一、实验目的：
1、了解植物组织中叶绿素分布及性质。 2、掌握测定叶绿素含量的原理和方法。 3、了解紫外分光光度计的用法。 4、了解一阶导数的含义。
5、了解如何如何排除互相干扰。
二、实验原理：
叶绿体中的色素都能够溶解于有机溶剂丙酮中，所以，可以用丙酮提取叶绿体中的色素。
层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂。根据叶绿体中的四种色素在层析液中的溶解度不同来进行分离，溶解度高的在滤纸上扩散的快，溶解度低的扩散地慢。溶解度最高的是胡萝卜素，它随层析液在滤纸上扩散得最快，叶黄素和叶绿素a的溶解度次之；叶绿素b的溶解度最低，扩散速度最慢。这样，四种色素就在扩散过程中分离开来。
叶绿素a和叶绿素b的分子结构相似，它们的吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱重叠，用常规分光光度法和荧光方法难以实现其同时测定。但利用一阶导数光谱技术和同步荧光技术，消除了叶绿素a和叶绿素b的光谱干扰，可以同时测定它们的含量。
在600~700之间胡萝卜素一阶导数为零，没有吸收，在某个特定波长下，叶绿素a有一定的导数值，而叶绿素b的导数为零；同理，在另一个特定波长下，叶绿素b有一定的导数值，而叶绿素a的导数值为零。这样可以实现叶绿素b和叶绿素b的同时测定，又不受胡萝卜素的干扰。
三、实验材料：
1、仪器
干燥的定性滤纸、烧杯（100ml）、研钵、玻璃漏斗、分液漏斗、剪刀、小试管、试剂瓶、药勺、量筒（10ml)、天平、试管架、载玻片、铅笔、直尺、棉花、移液管、洗耳球、毛细吸管、铁架台、胶头滴管、紫外分光光度计。 2、药品
新鲜的菠菜叶、石英砂、碱式碳酸镁、90％丙酮、层析液（石油醚：丙酮：苯=20:2:1）
四、实验方法与步骤：
1．提取叶绿素中的色素
（1）取几片绿叶，去掉主脉，用天平称取20g叶片，剪碎，放入研钵。 （2）向研钵中加入少许二氧化硅和碳酸钙，进行充分的研磨。用量筒量取15ml丙酮。倒入研钵中，迅速充分研磨。
（3）将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤 。将滤液收集到一个小试管中，及时用棉塞将试管塞紧。 2.制备过滤纸
取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长6cm，宽1cm的滤纸条，
在距滤纸条一端1cm处用铅笔画一条细的横线。 3.画滤纸细线
用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀画出一条细而直的滤液细线。待滤液干后，再画2~3次。
4.分离叶绿体中的色素
将25ml层析液倒入烧杯中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）略微斜靠着烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，随后用培养皿盖盖上烧杯。 五、注意事项
1、叶绿体色素对光、温度、氧气、酸碱及其他氧化剂都非常敏感。色素的提取和分析一般都要在避光、低温及无干扰的情况下进行。提取液不易长期存放，必要时应抽干充氮避光保存。
2、在导数分光光度法测定时，各组测得的最大吸收波长和一阶导数测定波长可能略有不同，应以自己测得的为准。
3、色素提取液可能含有不溶物（如植物组织），色谱分析时必须出去。
4、每完成一种试液分析后，应用丙酮等溶剂将比色皿和胶头滴管彻底清洗干净，否则会引起样品残留，影响下一个样品的分析。
叶绿素a和叶绿素b含量的测定
六、思考题
1,、画滤液细线时要细而直，而且要重复几次，为什么要这样操作？
答：画滤液细线时细而直，是为了避免分离后的色素带之间发生重叠；重复画是为了增加色素带的含量，使分离后的色素带更清晰
2、为什么一定不能让滤纸上的滤液细线接触到层析液？
答：应为层析液会溶解色素，如果滤液线接触到层析液，滤液线上的色素就会溶解在层析液中，而无法分离。
