS12.510375
df3333315
MS4.1701254.0498082.39695
提取温度（A）99.012825酶解pH值(C)30.423225提取时间（D）12.149425
误差总变异
7.19085161.2867
常银子，等：酶法提取芋艿蛋白质工艺
表4验证实验结果
Table4Theredultoftest
组合A3B3C3D1A2B2C4D4
基础研究
表3正交试验方差分析
Table3Analysisofvarianceoforthogonaltestresults
F值
**
F临界值F0.05=3.49
蛋白质提取率/%
10.209.91
33.00427513.76928
1.739763nsF0.01=5.95
*
10.1410754.230825
1.6567ns
由表4可知本次试验得出的最佳工艺参数组合为A3B3C3D1，与其对应的蛋白质提取率为10.20%。3结论
利用木瓜蛋白酶提取芋艿蛋白质，作用环境所受较小，对热的稳定性好，具有从蛋白质的水解物再合成蛋白质类物质的能力，且反应条件比较温和，消耗能源少，清洁环保，可以有效提取蛋白质。
由正交试验结果分析可知，提取温度对蛋白质提其次是pH值，影响较小的是酶量和提取率影响最大，取时间。
本实验得出的最佳工艺参数组合为是：提取温度55℃，酶量3mg/g、pH值6.5、提取时间1h，由此得到的芋艿蛋白质提取率为10.20%。参考文献：
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收稿日期：2010-07-01
注：ns为差异不显著；*为差异显著；**为差异极显著。
从表3的正交试验结果看，根据极差值R，可知影响因素A>C>B>D，即温度对提取率的影响最大，其后依次是pH值、酶量，影响最小的因素是提取时间，且由表4的正交试验方差分析可知，提取温度对蛋白质提取率的影响达到了极显著水平，酶解pH值则达到了显著水平，这两个因素对蛋白质提取率的影响最大，相比之下酶量和提取时间的影响则比较小，此项结论也同时印证了表2的结果。产生这种结果的原因可能是温度增加了包括酶和底物分子在内的溶液体系的热能，既可促使胞内活性物质向溶液扩散，又能提供酶促反应所需的能量，使酶解破壁作用增强，所以对蛋白质提取率影响最大。pH值对酶存在影响，在最适宜pH值时，催化反应的速率最高。对最适pH值偏离不很大时，酶虽不变性，但会使酶活性部位的基团离子化发生改变，从而降低酶的活力，pH值发生较大偏离时，维护酶的三维结构的共价键就会受到干扰，导致酶蛋白自身的变性[7]。加酶量对蛋白质提取率的影响是在一定范围内存在的，但随着酶浓度的升高，底物浓度不能对导致酶的作用受到，所以及酶量对蛋酶达到饱和，
白质提取率的影响是有限的。提取时间对蛋白质提取率影响并不是很大，各个时间段内的提取率之间波动较小。提取率从1h到1.5h时增大较快，从1.5h到2h时略有下降，从2h到2.5h时又有增大，但较前一个蛋白质已从细胞增大期略慢。随着提取时间的延长，
内扩散到细胞外的溶液中，细胞内外的蛋白质浓度达延长提取时间对提高溶液中蛋白质到一个动态平衡，浓度有限[9]。
通过比较K值，可确定各因素最优水平组合为A3B3C3D1，即提取温度为55℃，酶量为3mg/g，pH值为6.5，提取时间为1h。2.3最佳工艺参数的确定
根据理论最佳工艺参数和直观最佳工艺参数两项组合，进行验证实验，结果见表4。
