叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定
食品092
一、实验目的： 二、产品验收指标 项目和指标
───────────────┬────────── 项 目 │ 指 标
───────────────┼────────── pH │ 9.0～10.7 1％ │
E 405nm ≥ │ 568 1cm │
消光比值 │ 3.2～4.0 总铜(Cu),％ │ 4.0～6.0 游离铜(Cu),％ ≤ │ 0.025 砷(As),％ ≤ │ 0.0002 铅(Pb),％ ≤ │ 0.0005 干燥失重,％ ≤ │ 4.0 硫酸灰分,％ ≤ │ 36.0
───────────────┴──────────
三、实验原理: 四、仪器和试剂 （一）、试剂：
1、蚕沙（50克） 2、95%乙醇 3、NaOH 溶液 4、稀盐酸 5、丙酮 6、石油醚 7、CuSO4 溶液 8、蒸馏水 9、40%乙醇(纯乙醇与蒸馏水按2:3配) 10、5%NaOH-乙醇溶液 11、pH试纸 12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5） 取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合 （二）、仪器：
A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成
1、温度计 1支 回流冷凝管 1支 500ml 圆底烧瓶 1个 恒温槽 1台 滤瓶及漏斗 1个 胶头胶管 1个 玻璃棒 1支 100mL量筒 1个 铁架台 1台 电热恒温水浴装置 1套 2、减压蒸馏装置 1台 3、台氏天平 1台 4、PH试纸 若干 B、叶绿素铜钠质量分析 1、751分光光度计 1台
2、台式天平、分析天平 各1台
3、玻棒 1支 胶头滴管 1支 10mL、50mL量筒 各一个 100mL 、50mL容量瓶 各1个
25mL、1mL吸量管 各一支
4、试纸 若干 吸耳球 一个 五、实验步骤
（一）叶绿素铜钠的合成 1、叶绿素的提取：
（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。
（2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60℃（防止叶绿素a和b分解），浸泡提取2小时，滤出提取液。 （3）按步骤2用乙醇重复2次。
（4）合并3次提取液，在减压、不超过60摄氏度下蒸出乙醇。趁热倾出瓶中液体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）。 2、皂化：
将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-C2H5OH溶液调节使其pH=11，用水浴加热在60℃下皂化回流1小时。 3、萃取：
将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取上层液检验是否完全皂化：取上层液少许置于小烧杯中，加入2—3倍石油醚静置，用玻棒沾取上层液去试纸上，呈绿色则不完全皂化。取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。平行萃取3次。
4、调酸铜代：
将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后，加入10%的硫酸铜10ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60℃下保温搅拌1小时。
趁热过滤，用95%乙醇洗涤3次后抽干。合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水，析出叶绿素铜，静置过夜后过滤，滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+、
及残留的叶黄素和其
他有机杂质。 5、成盐：
洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH=11，搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐），将其在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。 流程图:
溶 剂 NaOH溶液 不皂化物 溶剂 酸 CuSO4溶液 滤渣
↓ ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓
蚕砂 → 预处理→浸 提→ 皂 化→ 分 离→ 萃 取→调pH值→铜 化→ 过 滤→
水 稀酒精 NaOH
↓ ↓ ↓
→离 析→ 沉 淀→ 烘 干→ 纯 化→ 成 盐→ 过 滤→ 干 燥→ 成品
（二）、纯度分析：
1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线
称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标准曲线。
2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线
称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm， 吸光比A405nm/A630nm 为3.2～4.0。用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。 3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定
称取烘干成品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。从容量瓶中准确取2mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm。用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。 六、实验现象 试验操作 试验现象 备注 称取蚕沙50g 加入去离子水浸润和95%乙醇 60℃搅拌回流2h 抽滤，保存滤液 墨绿色 蚕沙部分溶解 得到呈墨绿色的液体 提高产率 防止污染 循环利用 皂化过程 剩余蚕沙用95%乙醇再次回流2次 得到呈墨绿色的液体 抽滤，混合三份滤液 水浴，减压蒸馏，把合并滤液放得约50mL左右溶液，溶液入旋转蒸发仪，并在55℃水浴中 成糊状，蒸发液呈无色 加热蒸馏回收95%乙醇 在浓缩液中加5% NaOH-乙醇调PH值到11，在温度为60℃， 皂化时为1h 溶液出现小气泡
皂化后，并洗涤加HCl调，PH＝7PH试纸变红色此时慢慢出 加入10%CuSO4调PH＝2-－3，在现胶状墨色悬浮物 搅拌下温度60℃，保持1 h左右 趁热过滤，滤渣先用水洗去，再用95%乙醇洗涤3次后抽干。合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水， 静置过夜后过滤 得墨绿色物质 洗涤液呈绿色 固体溶解得绿色液体 得墨绿色粉末 叶绿素铜酸 叶绿素铜钠 滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次，放进烘箱中烘干 石油醚层变为浅绿色 以除去其中的H+ Cl及残留的叶黄素和其他有机杂质。 称取0.010g叶绿素铜钠溶于蒸 略有胺味 馏水配成0.1%溶液，再稀释25除去水分得墨绿色结晶物 结晶物0.0483g 倍，测其pH值 七、实验数据与处理 一、标准叶绿素铜钠盐标准曲线
标准曲线的测定方法：取标准样品配制0.1%叶绿素铜钠盐溶液，用移液管分别精确量取2.5 mL；2.0mL；1.5mL；1.2mL；1.0mL；0.5mL移至5个加入100mL的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液，摇匀定容至刻度，即0.0025%；0.002%；0.0015%； 0.001%；0.0005%。以缓冲液作空白对照，分别测以上溶液在波长405nm下的吸光度值A405 。如表1、图1所示。
表1 叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm） 溶液百分数（%） A405 0.0005 0.198
0.001 0.362
0.0015 0.552 0.002 0.716 0.0025 0.924
二、叶绿素铜钠盐的吸收曲线
（一）标准样品：
取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。测定数据如表2所示，吸收曲线如图2所示。
表2 标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表 波长350 355 360 365 370 375 380 385 390 /nm 吸光度 0.142 0.150 0.157 0.166 0.177 0.197 0.217 0.259 0.292 波长395 400 405 410 415 420 425 430 435 /nm 吸光度 0.327 0.357 0.379 0.377 0.338 0.272 0.213 0.169 0.139 波长440 445 450 455 460 465 470 475 480 /nm 吸光度 0.119 0.104 0.092 0.083 0.074 0.067 0.060 0.055 0.050 波长485 490 495 500 505 510 515 520 525 /nm 吸光度 0.047 0.044 0.042 0.041 0.040 0.039 0.038 0.037 0.037 波长530 535 540 545 550 555 560 565 570 /nm 吸光度 0.038 0.039 0.039 0.039 0.039 0.037 0.036 0.040 0.043 波长575 580 585 590 595 600 605 610 615 /nm 吸光度 0.040 0.042 0.043 0.043 0.043 0.041 0.043 0.046 0.052 波长620 625 630 635 0 5 650 655 660 /nm 吸光度 0.059 0.067 0.071 0.069 0.0 0.057 0.049 0.044 0.039 波长665 670 675 680 685 690 695 700 /nm
吸光度 0.035 0.032 0.029 0.026 0.024 0.021 0.019 0.017
（二）产品：
取产品配制0.004%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。测定数据如表3所示，吸收曲线如图3所示。
数据记录: 1、产品的质量是0.0483g（借第12组：冯奕淇和雷春雨的实验结果）
2、产品产率：W=0.0483/50*100%=0.0966% 3、吸光比=A410nm/A630nm=0.065/0.037=1.8
表3 产品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表 波长350 360 370 380 390 400 410 420 430 /nm 吸光度 0.068 0.0 0.060 0.058 0.061 0.062 0.065 0.0 0.057 波长440 450 460 470 480 490 500 510 520 /nm 吸光度 0.051 0.047 0.043 0.039 0.038 0.036 0.035 0.033 0.034 波长530 540 550 560 570 580 590 600 610 /nm 吸光度 0.034 0.034 0.033 0.033 0.032 0.033 0.035 0.035 0.035 波长620 630 0 650 660 670 680 690 700 /nm 吸光度 0.035 0.037 0.037 0.035 0.036 0.035 0.038 0.037 0.035
八、实验分析
本实验所测得的吸光值相对较小，对比于标准的吸光曲线，在波峰（405nm与630nm）处的值仅为0.065和0.037，比标准吸光曲线的值小了4--5倍。其中的原因可能为： 所制备的产品的原因:一个原因是产品的纯度较低；二个是可能产品没
有完全烘干，实际用于配制溶液的产品的质量小于称量的质量。配制溶液的原因:由于产品纯度较低，所以相应的用于配制溶液的产品的质量也应该增多，而配的溶液的含量较小，这可能就造成了所测得的吸光度较小的原因。 实验失败的原因：
1、蚕沙不过粉碎，可能导致叶绿素溶解不过充分，加乙醇回流时，时间2小时每次，因浸提不充分，浸提时间不够会导致提取率过低。
2、皂化1小时后，用石油醚萃取，上层杂质还是绿色，可能是皂化时间不够，
这步导致了大量叶绿素的流失，以致最终产率只有微量而无法配置叶绿素溶液测吸光度。
3、整个实验过程中洗涤与过滤次数较多，而叶绿素盐粘稠易粘附在滤纸上，很不容易取下，且在洗涤过程也有叶绿素盐的损失。以上两项操作直接影响到产率的高低。
4、调酸铜代这步时，由于保温后趁热过滤时过滤速度比较慢，还没过滤完就用95%的乙醇边洗涤变过滤，乙醇作用是析出叶绿素的，这就导致了大量的叶绿素留在滤渣里，而我们实验要的是滤液。
5、调酸铜代这步时，由于静置过夜后进行减压过滤，由于叶绿素铜分子太小，滤纸并不能完全的保留住其在滤饼里而流失过多，使最终产率很少。
6、在成盐这步时，加入缓冲液调pH时，由于滴加速度控制不好，使pH超过12，后又用
稀盐酸调到PH=11.55；成盐时静置半个钟以上不定期检测是否完全成盐，可是用玻棒点些许溶液放在滤纸一直都是显淡淡的绿色，这两方面可能导致成盐效果不好。这也是产率低的关键因素之一。
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