抗氧化能力的测定（精选4篇）

抗氧化能力的测定（精选4

篇）

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DPPH抗氧化能力测定篇一

DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力

2.1 待测液的制备

将绿原酸(纯度56%)、维生素C和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL的无水乙醇溶液。

2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg绿原酸，定容到50ml，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml;

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mg/ml。

2.1.2 Vc母液的配制 称取 mg VC，定容到100ml，即可得到VC的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml。

2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸，定容到100ml，即可得到没食子酸的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml。 2.1.4 DPPH母液的配制 称取 mg DPPH，用无水乙醇定容到100ml，即可得到DPPH的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。CDPPH= mg/ml。（建议用0.025mg/mL） 2.2 DPPH.溶液的可见光谱

以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm下扫描。Amax= nm 2.3 抗氧化活性测定

DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm。当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来

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检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强

具体实验步骤及方法：

精确吸取的DPPH.溶液2mL与2ml无水乙醇混合均匀后，以相对应的溶剂(4mL无水乙醇)为对照，用分光光度计测定上述溶液在 nm处的吸光度值(A0)。 A0= 2.3.1 绿原酸样品溶液的抗氧化能力测定

精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL，分别与浓度 mg/ml的DPPH.溶液2mL混合，摇匀后放置30min。以相对应的溶剂(无水乙醇)为对照调零，用分光光度计分别测定上述溶液在 nm处的吸光度值(Ai)，分别测得Ai值。 A1 ；A2 ；A3 ；A4 ；A5 ；A6 ；A7 。

精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL，分别与2mL无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，用分光光度计分别测定各混合液在波长 nm处的吸光度值(Aj)，分别测得Aj值。

A1 ；A2 ；A3 ；A4 ；A5 ；A6 ；A7 。 将以上数据代入下列公式计算其清除率。 清除率SR(％)= 1- 其中，

Ai：为2mL绿原酸、维生素C和没食子酸与 2mL 的DPPH.

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溶液混合后在波长 nm处的吸光度值； Aj：为2mL绿原酸、维生素C和没食子酸分别与2mL无水乙醇溶剂混合后在波长 nm处的光值； A0：2mLDPPH.溶液与2mL无水乙醇溶剂混合后在波长 nm处的吸光度值。 [4.5]。 ⎛ ⎝Ai-Aj⎫⎪⨯100% ⎪A0⎭

小鼠总抗氧化能力的测定篇二

小鼠总抗氧化能力的测定 刘小美 宋菊敏 （2006-10-24） 一、原理

＋＋机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3还原成Fe2，后者可与菲啉类物质形成稳固的络

合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。 二、目的

1．掌握总抗氧化能力的测定方法。

2．观察血虚小鼠模型总抗氧化能力的变化。 3．观察中药对血虚小鼠模型总抗氧化能力的影响。 三、材料和方法

1．试剂：总抗氧化能力测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）

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2．材料：EF管（1.5ml） 120支，一次性试管（10ml）60支，移液器（P20ul、P100ul 、P1000ul）各2把及配套头各200支，玻璃比色皿（3ml，1cm光径）4只，温浴箱，分光光度计，漩涡混匀器1台，普通离心机大管、小管各1台，试剂瓶（125ml）1个，烧杯（150ml）2个，吸管（10ml）2支，吸球1支，量筒（200ml）1个，标签纸2张。 3．测定方法

（1）样本处理：取全血3500转/分离心15分钟得血清待测。

（2）试剂盒组成及配制：（50T） 试剂一：液体60ml×2瓶，40C保存。

试剂二：粉剂×2支，用时每支加双蒸水至120ml，室温保存。

试剂三：黄色贮备液10ml×1瓶，避光冷藏保存。贮备液得稀释液60ml×1瓶。 试剂三应用液的配制：临用前取贮备液以稀释液稀释，比例为1：19。需多少配制多少。 试剂四：溶液24ml×1瓶

试剂五：溶液24ml×1瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可使用）。——测组织中总抗氧化能力时用到，测血清时不用。

处测各管吸光度。（370C时，每分钟每毫升血清使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力

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单位）。 4）计算：

总抗氧化能力（单位/毫升血清）＝（测定管OD-对照管OD）÷0.01÷30×19 四、注意事项

1．室温放置10分钟后必须立即测定吸光度，否则吸光度会增加。

2．实验试剂用量较少，所以加量一定要仔细、准确。 3．每次加样后都必须在漩涡器上充分混匀。 4．难吸难打的试剂必须做到慢吸慢打。 五．思考题

1．小鼠血虚模型总抗氧化能力会出现什么样的变化？为什么会出现这样的变化？

2．怎样用本实验的结果解释模型动物的某些主要症状？ 1

测定抗氧化剂氧化能力的方法篇三

抗氧化剂抗氧化能力活性的研究

关键词：抗氧化剂；种类：测定方法;展望

概述：抗氧化剂是以一种可防止食品氧化而变质的添加剂。被广泛用于食品行业，消费数量逐年增加。本文主要

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概述一下食品工业中常用到抗氧化剂的种类及测定不同抗氧化剂的抗氧化能力的方法。

目前，食品行业中常用的抗氧化剂主要有2,6-二叔丁基甲苯（BHA）、叔丁基对羟基茴香醚（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）和生育酚（维生素E）。使用抗氧化剂时两种或两种以上抗氧化剂一起复配使用，或抗氧化剂与增效剂一起复配，其抗氧化效果较单独使用某一种抗氧化剂的效果好得多。

长期以来，饮食中的抗氧化剂倍受国内外学者的关注,这是主要是因为抗氧化剂具有如下作用: 首先，食物中的抗氧化剂能够保护食物自身,以免食物氧化损伤而变质;其次，抗氧化剂可以清除人体内的自由基,起到预防衰老、癌症和心血管疾病等作用；再者，被机体吸收的抗氧化剂还可以在机体内的组织器官中发挥作用; 最后，食物中的某些抗氧化剂可作为植物提取物或纯化物作为治疗药品。抗氧化剂的抗氧化活性测定的根本标准和目的就是最高限度地、客观地反映所测的抗氧化剂的抗氧化活性。这是一个非常大的课题,也是一个非常重要但是有很大难度的课题。笔者认为要用一种测定方法准确地反映某一种物质作为不同用途抗氧化剂的抗氧化活性是不可能的。如α- 生育酚、BHT、TBHQ 这三种抗氧化剂在油脂中是TBHQ的抗氧化活性最强;在乳浊液中,TBHQ 的抗氧化活性则变得最弱了,BHT 的抗氧化活性

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最强;而在高温煎炸条件下或在人体中α- 生育酚的抗氧化活性最强。所以,要全面评价一个抗氧化剂的抗氧化活性,必须同时作各种不同条件下抗氧化活性的研究。这在国内的实验室是很难做到的。所以对其抗氧化活性只能有针对性的进行测定。

目前常用的方法主要基于两类: ①通过测定样品抑制脂类物质氧化的能力来评定被测物的抗氧化能力(表1) ; ②用样品对人工生成的自由基的清除能力来反映待测物的抗氧化活性。

测定方法在抗氧化剂的抗氧化活性研究中有三要素:一是以什么作为基质体系来测定;二是以什么方式来加速;最后是用什么办法来指示氧化诱导期的终点。这三要素中的任何一要素改变都会使结果有所变化,甚至使得所测定各抗氧化剂的抗氧化活性顺序都会改变。所以实验人员要做的就是选择尽量能达到最佳效果的测量方法。 1.底物或底物体系

底物的选定对抗氧化剂抗氧化活性的测定很关键。首先要搞清楚所测抗氧化剂的目的。例如作为油脂抗氧化剂的底物,用的是哪一类油脂,是植物油还是动物油脂。我们知道一般植物油所含不饱和脂肪酸较多,而动物油脂含有较高的饱和脂肪酸。不同的抗氧化剂对饱和程度不同的油脂的抗氧化效果是不大一样的。例如,BHA 和BHT 对含高浓度的二十碳五

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烯酸和二十二碳六烯酸的鱼油几乎无抗氧化活性。但是TBHQ 则对这样的鱼油表现出很强的抗氧化活性。底物中是否含有变价金属离子和光敏剂对抗氧化剂抗氧化活性的测定也有很大的影响。一般的单一主抗氧化剂对含有高含量过度金属的油脂的抗氧化作用不大,但是如果同时加入一定量的金属螯合剂,如柠檬酸和EDTA ,则主抗氧化剂的抗氧化活性大大地增强。在有光敏剂存在的油脂中,在有光照的环境下,生育酚和胡萝卜素则比BHA 和BHT 表现出更强的抗氧化活性,因为它们是较强的光抗氧化剂。当底物是乳浊液时,抗氧化剂的抗氧化活性表现和在油脂中大不一样。因为在乳浊液中涉及到抗氧化剂在油和水中的分配比问题。例如在油中,TBHQ 的抗氧化活性远比BHA 和HBT 的高,而在乳浊液中则刚好反过来。这是因为前者大部分分配在水相中,不能对油脂起到有效的抗氧化作用;而后者大部分分配在油相中,对油脂

更能起到抗氧化作用。在低密度脂蛋白和一般的食品中,和在乳浊液中情况相似,只是更复杂些,因为里面的成分非常复杂,有蛋白质、纤维,变价金属离子。 2 加速方法

油脂中抗氧化剂的添加量通常为002%。即使在这个浓度下,TBHQ 也表现出很强的抗氧化活性,如果在常温下,以猪油为底物,则最少也要1.5～2 年才能得到最后的结果,这在

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大多数研究工作中是不现实的。在这种情况下使用各种加速氧化方法就产生出来了。(1)烘箱加温法是最经典也是最简单的加速方法。烘箱法的最大优点是设备简单,和实际情况比较接近。但是它的缺点也很突出:一是耗时长,二是操作复杂,劳累,三是要消耗大量的溶剂和试剂,并且有的溶剂和试剂有一定的毒性,最大缺点是一般烘箱的温度不好控制,波动范围大,故结果的精确度不高。(2)活性氧加速法(Active Oxygen Method ,或AOM) ,是在加温的基础上向试样里鼓热空气,以达到加速的目的。它的优点是测定时间比烘箱法短,它的缺点是由于需每小时取样测其过氧化值,研究者一直要守在旁边,直到试样的氧化诱导期结束。并且温度高,鼓入热空气,反应复杂,小分子抗氧化剂随热空气逸出试样,起不到相应的抗氧化作用。(3)由活性氧化法派生出来的方法有Rancimat 法和OSI(Oxidative Stability Instrument) 法,加速方法与活性氧化法一样,只是指示方法由测过氧化值改成了测电导,因而不但快速,而且全自动。不过在高温下,会使反应复杂化,一些本无抗氧化活性的物质具有了抗氧化活性,如脑磷脂和生育醌各自并无抗氧化活性,但是在80 ℃～140 ℃的条件下,却表现出抗氧化活性,并且随着温度的升高,其抗氧化活性也随之提高。而且在高温和鼓气的条件下,一些分子量小的抗氧化剂挥发掉了,起不到抗氧化作用,使之所测到的抗氧化活性偏低或甚至没有。(4)用紫外光来加速是近来研究的一个课题,目

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前还未得到推广。笔者认为,它对抗氧化剂的抗氧化活性的客观反映是很有限的。在有光敏剂的存在下,脂类所在的氧化反应是光氧化反应,与自动氧化反应的机理不一样。一般的抗氧化剂对光氧化无抗氧化活性。而在通常情况下,油脂和食品氧化主要是自动氧化。（5）利用自由基诱发剂来加速脂类的氧化反应速度也是近年来常用的手段。通常使用的是有机分子有水溶性的和脂溶性的，也有用变价金属离子的,如铁、铜、镍和钴等。用有机自由基诱发剂来加速反应时,诱发剂较快地分出大量自由基。这样,抗氧化剂的抗氧化能力主要体现在提供氢原子的速度,而抗氧化剂自身生成的自由基的稳定性则处于次要地位。这和体内体外的自动氧化反应是完全不同的。当用变价金属来加速时,金属离子是催化剂,它们能周而复始的作用。所以无强的螯合金属能力的主抗氧化剂在这种情况下几乎表现不出抗氧化能力,并且与这类主抗氧化剂的添加量关系不大。而强的螯合剂可完全将这类变价金属钝化。

氧化诱导期的指示方法

氧化诱导期的指示方法能否客观正确地反映底物的氧化诱导期的结束,对评价抗氧化剂的抗3 氧化活性也是非常关键的。最经典的方法是用碘量法测定过氧化物含量的变化。其原理是通过反应式1 和2 来实现。它是通过过氧化值对时间的变化曲线(PV - T 曲线) 来确定氧化诱导期。在氧化诱

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导期,过氧化物增长非常缓慢,PV - T 曲线很平。当氧化诱导期快结束时, PV- T 曲线出现一个拐弯,然后近似直线上升。其拐点即定义为氧化诱导期的终点。 ROOH + KI + H+ → ROH + I2 + H2O (1) I2 + Na2S2O3→ NaI + Na2S4O6 (2)

在常温下,该方法能较准确指示氧化诱导期的终点。该方法需用大量的有毒和有刺激性的有机溶剂四氯化碳,冰醋酸。操作烦琐,劳累。并且,过氧化物在煎炸高温下(180 ℃～210 ℃) 极不稳定,进一步反应生产非过氧化物。所以,在这种情况下,过氧化物的含量变化不能客观地指示抗氧化剂的抗氧化活性。硫酸亚铁法是利用过氧化物把二价的铁离子氧化成三价的铁离子,三价的铁离子和硫氰酸根形成的络合物在540 nm 处有强吸收:

Fe2+ + ROOH→ Fe3 + + ROH (3) Fe3+ + 6SCHˉ→ [ Fe (SCH) 6 ]3ˉ (4)

目前也有用共轭双键的测定来指示氧化诱导期的终点。一般油脂中,特别是植物油中,或多或少地存在一些多不饱和脂肪酸。在自动氧化过程中,有大量共轭二烯酸形成。共轭二烯酸在234 nm 有最大吸收。该法比碘量法操作简单,有一简单的紫外分光光度计即可。但底物中含太少的多烯酸,灵敏度低,最好不用此法。另一方法叫化学荧光法,它是通过过氧化物反应过程中发出的荧光来测定的,此法最大的特点是灵敏度高。

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增重法是利用底物吸氧后形成过氧化物增重的原理,该法简单易行,费用低。该法只适应于常温下的反应,且底物体系中无易挥发的物质,如有机溶剂或水,否则,结果不准确。氧压法的原理是在一个密闭的反应体系中,脂类和氧化反应生成过氧化物,则氧气的压力就见减小,根据氧压Po2 对时间的变化曲线(Po2 - T 曲线)

的变化来指示氧化诱导期的终点。该法也只适用于常温条件下的反应。高温下,部分分解产物形成的气体会干扰结果。电导法是70 年代开始推广的用来测定油脂以氧化定性和抗氧化剂的抗氧化活性。其原理是油脂形成过氧化物后会分解为低分子的酸,这些挥发性的低分子酸被热空气带到装有蒸馏水大接收瓶里。水里面的电导随着低分子酸增加而升高。这样,电 导(conductivity) - 时间期线(C - T 曲线) 就能指示氧化诱导期。这类仪器有两种,一是瑞士出的Ranci2mat ,另一种是美国产的Oxidative Stability Instrument(OSI) 。这类仪器最大的优点是全自动。尤其是OSI 适应于大规模天然抗氧化剂的筛选,高速快捷,操作成本低。感官测定法:人的味觉和嗅觉对一些有强烈性气味的物质的灵敏度要比气相色谱仪高百万倍。在食品和油脂工业中,有时会有远在氧化诱导期之前,或其过氧化值远在达到规定值之前就隐约能通过感 官测到变质的现象。所以有的学者提出该法是最好的测定方法。作者认为,此法是最切合实际的。但作为研究,该法也

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是有其局限性的。首先,人的感官测定主观性强,结果因人因时而异。为了得到一个客观实际的结果,往往需要十几个训练有素的专家品评,结果才能得到,并且重复性不如仪器好。再就是有的试样中有毒性强的物质,不宜用感官来品评。硫代巴比酸反应物(TBARS) 测定法是利用多不饱和脂肪酸在自动氧化过程中产生的丙二醛和硫代巴比酸反应生成红色物质,通过在525 nm 分光光度计测定丙二醛的含量。类似的方法还有茴香胺反应物法,它能测定出油脂自动氧化反应所生成的所有的醛的缩合反应在350 nm 处测定吸收。

克雷斯实验法(Kreis Test) 也可用来确定氧化诱导期。它主要是用间三苯酚和脂类酸败产物的环氧醛的颜色反应,用罗维朋比色。该反应对丙二醛也

有反应。气相色谱顶空法是根据油脂在氧化酸败的过程中有正己烷和正己醛产生,通过气相色谱法来测定某一小分子的变化来确定氧化诱导期的终点。该法较准确,有较好的重复性。但是,它只适合于常温下的反应。胡萝卜素漂白指示法也是近来较常用的一种方法,其优点是可以直观目睹底物的氧化,可用比色法来准确地测定底物的氧化情况,操作简单快速,成本底。但是由于胡萝卜素的加入,它本身有抗氧化活性或氧化催化作用,对抗氧化剂的抗氧化活性的测定有一定的干扰作用。

4 各方法的综合比较和评价

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综上所述,抗氧化剂的强弱是通过测定和比较它们在加入油脂或含有油脂体系中后其氧化稳定性增加的程度来确定的。目前使用较多的一个指数就是抗氧化系数(Oxidation rotection Factor - Pf) ,它被定义为加入抗氧化剂后的氧化诱导期( Induction Pe2riod - IPAntiox) 除以未加入抗氧化剂(空白) 的氧化诱导期( IPContr) :Pf = IPAntiox/ IPContr (7)如抗氧化剂的Pf 值愈高,说明它的抗氧化活性愈强。一般说来,判断某一物质有无抗氧化活性或有无催化氧化活性比较容易。例如Pf = 1 ,则该物质既无抗氧化活性也无催化氧化活性;如Pf 1 ,则表明该物质有抗氧化活性。但是,什 么情况下为明显的抗氧化活性,什么情况下为强的抗氧化活性,则就难以统一了。作者认为,在通常情况下,如2 E Pf > 1 ,则表明该抗氧化剂有抗氧化活性;如3 E Pf E2 ,则表明该抗氧化剂有明显的抗氧化活性;如Pf > 3 ,则表明该抗氧化剂有很强的抗氧化活性。为了方便比较各方法的优缺点起见,在表1 中列出以加速方法为主线各方法的比较。

诱导期的指示方法的客观性和有用性:感官评价> 顶空挥发物法> 吸氧法> PV 法> 增重法> 化学荧光法> 共轭双键法> 茴香胺反应物法> 硫氰亚铁法> 硫代巴比酸反应物法> 克雷斯实验法> 胡萝卜素漂白法> 电导法。综合以上研究和讨论可知,测定抗氧化剂的抗 氧化活性,一定要有针对性,如底物和体系,反应条件,是什么油,是单相油还是乳浊液;

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是在一般油脂,还是作煎炸油脂或焙烤油脂的抗氧化剂。这样,综合考虑来决定和设计测定抗氧化剂的抗氧化活性方法步骤和条件,从而得到相对正确的结果。

参考文献：

(1)抗氧化剂的研究及应用现状 李涛、余旭亚、陈朝银 2003

（2）抗氧化剂的功效及抗氧化剂体外分析评价 霞向东、吕飞杰、邰建祥 2001

（3）抗氧化剂的抗氧化活性的测定方法及其分析方法 翁新楚、吴侯 2000

（4）抗氧化剂抗氧化方法研究进展 徐清萍、钟桂芳、孟军 2007

（5）抗氧化剂抗氧化活性的测定及分析方法 韩飞、周孟良、钱建亚、于婷婷 2009

（6）抗氧化剂抗氧化活性测定方法 王会、郭丽、谢文磊 （7）抗氧化剂作用机制的研究 黄进、杨国宇、李宏基、熊程辉、李留安、吴玉臣

（8）抗氧化能力测定方法的研究 张丽平、童荣华 2004 （9）

FRAP法测定Vc抗氧化能力篇四

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使用说明：

1. FRAP工作液的配制：

(1) 参考下表，根据待测定样品的数量(含标准曲线)配制适量的FRAP工作液： TPTZ稀释液

TPTZ溶液 1个检测 150μl 15μl 5个检测 750μl 75μl 10个检测 1500μl 150μl 20个检测 3000μl 300μl 50个检测 7500μl 750μl

充分混匀后再加入检测缓冲液 检测缓冲液

FRAP工作液 15μl 180μl 75μl 900μl 150μl 1800μl 300μl 3600μl 750μl 9000μl

FRAP工作液配制后37℃孵育，并宜在1-2小时内使用完毕。

2. 待测样品的准备：

(1) 血清、血浆、唾液或尿液样品的准备：

血清、血浆、唾液或尿液样品每个样品需要5微升，都可以直接用于测定。血清、血浆、唾液或 尿液样品都可以使用新鲜样品进行测定，也可以-80℃冻存后再进行测定。-80℃冻存的样品至少 在一个月内所测定获得的数据没有显著变化。注意：血浆制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗 凝，不

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宜使用EDTA抗凝。根据文献报道，人血清或血浆中的总抗氧化能力为0.5-2mM，人唾液中 的总抗氧化能力为0.3-1mM，人尿液中的总抗氧化能力为0.2-3mM。 (2) 细胞或组织样品的准备：

对于细胞样品，收集约100万个细胞(不必精确计数，直接刮下，不宜使用胰酶和EDTA消化)，放 置在200微升冰冷的PBS或HBSS溶液中，匀浆或超声以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物，4℃ 约12000g离心5分钟，取上清用于后续测定。对于组织样品，每20mg组织加入100微升冰冷的PBS 或HBSS溶液，匀浆或超声以充分破碎组织并释放其中的抗氧化物，4℃ 约12000g离心5分钟，取 上清用于后续测定。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品的上清如果 不立即用于测定，可以在-80℃冻存。-80℃冻存的样品至少在一个月内所测定获得的数据没有显 著变化。细胞或组织样品在测定总抗氧化能力时需同时测定蛋白浓度，最后测定获得的总抗氧化 能力通常表示为每毫克或每克蛋白重量中的总抗氧化能力，表示单位为mmol/mg或mmol/g。 (3) 其它样品的准备：

植物或中草药抽提液都可以直接用于检测。需注意样品本身的颜色不会干扰检测。植物或中草药 抽提液的抗氧化能力可以表示为每毫克或每克抽提物干重中的总抗氧化能力，

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表示单位为

mmol/mg或mmol/g。各种抗氧化物测定其抗氧化能力时，通常配制成0.15-1.5mM，然后进行测 定。抗氧化物的浓度可以以摩尔浓度表示时，测定获得的总抗氧化能力可以用相对总抗氧化能力 进行表示，例如0.5mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的亚铁盐测定获得的OD值相同，则其

相对总抗氧化能力为2，再如0.2mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的亚铁盐测定获得的OD 值相同，则其相对总抗氧化能力为5。 3. 标准曲线测定的准备：

称取27.8 mg本试剂盒提供的FeSO4•7H2O，溶解并定容到1 ml，此时浓度即为100 mM。取适量100 mM FeSO4溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。通常可以使用蒸馏水或样品配制溶液配制标 准品。对于血清、血浆、唾液或尿液样品推荐直接用蒸馏水或PBS配制标准品；对于细胞或组织样 品，推荐用用于细胞或组织匀浆的溶液配制标准品，其它样品参考前述方法进行。FeSO4溶液宜新鲜 配制使用。100 mM FeSO4溶液容易氧化产生三价铁盐，使溶液的颜色从最初的淡绿色逐渐转变为浅 黄色。如果发现溶液的颜色已经呈现明显的黄色，应该弃用该溶液，并使用试剂盒提供的

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FeSO4•7H2O重新配制新鲜的FeSO4溶液。 4. 总抗氧化能力的测定：

(1) 96孔板的每个检测孔中加入180微升FRAP工作液。 (2) 空白对照孔中加入5微升蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入5微升各种浓度的FeSO4 标准溶液；样品检测孔内加入5微升各种样品或0.15-1.5mM的Trolox作为阳性对照。轻轻混匀。

(3) 37℃孵育3-5分钟后测定A593。如果测定A593有困难，也可以在585-605nm范围内进行测定。

(4) 根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。如果样品测定出来的吸光度在标准曲线范围以外，需 把样品适当稀释后再进行测定。

(5) 总抗氧化能力的表示方式：对于FRAP方法，总抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度来表示。例 如某血浆样品测定获得的吸光度和1mM FeSO4标准溶液的吸光度相同，则该血浆样品的总抗氧化 能力即为1mM；再如某血清样品测定获得的吸光度和0.65mM FeSO4标准溶液相同，则该血清样品 的总抗氧化能力为0.65mM；再如某细胞匀浆液测定获得的吸光度和0.3mM FeSO4标准溶液相同， 并且该匀浆液的蛋白浓度为0.15mg/ml，则该细胞样品的总抗氧化能力为0.3mM/0.15mg/ml，即 2mmol/g；再如0.2mM的某抗氧化物其测定获得的吸光度和1mM的亚铁盐测定获得的吸光

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度相同， 则其相对总抗氧化能力为5。

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