分光光度法测定大蒜提取物中硫代亚磺酸酯含量_李瑜

CHINACONDIMENT2004年7月

中国调味品No.7

Jul.2004

43

文章编号:1000-9973(2004)07-0043-06

分光光度法测定大蒜提取物中

硫代亚磺酸酯含量

李瑜,许时婴

(江南大学食品学院,江苏无锡　214036)

摘要:硫代亚磺酸酯是大蒜中的活性成分,由大蒜中非蛋白质氨基酸———蒜氨酸(alliin)经内源酶蒜氨酸酶(alliinase,蒜氨酸裂合酶,EC4·4·1·4)的酶解作用而生成的。介绍了一种利用L-半光氨酸和DTNB检测新鲜大蒜及大蒜提取物中硫代亚磺酸酯的分光光度法。此方法具有简便,快速和灵敏度高的特点。

关键词:大蒜;大蒜提取物;硫代亚磺酸酯;5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)中图分类号:TS207　　　文献标识码:C

Abstract:Thiosulfinafesarethebestknownbiologicalactivecompoundofgarlic.Itisgeneratedupontheinteractionofthenonproteinaminoacidalliinwiththeenzymealliinase(alliinlyase,EC4.4.1.4).Inthispaperithasdescribedasimplespectrophotometricassayforthedeterminationoftotalthiosulfi-natesinfreshgarlicandgarlicextractusingCysteineandDTNB.Thismethodisveryeasy.fastandsensitive.

Keywords:garlic;garlicextract;thiosulfinates;5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoicacid)(DTNB)

1　前言

大蒜的经济和医疗价值很高,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血压、防治心脑血管疾病、提高机体免疫力、降血糖、解毒等多种生物活性功能[1-11],而大蒜所具有的许多生物功效都归因于有机硫化物特别是硫代亚磺酸酯类(R-S-S(O)-R)。蒜素(二烯丙基硫代亚磺酸酯)是最主要的硫代亚磺酸酯类,大约占破碎大蒜所形成的总硫代亚磺酸

[12,13]

酯的70%。所有的硫代亚磺酸酯都具

年,ArthurStoll和EwaldSeebeck发现蒜素等硫代亚磺酸酯是在大蒜被切割或挤压条件下,由大蒜中含量丰富的非蛋白质氨基酸———蒜氨酸(alliin)前体经内源酶蒜氨酸酶(alliinase,蒜氨酸裂合酶,EC4·4·1·4)的酶解作用而生成的(见图1)。完整无损的大蒜,其蒜氨酸和蒜氨酸酶各存在于大蒜的不同部位,只有当大蒜破损或捣碎,使两者相互接触方能水解生成蒜素及其它硫代亚磺酸酯[14]。最近的研究表明,硫代亚磺酸酯所具有的绝大多数生物活性功能都与它们强烈的巯基修饰及抗氧化特性有关[15,16]。

有和蒜素相同的生物活性功能[13]。1948

　　收稿日期:2004-01-08

作者简介:李瑜(1976-),女,河南商丘人,食品科学与工程博士研究生。

44　　　　　　　　　　　　　　　　　中国调味品总第305期

两分子的S-AMC(C3H5-S-S-CH2CH(NH)。其它硫代亚磺酸酯也同蒜2COOH)素一样可以很快地与两分子半胱氨酸反应。采用过量的半胱氨酸先与硫代亚磺酸酯反应,反应剩余的半胱氨酸再与过量的巯基试

图1　蒜素的生成

剂—5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)反应生成呈色的2-硝基-5-硫代苯甲酸(NTB),然后在412nm处测定反应前后半胱氨酸浓度的变化,硫代亚磺酸酯的浓度即为半胱氨酸在DTNB/NTB体系中浓度减低的一半,从而得到硫代亚磺酸酯的含量。在大蒜中硫代亚磺酸酯是可以与半胱氨酸反应达到检测限的唯一组分,且大蒜中也不含可检测到的自由巯基,因而不会干扰此测定方法[13]。

Cthiosulfinates(mmol/mL)=(ΔA412×β)/(2×14150)

β—半胱氨酸溶液的稀释倍数

ΔA412—与硫代亚磺酸酯反应前后半胱氨酸吸光值之差

　　大蒜提取物及大多数大蒜制品例如国外

销售的含有蒜粉的药片和胶囊的质量,都是以其硫代亚磺酸酯(或蒜素)的含量来评定的。所以硫代亚磺酸酯可以作为评定蒜制品质量的重要参数,因而硫代亚磺酸酯的测定也显得至关重要。目前测定硫代亚磺酸酯的方法很多,化学分析方法中主要有定硫法和汞沉淀法,这是国内普遍采用的方法,其测定很粗略且步骤繁琐;仪器分析方法主要有高效液相(HPLC)、气相(GC)、气-质联用(GC-MS)、液-质联用(LC-MS)以及核磁

[17,18,19,20,21]

共振(NMR)等,这是国外常采用的分析方法,但由于其设备昂贵,所以一般的实验室很少采用。

Lawson于1995年提出了一种利用分光光度法定量测定蒜素及大蒜中的硫代亚磺酸酯,该法将纯品蒜素作为目标测定物进行了测定并与高效液相(HPLC)的测定结果进行了比较,两种方法的测定结果相关性很好,而且灵敏度很高,可达到微摩尔级[13]。

一般高效液相和气相色谱测定蒜素含量时需要纯品蒜素做外标物以及八种硫代亚磺酸酯的摩尔消光系数,而分光光度法不需蒜素做外标物。且在测定硫代亚磺酸酯含量时非常灵敏,可以精确到微摩尔的水平。

测定原理:一分子光胱氨酸可以和一分子5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB,也称Ellman试剂、巯基试剂)反应生成一分子2-硝基-5-硫代苯甲酸(NTB)(见图2),NTB在412nm处具有最大吸收,摩尔消光系数为14150(1cm的光径)。蒜素也可以和半胱氨酸的自由巯基反应,一分子蒜素可以很快地与两分子半胱氨酸反应生成图2　2-硝基-5-硫代苯甲酸(NTB)的生成

Lawson法的测定过程如下:20mM的半胱氨酸分别与不同浓度的纯品蒜素(1～4mM)在26℃下保温10min,取5μL反应液于试管中,加入995μL含有150μMDTNB的50mM的Hepes缓冲液(pH7.5),26℃保温10min后,于412nm处测吸光度。本文对Lawson的方法进行了改良。由于5μL的取样量准确与否将会产生很大测定误差,故改变半胱氨酸及DTNB的浓度,使得二者的取样量都在毫升的数量级,且使半胱氨酸与乙第7期　　　　　　　检验技术　分光光度法测定大蒜提取物中硫代亚磺酸酯含量45

醇提取液的反应液取样量远远大于DTNB(过量)的取样量以减少误差。其次是延长反应时间,由于在26℃下保温10min后测定,发现吸光度值随时间而降低,表明10min反应不够完全,也会造成测定误差。故延长反应时间,发现吸光度值随时间而降低,表明10min反应不够完全,也会造成测定误差。故延长反应时间,保温15min后测定,这时吸光度值保持恒定。由于纯品蒜素浓度是已知的,乙醇提取液中硫代亚磺酸酯的浓度是未被确定的,半胱氨酸量过多过少都会影响测定结果,半胱氨酸含量过少,不能和所有的硫代亚磺酸酯反应,半胱氨酸含量过多,将超出分光光度法的测浓度范围。必须确定合适的半胱氨酸含量,使测定的吸光度值在0.2～0.7。

称一定量的L-半胱氨酸,使之溶解于50mMpH7.5的Hepes缓冲液中,制备10mM左右的半胱氨酸溶液。半胱氨酸溶液的准确浓度通过测定与DTNB反应生成NTB,在412nm下的吸光度值计算得到。2.4.3　DTNB溶液的制备

准确称取一定量的DTNB,使之溶解于一定体积50mMpH7.5的Hepes缓冲液中,制备成1.5mM的DTNB溶液。

2.4.4　新鲜大蒜中硫代亚磺酸酯含量的测定

新鲜大蒜去皮后通过机械粉碎,在50mMpH7.5的Hepes缓冲液中悬浮10min(2g/10mL),通过抽滤,检测滤液中硫代亚磺酸酯含量。

2.4.5　大蒜乙醇提取液中硫代亚磺酸酯的测定

乙醇浸提后的蒜泥经布氏漏斗抽滤,取滤液直接检测硫代亚磺酸酯的含量。

2　实验材料与方法

2.1　实验材料

市售山东无苔大蒜无水乙醇(分析纯)2.2　主要试剂

5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)(比利时进口分装)

L-半胱氨酸(生化试剂)Hepes(Sigma公司进口分装)2.3　主要仪器

722分光光度计打浆机恒温振荡水浴2.4　实验方法

2.4.1　硫代亚磺酸酯提取

3　结果与讨论

3.1　新鲜大蒜中硫代亚磺酸酯含量的测定3.1.1　半胱氨酸溶液的初始吸光度值

取10mM左右的半胱氨酸溶液5mL于试管中,加1mL去离子水,摇匀后取1mL于100mL容量瓶中,加水至刻度。取稀释100倍的半胱氨酸溶液4.5mL与DTNB溶液0.5mL,在26℃下保温15min后,在412nm波长下测定其初始吸光度值(A0)。3.1.2　与蒜汁反应后半胱氨酸溶液的吸光度值

取10mM左右的半胱氨酸溶液5mL,加入1mL蒜汁,在26℃保温15min后,取1mL反应混合液于100mL容量瓶中,加水至刻度。取稀释100倍的反应混合液

2.4.2　半胱氨酸溶液的制备

4.5mL与DTNB溶液0.5mL在26℃下保温15min后,在412nm波长下测定其初始46　　　　　　　　　　　　　　　　　中国调味品总第305期

吸光度值(A)。

3.1.3　新鲜大蒜中硫代亚磺酸酯的含量测定的平行试验

ΔA412=A0-A

Cthiosulfinates(mmol/mL)=(ΔA412×β)/(2×14150)

该法灵敏度极高,取样量准确性对测定结果有很大影响。Lawson取样量为5微升,由于取样不准确使测定结果的重现性很差,这样就使该法测定灵敏度高这一优点变为致命的缺点。由表1可以看出,方法良前采用微升级取样,由于在一般的实验条件下,平行试验中各次取样量的准确性达到要求,使得测定结果的离散程度也很大,标准偏差为0.1878,变异系数为6.994%,大于5%。采用本法测定中不仅吸光值保持在0.2～0.7之间,而且硫代亚磺酸酯的含量测定的离散程度很小(见表2),标准偏差为0.0098,变异系数为0.375%,小于5%。

3.2　大蒜乙醇提取液中硫代亚磺酸酯的测定3.2.1　半胱氨酸溶液的初始吸光度值

(同3.1.1)

3.2.2　与乙醇提取液反应后半胱氨酸溶液的吸光度值

取配置成10mM左右的半胱氨酸溶液5mL,加入1mL乙醇提取液,在26℃下保温15min后,取1mL反应混合液于100mL容量瓶中,加水至刻度。取稀释100倍的反应混合液4.5mL与DTNB溶液0.5mL在26℃下保温15min后,在412nm波长下测定其初始吸光度值(A)。

3.2.3　大蒜乙醇提取液中硫代亚磺酸酯的含量测定

在乙醇提取前,蒜泥先在30℃下经内源酶蒜氨酸酶(alliinase,蒜氨酸裂合酶,EC4·4·1·4)酶解10min,乙醇浸提2h,浸提温度25℃,料液比1∶5,振荡速度150转/分的浸提条件下,重复测定4次。结果见表3。

表1　Lawson法测定新鲜大蒜中硫代亚

磺酸酯的含量

平行试验号

1

234平均值标准偏差变异系数(%)

ΔA412值0.221

0.2110.2330.2480.2280.01596.974

100g蒜中硫代亚

磺酸酯的含量(mmol)

2.6032.4852.7442.9212.6850.18786.994

表2　经改良的Lawson法测定新鲜大蒜中

硫代亚磺酸酯的含量

平行试验号

1

234平均值标准偏差变异系数(%)

ΔA412值0.221

0.2230.2220.2220.2220.00080.360

100g蒜中硫代亚

磺酸酯的含量(mmol)

2.6032.6272.6152.6152.6150.00980.375

表3　大蒜乙醇提取液中硫代亚磺酸酯的含量测定平行试验号

12

34平均值标准偏差变异系数(%)

ΔA412值0.1560.155

0.1540.1550.1550.00080.360

100g蒜中硫代亚

磺酸酯的含量(mmol)

1.8381.8261.7841.8261.8260.02371.298

　　由表3可以看出,经改良的Lawson测定方法对大蒜乙醇提取液中硫代亚磺酸酯的含量测定的重现性同样很好,离散程度非常小,标准偏差为0.0237,变异系数为1.298%,小于5%。可见改良后的Lawson第7期　　　　　　　检验技术　分光光度法测定大蒜提取物中硫代亚磺酸酯含量47

测定方法测定准确度很高,可以用于乙醇提取工艺中测定硫代亚磺酸酯提取率及其含量,用于乙醇提取硫代亚磺酸酯最佳工艺的确定。

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Lawson提出了一种利用分光光度法定量测定蒜素及大蒜中总硫代亚磺酸酯,此测定方法具有快速、方便、廉价和灵敏度高的优点,但缺点是测定重现性不好。本文对Law-son法进行了进一步的改良,不仅提高了测定的准确性和重现性,而且可应用于大蒜乙醇提取物中硫代亚磺酸酯的定量测定,也同样适用于其它大蒜提取物中总硫代亚磺酸酯的定量测定。这样就解决了长期以来没有一个简便且准确测定硫代亚磺酸酯的方法的问题。

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(上接第42页)障率低,能有效保障滤后产品合格率稳定在可控水平。

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菌,滤前、滤后酱油主要理化指标无显著变化,滤后酱油澄清度良好,由于没有经过高温灭菌,避免了加热灭菌时产生的焦糖味、苦涩和酸味,保持了生晒酱油的纯正风味,经分等级配兑后(不需要沉淀)即可直接灌装或上市销售。

4.3　应用板框压滤机过滤除菌是在常温或巴氏温度下进行的,工艺流程简单,较酱油生产过程常规巴氏灭菌工艺而言,节约了煤耗,减少了沉淀设备,缩短了工艺流程,有利于生产过程节能降耗。BMJ系列(食品级)增强聚丙烯板框压滤机,结构简单,操作方便,故