HLA2I分子对B711共刺激作用的影响①

①

李增山　隋延仿　叶　菁　(第四军医大学病理教研室肿瘤抗原肽实验室,西安710032)

　　中国图书分类号　R392112　R73517　　文献标识码　A　　文章编号　10002484X(2001)0920466203

摘　要　目的:研究HLA2I分子表达与B711分子的共刺激作用的相互关系,以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排斥反应刺激分子对抗原递呈机制的影响。方法:通过流式细胞仪(FCM)检测转染共刺激分子B711编码基因前后其表面HLA2I分子的表达情况。利用单克隆抗体阻断细胞表面HLA2I分子,以外周血混合淋巴细胞对阻断前后的细胞行杀伤实验。结果:表2INF刺激对细胞表面HLA2I分子的表达情况并无影响达B711的肝癌细胞其表面HLA2I分子表达明显增高(P<0101),而γ

(P>0105)。T淋巴细胞对转染后细胞的杀伤作用远远大于未转染组(P<0101),当表面HLA2I分子被阻断后,T淋巴细胞的

杀伤效应几乎降至零点。结论:转染B711后肝癌细胞高表达HLA2I分子,增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号—共刺激分子B711,从而可诱发更强的免疫排斥反应。

关键词　肝癌细胞　B711　HLA2I　阻断　细胞毒

EffectofHLA2IontheroleofB711

LIZeng2Shan,SUIYan2Fang,YEJing.DepartmentofPathology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an

710032

Abstract　Objective:StudytherelationshipofHLA2IandB711toelucidatetheroleofcostimulatorymoleculeonantigenpresentationinimmunologicalrejection.Methods:FCMwasappliedtodetecttheexpressionofB7111ThenthecytotoxicityofPBMLwasobservedbeforeandafterblockingtheHLA2I1Results:ThelevelofHLA2Iexpressionincreasedgreatly(P<0101)aftertransfection1Alsowefoundthattheintro2ductionofB711intoHHCCcellsinvitroinducedastrongimmunitythatwasassociatedwithTcellsincontrasttotheuntransfectedcellswhichB711wasnotexpressed(P<0101)1ThecytotoxicityofTlymphocytesdecreasednearlytozerolevelwhenHLA2Iwereblocked1Conclusion:TheexpressionofB711inHHCCconducetohighlevelofHLA2Iexpressionandincreasedeffectofantigenpresentationandcostimulationinimmunologicalrejectreaction1

Keywords　HCC　B711　HLA2I　Block　Cytotoxicity

　　B711是目前研究最为广泛的共刺激分子,可介导淋巴细胞和抗原递呈细胞之间的识别作用,增强淋巴细胞的杀伤活性,在肿瘤的免疫排斥反应中起着十分重要的作用

1

。本研究将共刺激分子B711

的编码基因转入肝癌细胞系HHCC后,HLA2I分子对B711共刺激作用的影响,以为肝癌的免疫治疗提供一定的理论基础。

1　材料与方法

111　材料　肝癌细胞系HHCC为本室保存,转染B711基因的肝癌细胞株HHCC2PB2为本室建立

2

,

上述细胞均在含10%新生牛血清的DMEM(高糖)培养基、37℃、5%CO2条件中培养。B711单克隆抗体、FITC羊抗鼠IgGΠIgM多克隆抗体为BectonDickinson

①国家自然科学基金资助(No.39770827)作者简介:李增山,男,28岁,博士;

指导教师:隋延仿,教授,博士生导师,主要从事肝癌的分子免疫病理

研究。

公司产品,HLA2I鼠抗人单克隆抗体为本校免疫学

-2

教研室提供。乳酸脱氢酶底物混合液:514×10

-4-4

molΠL(+)乳酸钠,616×10molΠLINT,218×10

-3

molΠLPMS,113×10molΠLNAD钠盐,012molΠLTris缓冲液(pH812),使用时新鲜配制。112　方法11211　肝癌细胞系HHCC表面HLA2I分子表达情

4

况实验研究　取5×10癌细胞接种96孔板,并加入人γ2INF(2000UΠml)刺激癌细胞,第48小时取样,以FCM检测γ2INF刺激前后的细胞表面HLA2I分子表达情况。11212　淋巴细胞的分离培养和杀伤实验　取健康人外周血,肝素(200UΠml)抗凝,常规分离外周血淋巴细胞,在含10%新生牛血清的DMEM(高糖)培养基、37℃、5%CO2条件中培养。第2天,补充PHA(1μgΠml)、IL22(200UΠml),继续培养,第4天,再次补充PHA(1μgΠml)、IL22(200UΠml),以后隔日补充IL22(100UΠml),维持生长,第6天,将丝裂霉素灭活

李增山等　HLA2I分子对B711共刺激作用的影响　第9期的肿瘤细胞以1:25的比例加入淋巴细胞诱导活化,第10～12天时用于杀伤实验,同时取一部分淋巴细胞在流式细胞仪上检测细胞表面CD4、CD8分子的表达情况。刺激诱导3周后行杀伤实验。本研究采用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验来评价细胞杀伤活性3。调整靶细胞浓度至4×105ml-1,取011ml接入96孔板,调整淋巴细胞浓度以25:1的效靶比加011ml淋巴细胞于96孔板中,以同样条件分别设置靶细胞自然释放孔、效应细胞自然释放孔和K562杀伤孔,以011ml2%TritonX2100代替效应细胞为最大释放孔,每1例均做3个复孔,之后分别在培养后4h、12h、24h取培养上清,加入011ml乳酸脱氢酶底物混合液,以3min的间隔在酶联仪上读取490nm处的吸光值,以每分钟吸光值的变化代表乳酸脱氢酶活性,并按如下公式计算杀伤率:

混合淋巴细胞杀伤率(%)=(实验孔LDH活性-靶细胞自然释放孔

LDH活性-效应细胞自然释放孔LDH活性)Π(最大释放孔LDH活性-靶细胞自然释放孔LDH活性);

T淋巴细胞杀伤率(%)=(实验孔LDH活性-靶细胞自然释放孔LDH活性-效应细胞自然释放孔LDH活性-K562杀伤孔LDH活性)Π

(最大释放孔LDH活性-靶细胞自然释放孔LDH活性)。11213　HLA2I抗体阻断实验　靶细胞中加入的HLA2I抗体以阻断细胞表面的HLA2I分子,具体阻

断步骤如下:调整细胞浓度至8×105ml-1

,取0105ml接入96孔板,加入10μg抗体,充分混匀,37℃,5%CO2条件下培养2～4h,不弃培养液,调整淋巴细胞浓度后以25:1的效靶比加0105ml淋巴细胞于96孔板中然后进行杀伤实验,方法同前。

11214　统计学处理　采用U检验、t检验等方法对

所得资料进行统计学检验,以SSPS统计学软件处理。

2　结果

211　流式细胞仪检测HLA2I分子表达情况　由表1

可知γ,2INF刺激前后,肝癌细胞表面HLA2I分子的表达情况无改变(P>0105),而转染B711后肝癌细胞表面HLA2I分子的表达明显增加(P<0101)。212　外周血混合淋巴细胞杀伤实验　在利用外周

血混合淋巴细胞进行杀伤实验时,以同等条件设置K562细胞杀伤组,在计算杀伤率时,将杀伤K562细

胞的NK活性予以去除。在靶细胞4×105ml-1

的浓度和效靶比为25:1的条件下,靶细胞和效应细胞自然释放的LDH活性均低于0102min-1

,最大释放为

1171±0116min-1

。213　HHCC2PB2诱发的免疫排斥反应　如图1示,

・467・

在4h时,HHCC2PB2的杀伤率同HHCC的杀伤率几

乎无差别(P>0105),在12h时,混合淋巴细胞杀伤率达6311%,去除NK活性后亦可达4819%,均高于相应的HHCC的杀伤率(P<0105),在24h时,针对HHCC2PB2的杀伤活性几乎全部来自T淋巴细胞,且明显高于HHCC(P<0101)。

214　HLA2I抗体阻断对杀伤效果的影响　利用HLA2I抗体将细胞表面HLA2I分子阻断,然后进行

杀伤实验。结果如图2示,HHCC2PB2表面的HLA2I分子被阻断后,杀伤率明显下降,T淋巴细胞杀伤率在阻断后几乎接近零点。

图1　淋巴细胞对HHCC2PB2和HHCC的杀伤结果

Fig.1　CytotoxicityoflymphocyteagainstHHCC2PB2and

HHCC

图2　淋巴细胞对阻断HHCC2PB2细胞表面HLA2I分子前

后的杀伤结果

Fig.2　AnalysisofcytotoxicityagainstHHCC2PB2beforeand

afterblockingHLA21moleculer

・468・

表1　流式细胞仪检测HHCC细胞表面HAL2I分子表达情

况

Tab.1　FlowcytometricanalysisofHLA2IexpressiononHH2

CCcells

HHCC

Beforestimulationwithγ2INFAfterstimulationwithγ2INF

P

中国免疫学杂志2001年第17卷7

受γ2INF治疗的一个重要原因,其中明确机制尚待进一步研究。另外,我们将细胞表面HLA2I分子利用其单抗阻断后,发现外周血混合淋巴细胞杀伤效应明显下降,T淋巴细胞的杀伤水平几乎接近消失,说明转染B711后肝癌细胞高表达HLA2I分子,

HHCC2PB29719

P

79106819>0105

<0101

——————

——————

Note:Statisticalanalysiswas,performedusingUtest.

增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号———共刺

激分子B711,从而诱发更强的淋巴细胞排斥反应。说明肝癌细胞在获得B711的表达之后其免疫原性的增强很可能是由于增高的HLA2I分子表达与B711共同作用而增强了CTL对癌细胞的识别作用。

4　参考文献

3　讨论

肝癌细胞在引发免疫排斥反应的过程中存在着许多自身的缺陷,不能够有效的被机体的免疫系统

所排斥,如何增强肝癌细胞诱导免疫排斥的效应是肝癌免疫排斥或基因治疗实施的一个重要基础。在我们的研究中,给肝癌细胞转入共刺激分子B711的编码基因,使其表达这个分子,增强肝癌细胞的免疫原性,达到增强肝癌细胞诱导免疫排斥反应的目的。

B711所提供的共刺激信号如果缺失,会导致T

4,5

细胞克隆的无反应性或凋亡。我们的研究发现肝癌细胞在转染B711基因并获得稳定表达后,其HLA2I分子表达与转染之前相比有明显提高(P<0101),外周血混合淋巴细胞杀伤实验亦证实转染后

γ的细胞诱发了较强的免疫排斥反应。同时发现,2INF刺激并不能有效的提高肝癌细胞表面HLA2I分

1　ChenL,AsheS,BradyWAetal.Costimulationofantitumorimmunity

bytheB7counterreceptorfortheTlymphocytemoleculesCD28andCT2LA24J.Cell,1992;71(7):1093～1102.

2　李增山,隋延仿,叶　菁etal.肝癌细胞稳定转染B7.1后的免疫

学特性J.细胞与分子免疫学杂志,2000;16(2):92

3　KorzeniewskiC,CallewaertM.Anenzyme2releaseassayfornaturalcyto2toxicityJ.JImmunolMethods,1983;:313

4　BretscherP.Thetwo2signalmodeloflymphocyteactivationtwenty2one

yearslaterJ.ImmunolToday,1992;13(2):74

5　GimmiCD,FreemanGJ,GribbenJGetal.HumanT2cellclonalanergy

isinducedbyantigenpresentationintheabsenceofB7costimulationJ.ProcNatlAcadSciUSA,1993;90:6586

6　OttesenSS,AhrenkielV,KielerJ.Recombinanthumaninterferongam2maexertsananti2proliferativeeffectandmodulatestheexpressionofhu2manleukocyteantigensA,B,CandDRinhumanurothelialcelllinesJ.CancerImmunolImmunother,1990;31(2):93

7　WormM,SchadendorfD,CzarnetzkiBM.Responsivenesstointerferon

treatmentofhumanmelanomacellscorrelatestoimmunophenotypeJ.MelanomaRes,1993;3(1):29

子的表达,有趣的是在刺激之后,HLA2I分子的表达

在数值上有所下降,但无统计学意义,这一点与一些

6

文献报道相驳,但亦有研究认为这是肿瘤细胞耐

[收稿2000207230　二次修回2001201209

(编辑　徐　杰)

・征文通知・第七届全国红细胞免疫学术大会征文通知

中国免疫学会红细胞免疫专业学组和中华医学会深圳分会及深圳中西医结合杂志等单位共同组织并决

定,2001年11月22～25日在深圳召开第七届全国红细胞免疫学术大会。现开始征文、征文内容:

11有关红细胞免疫研究的基础与临床;　　　　21有关红细胞免疫研究的新方法与应用;31有关中医药红细胞免疫学研究;41有关兽医红细胞免疫研究;51有关运动生理红细胞免疫研究;61有关动物生理红细胞免疫学研究;71有关国内外红细胞免疫不同研究领域的综述和专题报告。

征文来稿要求全文和摘要各一份,在2001年10月底前寄至上海市第二军医大学长海医院输血科血液免疫研究室郭峰收,邮编:200433;电话:25070280(O);25072541(H)。

优秀论文将在杂志上公开发表,参会者将签发继续教育国家一类学分,并欢迎有关企业参加,会上将请著名专家讲演有关新的理论和技术,无论文者亦可参会学习,可直接与上述地址联系。

中国免疫学会红细胞免疫专业学组

中华医学会深圳分会