一种玉米WRKY类转录因子ZmWRKY112及其编码基因与应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111995668 A(43)申请公布日 2020.11.27

(21)申请号 202010729927.4(22)申请日 2020.07.27

(71)申请人 安徽农业大学

地址 230000 安徽省合肥江西路130号(72)发明人 蔡荣号　方秀　袁皓天　伯晨　

彭晓剑　司伟娜　马庆　(74)专利代理机构 合肥中谷知识产权代理事务

所(普通合伙) 34146

代理人 洪玲(51)Int.Cl.

C07K 14/415(2006.01)C12N 15/29(2006.01)C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/46(2018.01)

(54)发明名称

一种玉米WRKY类转录因子ZmWRKY112及其编码基因与应用(57)摘要

本发明公开了一种玉米WRKY类转录因子ZmWRKY112及其编码基因与应用，具体为根据转录因子ZmWRKY112基因序列设计引物，利用PCR技术从玉米自交系B73 cDNA中扩增得到ZmWRKY112基因。该基因编码具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID N0：1；2)将序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与W盒(TTGACC/T)顺式元件相互作用提高植物抗逆功能的蛋白质。玉米原生质体亚细胞定位实验表明，ZmWRKY112蛋白具有转录因子的核定位特征。本发明的ZmWRKY112基因用于玉米转化，获得的转基因玉米对抗盐胁迫能力明显增强。本发明为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，对提高农作物产量具有重要意义。

权利要求书1页 说明书6页

序列表2页 附图4页

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权　利　要　求　书

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1.一种玉米WRKY转录因子，其特征在于：是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)由序列表中的SEQ ID N0：1氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID N0：1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有玉米WRKY转录因子功能的蛋白质；

3)将序列表中的SEQ ID N0：1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与W盒顺式元件相互作用提高植物抗逆功能的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的玉米WRKY转录因子，其特征在于：所述玉米WRKY转录因子与W盒结合的DNA核心序列为TGAC。

3.一种如权利要求1所述玉米WRKY转录因子的编码基因。4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为下述1)至4)中的任一种：

1)具有序列表中SEQ ID N0：2的核苷酸序列；2)具有编码序列表中SEQ ID N0：1的蛋白质序列的多核苷酸；3)具有与序列表中SEQ ID N0：2的DNA序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)具有在高严谨条件下与序列表中SEQ ID N0：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件为用0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

5.一种如权利要求1所述的玉米WRKY转录因子在培育抗逆性增强的植物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗盐性。7.一种含权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。8.一种用于扩增权利要求3或4所述编码基因全长或任一片段的引物对。9.一种培育抗逆性增强的植物的方法：其特征在于：将权利要求3或4所述的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

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一种玉米WRKY类转录因子ZmWRKY112及其编码基因与应用

技术领域

[0001]本发明涉及基因工程和作物遗传育种技术领域，具体涉及一种玉米WRKY类转录因子ZmWRKY112及其编码基因与应用。

背景技术

[0002]植物在生长的过程中常常遭遇到各种各样不利的自然环境，比如干旱、高盐、低温、高温淹水等，其中高盐是影响植物生长发育和产量及植物地理分布最为重要因素之一。高盐会破坏水势的平衡和离子分布的平衡，导致植物受到分子损伤，生长延迟。在漫长的进化过程中，植物已经形成一套复杂的机制来适应非生物胁迫。植物对各种逆境胁迫的响应往往是多途径、多基因协同作用，从不同层次、不同水平对逆境的响应。其中，转录水平上的越来越受到人们的关注，如今对转录因子的研究已成为植物基因功能研究的一个重点。

[0003]转录因子又称为反式作用因子，是能够直接或间接与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合，从而靶蛋白转录效率的蛋白质因子，通过它们之间及其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。从蛋白质结构分析，转录因子一般含有4个功能区，即DNA结合域，转录域(包括激活和抑制域)，寡聚化位点以及核定位信号。随着研究的不断深入，越来越多的实验证明转录因子广泛参与植物生物与非生物胁迫应答反应、植物衰亡、种皮及毛状体发育及果实发育等一系列的生理活动。

[0004]WRKY是近年来发现的一种主要存在于高等植物中的转录调节因子。WRKY转录因子家族含有高度保守的WRKY结构域，由60个高度保守的氨基酸残基组成，在其N端还包括锌指结构，而且WRKY这个名字的由来也是在这个家族的WRKY结构域中含有一段更为保守的氨基酸序列WRKYGQK。WRKY转录因子能够与启动子中的(T)(T)TGAC(C/T)序列即W-box(W盒)特异结合，从而启动基因的转录。[0005]近年来，国内外致力于WRKY转录因子研究的研究非常多，并且取得了丰硕的成果。WRKY基因受各种环境因子如干旱、低温、创伤等以及信号分子、真菌诱导因子、病原体和植物本身不同发育阶段的诱导，直接或间接参与其中的网络，从而提高植物对逆境的耐性或抗性。目前有关WRKY家族转录因子的研究大部分来自水稻和拟南芥，而其它物种的研究报道不多。因此，本发明从玉米中分离克隆该家族基因并鉴定它在提高目的植物抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆新型作物品种具有十分重要的意义。发明内容

[0006]本发明的目的在于提供玉米转录因子ZmWRKY112基因的序列及功能，并进一步公开了该基因的应用。

[0007]本发明通过以下技术方案来实现上述目的：[0008]本发明所提供的玉米WRKY类转录因子，名为ZmWRKY112，来源于玉米属玉米(Zea mays L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

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1)由序列表中的SEQ ID N0：1氨基酸残基序列组成的蛋白质；

[0010]2)将序列表中的SEQ ID N0：1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有玉米WRKY转录因子功能的由1)衍生的蛋白质；[0011]3)将序列表中的SEQ ID N0：1氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与W盒(TTGACC/T)顺式元件相互作用提高植物抗逆功能的蛋白质。

[0012]进一步的，序列表中的SEQ ID N0：1由324个氨基酸残基组成；上述玉米WRKY转录因子与W盒顺式元件相互作用能提高植物抗逆功能，且其与W盒结合的DNA核心序列是TGAC。[0013]本发明还提供了上述玉米抗逆转录因子的编码基因(ZmWRKY112)，为下述1)至4)中的任一种：

[0014]1)具有序列表中SEQ ID N0：2的核苷酸序列；[0015]2)具有编码序列表中SEQ ID N0：1的蛋白质序列的多核苷酸；[0016]3)具有与序列表中SEQ ID N0：2的DNA序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

[0017]4)具有在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N0：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件可为用0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

[0018]其中，序列表中的SEQ ID N0：2由975个碱基组成，编码一个完整的开放阅读框，编码具有序列表SEQ ID N0：1的氨基酸残基序列的蛋白质。上述编码基因均具有序列表中SEQ ID N0：2的核苷酸序列。

[0019]同时本发明还包含上述玉米WRKY转录因子在培育抗逆性增强的植物中的应用。及含有本发明基因的表达载体，转基因细胞系、重组菌及宿主菌均属于本发明的保护范围。[0020]扩增ZmWRKY112中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。[0021]利用植物表达载体，将本发明的ZmWRKY112编码的基因导入植物细胞，可获得对逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。所以本发明还提供一种培育抗逆性增强的植物的方法，将本发明的ZmWRKY112编码基因导入目的植物得到转基因植物，所得转基因植物的抗逆性高于目的植物。

[0022]可以采用已经的克隆的ZmWRKY112基因作为探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以利用PCR的方法，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何一段DNA或与其同源的一段DNA。使用ZmWRKY112构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。[0023]携带本发明ZmWRKY112基因的表达载体可以通过Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，电穿孔等生物技术方法导入植物细胞。被转化的目的植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。

[0024]本发明的有益效果在于：本发明从玉米中分离、克隆得到ZmWRKY112基因。通过农杆菌介导的转化法将其导入玉米并获得转基因植株。然后验证了转基因玉米对盐胁迫的耐受性提高，为利用该基因在其他植物上的应用从而提高抗逆性提供了理论依据和利用价值。

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附图说明

[0025]图1为ZmWRKY112与其他物种WRKY家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对示意图，其中，核心保守区域WRKYGQK用实线方框表示，锌指结构用虚线方框表示；[0026]图2为ZmWRKY112与其他WRKY转录因子氨基酸序列比对后的进化树分析图。[0027]图3为ZmWRKY112蛋白的亚细胞定位玉米原生质体示意图，用于ZmWRKY112蛋白的亚细胞定位，亚细胞玉米原生质体ZmWRKY112蛋白的定位，核定位信号mCherry作为核标记物；

[0028]图4为T1代转ZmWRKY112基因玉米植株的PCR检测结果图，M：DL2000 Marker；1:L1-2；2:L1-3；+：以p1301质粒为模板；－：以水为模板；

[0029]图5为ZmWRKY112转基因T2代植株PCR检测与bar试纸条检测结果图；[0030]图6为转ZmWRKY112基因玉米在高盐环境中的表观形状图；[0031]图7为转ZmWRKY112基因玉米在高盐环境中的存活率示意图。

具体实施方式

[0032]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。[0033]需要说明的是，下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工生物有限公司合成；测序由通用生物公司进行；实验中用到的各种性内切酶、连接酶、pEASY-Blunt Simple、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs等购自Takara公司；反转录试剂盒购于Promega公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均以及基因组提取试剂盒购于全式金生物技术有限公司，方法均参照说明书进行。[0034]实施例1玉米WRKY家族基因ZmWRKY112的获得[0035]1.胁迫处理：植物材料为玉米B73自交系，精选大小均匀、颗粒饱满的种子播于装有砂土的花盆中，适时喷洒蒸馏水，以保持土壤湿润。待幼苗长至二叶一心时，以正常灌水的植株作对照，进行300mmol/L NaCl胁迫处理，处理时间分别为12、24、48h，在处理的不同时间段，用剪刀分别剪取试验组和对照组玉米幼苗相同部位叶片，每个处理阶段取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃冰箱。[0036]2.RNA提取：上述获得的玉米材料，加入液氮研磨后，迅速转移到1.5ml的离心管(液氮预冷)中。研磨好的材料统一加到0.5ml刻度上，加入1ml Trizol，室温放置10min，使其充解；4℃，12000rpm，5min，弃沉淀；按200ml氯仿/ml Trizol加入氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s，待其充分乳化后，室温放置15min；4℃，12000rpm离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取上层水相，至另一个离心管中；按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min；4℃，12000rpm离心15min；弃去上清，RNA沉于管底；小心弃去上清，按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5min，弃去乙醇，倒放在纸上，室温放干；加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液吹打沉淀，待RNA充分溶解后取适量检测其浓度和纯度，其余放入-80℃保存。[0037]3.反转录：按照promega反转录试剂盒提供的步骤操作，反转录体系如下：总RNA 1μg，25mM MgCl24μl，Reverse Transcription 10×Buffer 2μl，10mM dNTP Mixture 2μl，

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RNase inhibitor(40u/μl)0.5μl，Oligo(dT)15Primer(500μg/μl)1μl，AMV Reverse Transcriptase(25u/μl)0.6μl，加Nuclease-Free Water至20μl。小心混匀，42℃温浴40min，然后95℃加热5min，4℃放置15min终止反应，即获得相应的反转录产物cDNA。[0038]4.扩增：检索MAIZEGENOME和NCBI数据库，获得ZmWRKY112的推测编码序列，用Primer Premier 5.0软件设计特异引物，引物由生工生物公司合成。引物序列如下：[0039]WRKY112F：ATGGCGCTAGTATTAGGGCGG[0040]WRKY112R：CAACGGTCCAACCAGGCG[0041]以上述获得玉米cDNA为模板，通过RT-PCR得到一个包含有完整开放阅读框的编码区，长度为975bp，回收，连接到pEASY-Blunt Simple载体上，进行测序。测序结果表明ZmWRKY112与序列表中序列2中的核苷酸序列一致。编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。

[0042]实施例2玉米ZmWRKY112的序列同源与同源性分析[0043]根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与WRKY家族转录因子同源关系最近。将该转录因子与其它WRKY转录因子家族成员的蛋白序列进行比对，分析其锌指结构类型为C2HC型，依据该DNA结合域的结构特征，该ZmWRKY112蛋白属于第Ⅲ类WRKY转录因子家族(如图1所示)。为了进一步分析ZmWRKY112和其它WRKY类转录因子的系统进化关系，将不同植物的WRKY蛋白与ZmWRKY112进行系统进化关系的分析(如图2所示)。

[0044]实施例3ZmWRKY112的亚细胞定位[0045]1.构建ZmWRKY112的亚细胞定位载体

[0046]为了了解ZmWRKY112蛋白的表达情况，构建了亚细胞定位融合表达载体。利用pCAMBIA1305(p1305)作为骨架，GFP绿色荧光蛋白作为报告基因，构建了p1305-35S-ZmWRKY112-GFP融合表达载体。切记在设计此次基因引物时，要去掉基因的终止密码子。XbaI和BamHI作为上下游引物的酶切位点。引物序列如下：[0047]RH-F：GCTCTAGAATGGCGCTAGTATTAGGGCGGGA[0048]RH-R：CGGGATCCACGGTCCAACCAGGCGCG[0049]2.玉米原生质体提取[0050](1)玉米芽长度长到1cm到1.5cm左右时，挑选大小比较一致的种子播种于营养土中，在光下培养至芽长出1cm后，转于暗处25℃，至第二片叶高于第一片10-15cm时，从茎部剪玉米第二片叶。[0051]PS：①培养的过程中，补加营养液；②避免光照，当光照总时间超过10min，易变绿。[0052](2)将剪好的叶片截取距叶尖6cm到8cm的部分，将其剪成小于0.5mm宽的小叶条，并完全浸没在酶解液中，10ml酶解液可酶解0.6g-1.0g玉米叶片。切好后，用牙签分散使其均匀。[0053](3)避光40r/min(锡箔纸包裹)条件下，酶解5-6h，取出酶解液后，轻轻摇晃培养皿，促使原生质体释放(手动轻摇2-3周)。[0054](4)此时预冷—定量的W5溶液(水浴)(可提前将W5吸取一定量，单独放置使用)(50ml灭菌离心管)。[0055](5)先用W5润洗100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的解液。

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(6)过滤除去未溶解的叶片，用等量的W5溶解含有原生质体的酶液。

[0057](7)用30ml的圆底离心管，100g离心2min，尽量除去上清，用5ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬(先用大再用小，沿管壁，倾斜加入)。[0058](8)冰上静置30min。[0059](9)100g离心2min，使原生质体沉浸在管底，在不触碰到原生质体沉淀的情况下，尽量除尽W5溶液，然后用适量MMG溶液重悬原生质体，显微镜下检查溶解液中的原生质体数目。[0060](10)加入10ul DNA(10ug-20ug约5-10kb的质粒DNA)至2ml离心管中。[0061](11)加入100ul原生质体(2×104个)，轻柔混合。[0062](12)加入110ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合(黏稠状，轻拍管壁)。[0063](13)诱导转化混合物15min(转化时间视实验而定，需表达量高的，转化时间更高)。[00](14)室温下用440ul W5溶解液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管，使之混合完好，以终止反应。[0065](15)室温下用台式离心机，100g，2min，然后轻缓去上清，再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g，2min，离心，去上清(7次离心)。[0066](16)用200μl WI溶液，轻柔重悬原生质体于多孔组培养皿中。[0067](17)室温下(暗处)(20-25℃)诱导原生质体12-18小时，然后激光共聚焦显微镜观察(如图3所示)。

[0068]实施例5ZmWRKY112转基因玉米的检测

[0069]构建植物表达载体pCAMBIA1301a-ZmWRKY112，通过农杆菌介导的玉米遗传转化方法将其导入玉米品种KN5585中，经过预培养、浸染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到转基因植株。然后提取玉米基因组DNA，具体方法如下：[0070]1.取新鲜的玉米植株100mg幼叶放入研钵内，加液氮充分研磨。[0071]2.加入250μl RB1溶液，快速颠倒混匀，[0072]3.加入30μl 10％SDS，15μl RNaseA到裂解液中，混匀。[0073]4.置于60℃水浴锅内温浴15min。[0074]5.13000rpm，离心5min，将上清转移至干净的离心管中。[0075]6.加入100μl溶液PB1，混匀，置于冰上5min，13000rpm，离心5min。[0076]7.将上清转入一干净离心管，加入375μl溶液BB1，混匀。[0077]8.将全部的混合液倒入吸附柱上，13000rpm，离心1min，弃滤液。[0078]9.加入500μl溶液CB1，13000rpm，离心1min，弃滤液。[0079]10.加入500μl溶液WB1，13000rpm，离心1min，弃滤液，重复一次。[0080]11.13000rpm，离心2min，彻底去除WB1。[0081]12.将吸附柱转入一干净离心管，在柱加入70μl预热的去离子水，室温静置2min，13000rpm，离心2min，洗脱DNA。

[0082]13.取5ul样品在1％的琼脂糖凝胶上点样，检测所提DNA的质量。[0083]以此为模板，以潮霉素基因引物扩增目的片段[0084]HygR-F：ACTCACCGCGACGTCTGT

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HygR-R：TTTCTTTGCCCTCGGACG

[0086]PCR反应条件为：预变性：94℃，5min；变性：94℃，30s，，退火：55℃，30s，延伸：72℃，1min 30s，30个循环；72℃，10min。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

[0087]实施例6ZmWRKY112转基因T2代植株PCR检测与bar试纸条检测PCR检测[0088]提取转基因植株的叶片的基因组DNA，根据筛选标记基因bar的序列设计特异性引物：[00]bar-F：ATGAGCCCCAGAACGACGCC；[0090]bar-R：TTAGATCTCGGTGACGGGC[0091]对bar基因进行PCR检测，扩增程序为：预变性：94℃，5min；变性：94℃，30s，退火：55℃，30s，延伸：72℃，1min 30s，30个循环；72℃，10min。结果如图所示，转基因植株均能够扩增出目的条带(bar基因扩增条带为552bp)，而阴性对照未扩增出条带，表明外源基因已成功导入玉米基因组，结果如图5所示。[0092]bar试纸条检测[0093](1)检测前研磨NaCl溶液处理后叶片样本，并根据说明书中比例加入纯水进行稀释，在完成研磨和稀释后，将样本混匀，静置或离心，取上清液作为检测标本；[0094](2)从包装中取出CP4 EPSPS转基因检测试纸条，有MAX箭头标记端为样品端，样品端垂直向下，插入准备好的检测样本上清液中；试纸条样品端浸没入样本液的深度约为0.5cm，不要超过箭头上端的黑色标记线；[0095](3)在检测过程中，CP4 EPSPS转基因检测试纸应一直浸在样本液中，直至检测样本移行至检测窗口上端；取出检测条，平放在无吸收平面上，等待5-10分钟，阅读结果(如图5所示)。

[0096]阴性(不含转基因)：仅在C线处出现红色条带；阳性(含转基因)：C线和T线处均出现红色条带，红色较浅代表含量较少。

[0097]实施例7ZmWRKY112转基因T2代植株耐盐性鉴定

[0098]挑选饱满度一致的非转基因KN5585自交系和4份PCR阳性植株T2代种子播在装有蛭石和黑土的花盆中，每天浇灌适量的水，在温室中培养。幼苗长至三叶一心期时，每天用300mmol/L的NaCl溶液浇灌，以保持处理浓度恒定，3次重复。盐处理后，每天观察记录植株的表观性状(如图6所示)，并统计其存活率(如图7所示)。[0099]结论：可以明显看出，转ZmWRKY112基因玉米明显提高了玉米对高盐的耐受性。[0100]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

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序列表<110> 安徽农业大学<120> 一种玉米WRKY类转录因子ZmWRKY112及其编码基因与应用<141> 2020-07-27<160> 2<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 324<212> PRT<213> 玉米(Zea mays)<400> 1Met Ala Leu Val Leu Gly Arg Glu Glu Glu Leu Leu Ala Gln Leu Arg1  5  10  15Ala Leu Leu Thr Phe Leu Pro Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Pro Ala 20  25  30Ala Pro Val Lys Val Glu Ser Ile Met Gly Thr Ser Gly Gly Gly Arg 35  40  45Arg Leu Gly Ser Lys Arg Asp Arg Asp Asp Asp Ser Glu Ala Glu Ala 50  55  60Glu Gln His Gly Asp Glu Pro Ala Ala Ala Gln Pro His Tyr Cys Pro65  70  75  80His Pro Pro Pro Pro Cys Lys Arg Thr Arg Arg Arg Lys Asn Lys Lys 85  90  95Lys Arg Gln Gln Ser Lys Cys Leu Val Thr Thr Val Pro Asp Phe Asp 100  105  110Gly Tyr Gln Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Ile Glu Gly Ala Met 115  120  125Tyr Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Ile Gln Ser Ala Lys Gln Gly Cys 130  135  140Gln Ala Lys Arg Thr Val Gln Arg Asn Asp Asp Asp Gly Ala Thr Ala145  150  155  160Pro Pro Glu Tyr Thr Val Val Tyr Val Ala Glu His Thr Cys Thr Ala 165  170  175Asn Asp Asp Ala Leu Glu Ala Pro Pro Val Ile Leu Glu Thr Thr Thr 180  185  190Ser Val Val Val Arg Ala Pro Ala Ala His Thr Asp Pro Val Val Val 195  200  205Val Val Pro Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala

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210  215  220Cys Ser Thr Thr Val Thr Thr Gly Thr Glu Ser Pro Ala Ile Ser Gly225  230  235  240Asp Asp Val Ala Cys Cys Trp Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly 245  250  255Tyr Ser Tyr Ala Asp Asp Ser Cys Cys Cys Cys Cys Cys Asp Gly Leu 260  265  270Leu Ala Ala Val Val His Gly Gly Cys Gly Gly Ser Trp Ala Pro Gly 275  280  285Pro Ala Asp Ser Val Ser Val Pro Ser Phe Arg Leu Gln Glu Met Glu 290  295  300Asp Leu Thr Gly Pro Ile Arg Ser Pro Val His Val Val Pro Arg Ala305  310  315  320Trp Leu Asp Arg<210> 2<211> 975<212> DNA<213> 玉米(Zea mays)<400> 2atggcgctag tattagggcg ggaggaggag ctcctggcgc agctccgcgc gctactgacg 60ttcctaccac ctcctgcgtc gcccccggcg ccggcggctc ccgttaaggt ggagtccatc 120atgggcacta gtggcggcgg acgacgactg gggagcaaga gagaccggga cgacgacagc 180gaagccgagg ccgagcagca cggcgacgaa cctgcggctg cgcagcctca ctattgtcct 240catcctcctc ctccctgcaa aaggacgagg aggaggaaga ataagaagaa gcggcagcag 300agcaagtgcc ttgtgacgac agtgcccgac ttcgacgggt accagtggag gaagtacggg 360cagaagcaga tcgaaggtgc catgtacccc aggagttact acaggtgcat acagagcgcc 420aagcaaggct gccaggcaaa acggacggtg cagcgcaacg acgacgacgg cgccaccgca 480cccccagagt acacggtggt gtacgtggcg gagcacacct gcacggccaa cgacgacgcg 540ctggaggccc cgccggtcat cctggagacc accaccagcg tcgtcgtccg tgcacctgca 600gcacacaccg atcccgtcgt cgtcgtcgtt ccggcaacgg caactacgtc agccgccgcc 660gccgcctccg cttgttccac caccgtcacc acggggactg aatctccggc gatctccggc 720gacgacgtgg cctgctgctg gagcagcagc ggcagtagca gcagcggtta cagctacgcc 780gacgactcct gctgctgctg ctgctgcgac gggttgctcg ccgctgtcgt ccacggtggc 840tgcggcggct cgtgggcccc cggaccggcg gattcggttt cggtgccgtc gttccggttg 900caggagatgg aggacttgac cggaccgatc cggtcgccgg tgcacgttgt tccccgcgcc 960tggttggacc gttga 975

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图1

图2

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图3

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图5

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图6

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