第６６卷第９期 ２０１５年９月 Ｈｕ 化工 学报 、，０１．６６ Ｎｏ．９ ＣＩＥＳＣ ＪｏｕｍａｌＳｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１５ 一研一 一究～ 一论一 一文一 糖基化改造 一葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性 王小艳 ，樊艳爽 ，韩蓓佳 ，冯旭东 ，李春 ， （ 天津大学化工学院，天津３０００７２； 北京理工大学生命学院，北京１０００８１） 摘要：以Ⅳ－糖基化提高毕赤酵母重组表达Ｂ．葡萄糖醛酸苷酶（ＰＧＵＳ．Ｐ）的热稳定性为目的，在ＰＧＵＳ．Ｐ模拟结 构分析的基础上，半理性方法设计并通过定点突变引入具有ＥＡＳ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）序列特征的新Ⅳ＿ 糖基化位点，经毕赤酵母重组表达后，获得了３个新糖基化的突变酶ＰＧＵＳ．Ｐ．２６、ＰＧＵＳ．Ｐ一３５和ＰＧＵＳ．Ｐ．２５９。 反应动力学分析表明，与原始ＰＧＵＳ－Ｐ相比，突变酶ＰＧＵＳ．Ｐ．２６、ＰＧＵＳ．Ｐ．３５和ＰＧＵＳ．Ｐ．２５９催化甘草酸水解的 ，ｍ变小， ， 。增加，表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。热稳定性分析表明，ＰＧＵＳ．Ｐ．３５ 和ＰＧＵＳ—Ｐ．２５９的热稳定性得到改善，在６５￣Ｃ下保温９０ ｍｉｎ，其热稳定性相对ＰＧＵＳ．Ｐ分别提高了１３％￣Ｅ １１％。 研究表明在蛋白质的合适位点引入糖基修饰对提高蛋白的热稳定性具有促进作用。 关键词：Ⅳ＿糖基化；Ｂ 葡萄糖醛酸苷酶；热稳定性；分子模拟；动力学 ＤＯＩ：１０．１ １９４９￣．ｉｓｓｎ．０４３８—１ １５７．２０１５０８８５ 中图分类号：Ｑ ８１６ 文献标志码：Ａ 文章编号：Ｏ４３８—１１５７（２０１５）０９—３６６９—０９ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ￣－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｂｙ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏｙａｎ ，ＦＡＮ Ｙａｎｓｈｕａｎｇ２ＨＡＮ Ｂｅｉｊｉａ ，ＦＥＮＧ Ｘｕｄｏｎｇ２，ＬＩ Ｃｈｕｎ 。 ，（１Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７２，Ｃｈｉｎａ； Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆｔ＠Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ １３－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＰＧＵＳ—Ｐ、 ｂｙ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，ｎｅｗ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｍｉ—ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＰＧＵＳ—Ｐ．Ｔｈｒｅｅ ｎｅｗ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ＥＡＳ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｆｔｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，ｔｈｒｅｅ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｎａｍｅｄ ａｓ ＰＧＵＳ—Ｐ一２６，ＰＧＵＳ—Ｐ一３５ ａｎｄ ＰＧＵＳ—Ｐ一２５９．Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｘ ｏｆ ＰＧＵＳ．Ｐ．３５ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｏｍ １ １ １．２５ ｇｍｏｌ・（Ｌ・ｍｉｎ）。。ｔｏ １２０．４８ ｇｍｏｌ・（Ｌ・ｍｉｎ）一 ａｎｄ ａｌｌ ｏｆｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｇｒｅａｔｅｒ ａｆｉｎｉｆｔｙ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｙ ｔｏｗａｒｄｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＰＧＵＳ—Ｅ Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｙ ｏｆＰＧＵＳ—Ｐ－ｔ３５ ａｎｄ ＰＧＵＳ—Ｐ一２５９ ａｔ ６５￣Ｃ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １３％ａｎｄ １１％ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ＰＧＵＳ一 ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｔｓ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｙ．ｔ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ；１３－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ；ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ；ｋｉｎｅｔｉｃｓ ２０１５．０６—１０收到初稿，２０１５．０６—１７收到修改稿。 Ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｄａｔｅ：２０ｌ５－０６．１０． 联系人：李春。第一作者：王小艳（１９８Ｏ一），女，博士研究生。 基金项目：国家自然科学基金项目（２１３７６０２８，２１１７６０２８ ２１４２５６２４）；教育部博士点基金项目（２０１２１１０１１１００５０）。 Ｃ０ｒｒｅｓｐ０ｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＬＩ Ｃｈｕｎ，ｌｉｃｈｕｎ＠ｂｉｔ．ｅｄｕ．ａｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｉｔｅｍ：ｓｕｐｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（２１３７６０２８，２１１７６０２８，２１４２５６２４）ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｆｕｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ ｏｆＣｈｉｎａ（２０１２１１０１１１００５０）． ・３６７０・ 化工学报 第６６卷 引 言 大量研究表明糖基化是调节酶活性和稳定性 的关键因素，可以赋予许多蛋白质有益属性和功 糖基修饰和糖蛋白之间关系的研究，发现将Ⅳ＿糖链 引入蛋白质适当的二级结构中能增加其结构稳定 性。因此通过定点突变来减少或增加糖基化位点， 对探索Ⅳ＿糖基化对全局糖蛋白的影响是一种有效 手段。 Ｂ．葡萄糖醛酸苷酶（ＧＵＳ，ＥＣ ３．２．１－３１）属于 糖苷酶，大部分属于糖基水解酶第二家族，它能催 化各种类型的Ｂ一葡萄糖醛酸苷水解产生多种衍生物 同时释放出６．葡萄糖醛酸 引。相关研究表明，该酶 能 ４。。蛋白质经糖基修饰后能避免热力学降解，提 高其热稳定性，而天然糖基化蛋白质的糖基侧链的 去除会降低其热力学稳定性，从而增加蛋白质聚集 的可能性Ｌ５ Ｊ。例如，糖基化在维持组织蛋白酶Ｅ 稳定性中发挥重要作用，潜在糖基化位点的去除导 致了组织蛋白酶Ｅ对热和酸稳定性的下降 』。 可以转化甘草酸（ＧＬ）生成单葡萄糖醛酸甘草次酸 Ｆｏｎｓｅｃａ．Ｍ￣ｄｏｎａｄｏ等 ］发现，毕赤酵母中重组表达 （ＧＡＭＧ）［１４－１８］，且与ＧＬ相比，ＧＡＭＧ具有极性 的糖基修饰的木聚糖酶与大肠杆菌中表达的未发生 适中、安全性更高及生物利用度更高等优点，更能 糖基化的对照酶相比热稳定性得到显著提高。研究 满足工业生产应用的需求。前期将来自Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 表明，糖基化可提高弹性蛋白酶ｒＰＡＥｄ在有机溶剂 ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ Ｌｉ一３菌中的Ｂ．葡萄糖醛酸苷酶在毕赤 中的稳定性，使其在７０￣Ｃ时的半衰期延长至３２．２ 酵母中重组表达后发现其发生了糖基修饰，而经糖 ｍｉｎ，与未糖基化的对照（２３．１ ｍｉｎ）相比热稳定性 基修饰后的６一葡萄糖醛酸苷酶（ＰＧＵＳ—Ｐ）的热稳 有了显著改善 ］。另外，由于糖链自身的亲水性， 定性与野生型相比得到明显提高【】 。 经过糖基化修饰后蛋白质的水溶性可能会发生变 考虑到糖基化对糖蛋白热稳定性的显著影响， 化，有利于一些糖蛋白的分泌【９Ｊ。由于糖基化具有 本研究以ＰＧＵＳ．Ｐ为研究对象，基于结构模拟对其 赋予蛋白质有益特性和功能的潜力，近年来糖基化 进行半理性设计，通过定点突变技术在该酶的氨基 在蛋白质改造方面得到越来越广泛的关注。 酸序列中引入具有ＥＡＳ序列的新Ⅳ－糖基化位点， 真核生物中Ⅳ－糖基化识别位点主要有Ｎ．ｘ—Ｔ 并对突变酶进行活性检测和糖基化验证，同时对突 和Ｎ—ｘ．Ｓ两种形式，研究发现Ｎ．Ｘ—Ｔ结构比Ｎ—ｘ．Ｓ 变酶的催化特性和热稳定性进行分析，以期得到含 结构更容易被糖基化ｌｌ…。但很多自然界蛋白质存在 有不同位点糖基化的热稳定性提高的Ｂ．葡萄糖醛酸 自身含有的潜在糖基化位点并未被糖基修饰的现 苷酶，同时也为将来对其他工业用酶稳定性的改造 象，有研究表明，位于蛋白结构反向转角区上的糖 提供一种新思路和理论基础。 基化位点天冬酰胺前面２～３个位置的氨基酸为苯 丙氨酸时，有利于芳香族侧链和糖链的Ⅳ＿乙酰葡糖 １实验材料与方法 胺相互作用，从而提高糖基化效率，该特征氨基酸 １．１菌株与质粒 序列主要有３种形式：Ｆ．Ｎ．ｘ—Ｔ、Ｆ—ｘ－Ｎ．ｘ—Ｔ和 表达宿主毕赤酵母Ｐｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ ｌ １ ５和大肠杆 Ｆ—ｘ．ｘ．Ｎ．ｘ—Ｔ，具有该特征的序列被称为ＥＡＳ 菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ为本实验室自行保藏。用于分 （ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｏｎ）序ｙｄｔ１１－１２］。而随着对 子克隆实验的克隆宿主为（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐｌ０购自博迈 ｎ （ｂ） 图１质粒示意图 Ｆｉｇ．１ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆｐｌａｓｍｉｄ （ａ）ｐＧＡＰＺ－Ｐｇｕｓ－ｕｎｇｌｙ；（ｂ）ｐＥＴ２８ａ－Ｐｇｕｓ—ｕｎｇｌｙ 第９期 王小艳等：糖基化改造Ｂ一葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性 ・３６７１・ 德公司，毕赤酵母和大肠杆菌的表达质粒模板为潜 在糖基化位点突变了的ｐＧＡＰＺ・Ｂｅ，ｕｓ－ｕｎｇｌｙ和 ｐＥＴ２８ａ－ＰｇＵＳ—ｕｎｇｌｙ（图１），为实验室自行构建保存。 １．２酶和试剂 ＰＣＲ相关试剂如ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶等购自 蛋白上样缓冲液重悬，在沸水浴中煮沸５ ｍｉｎ后离 心后取上清电泳；制胶，参考说明书配制１０％的分 离胶和５％的浓缩胶；电泳：初始电压控制在８０ ｖ， 等样品泳过浓缩胶后将电压调节到１２０ Ｖ直至电泳 结束；染色和脱色：将凝胶剥下后用考马斯亮蓝 Ｒ２５０染色液染色１ ｈ，然后用脱色液脱色，期间换 脱色液１～２次，脱色充分后拍照保存。 ＴａＫａＲａ公司；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒 购自北京博迈德科技发展有限公司；性内切酶， 如 Ｉ、ＤｐｎＩ等购白ＴａＫａＲａ公司。 ｌ－３微生物的培养 大肠杆菌的培养：采用ＬＢ培养基，３７￣Ｃ，摇 床转速１７０ ｒ・ｍｉｎ－ 时培养１２ ｈ。 毕赤酵母Ｐｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５的培养：采用ＹＰＤ 培养基，３０℃，摇床转速１７０ ｒ・ｍｉｎ＿ ，培养３ ｄ。 １．４定点突变 ①以质粒为模板，利用表１中的引物克隆整个 质粒，同时在目标基因上引入突变位点；￣ＰＣＲ产 物可直接利用Ｄｐｎ Ｉ消化甲基化或半甲基化的模 板；③将酶切产物直接转化到大肠杆菌Ｔｏｐｌ０感受 态细胞中；④筛选到阳性克隆、测序正确后将质粒 在表达宿主中表达。 表１引物序列表 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｂｌｅ ２６ Ｆ ５ ．ＣＡＴＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＣＣ－３ Ｒ ５’．ＴＡＴＴＧＴＴＧＴｃＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＡＧＧＧＣ－３ ３５ Ｆ ５＇－ＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＣＣ．３ Ｒ ５＇－ＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧ．３ ２５９ Ｆ ５＇－ＣＡＴＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＣ．３ Ｒ ５ ．ＣＡＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＡＴＧＡＴＧ一３ １．５突变酶的表达 大肠杆菌的表达体系构建与突变酶的表达参 照Ｍｅｒｃｋ Ｎｏｖａｇｅｎ的ｐＥＴ表达系统说明书。 毕赤酵母Ｐｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５的表达体系构建与 突变酶的表达根据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ｐＧＡＰＺ表达载体 操作手册进行操作。 １．６重组蛋白的纯化及ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析 大肠杆菌表达蛋白的纯化采用Ｎｉ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ镍 柱亲和色谱柱进行；毕赤酵母表达蛋白的纯化采用 Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ强阴离子交换柱进行；蛋白 质的丙酮沉淀，向培养基中加入等体积的预冷的丙 酮，轻轻混匀后，４℃，１２０００ ｒ・ｍｉｎ－ 离心１０ｍｉｎ， 收集蛋白沉淀，最后加入适量的缓冲液溶解蛋白。 ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析，样品处理：取样品４Ｏ 加入１０ １ １．７糖蛋白ＰＡＳ染色 ＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ—Ｓｃｈｉｆｆ＇ｓ ｂａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）染色 方法：利用品红的高碘酸．希夫试剂，通过对糖链染 色来检测糖蛋白的存在。取出ＳＤＳ—ＰＡＧＥ后的凝 胶，将其在１０％冰醋酸一３５％甲醇溶液中浸泡１～２ ｈ 以固定蛋白条带；然后将固定后的凝胶取出用５％ 的冰醋酸清洗２次，每次１０ ｍｉａｒ然后把凝胶浸泡 在用５％冰醋酸配制的１％的高碘酸溶液中，在４￣Ｃ 中黑暗条件下氧化１ ｈ：用５％冰醋酸将凝胶漂洗几 次后，用５０ ｍｌ的偏重亚硫酸钠溶液（０．２ ｇ偏重亚 硫酸钠溶于１００ ｍｌ ５％冰醋酸）浸泡１０ ｍｉｎ；用 Ｓｃｈｉｆｆ试剂于４℃避光染色１ ｈ；染色完毕后将凝胶 用大量５％冰醋酸进行清洗，即可见红色糖蛋白电 泳条带。 １．８糖蛋白糖苷酶Ｆ酶法 糖苷酶Ｆ酶切条件如下：①２Ｏ ｇ糖蛋白在１ ×糖蛋白变性缓冲液中，１００℃煮沸１０ ｍｉｎ，使糖 蛋白变性。②加入１／１０体积的１０×Ｇ７缓冲液及１０％ ＮＰ一４０。⑧加入１～５ ｕｌＰＮａｓｅＦ，３７℃温育１ ｈ，将 酶切后样品进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测。 １．９ Ｂ．葡萄糖醛酸苷酶的活性测定 以硝基苯一葡萄糖醛酸苷（Ｐ—ＮＰＧ）为底物的 酶活测定：取１０ ｌ酶液加４０ ｌ Ｐ—ＮＰＧ（１．２５ ｍｍｏｌ・Ｌ ）最适温度下反应１０ｍｉｎ后，加入２００ｇｌ、 ０．４ ｍｏｌ・Ｌ 的碳酸钠终止反应，用酶标仪（４０５ ｎｍ） 检测样品溶液中对硝基苯酚的含量。Ｂ一葡萄糖醛酸 苷酶活力定义：一个活力单位（Ｕ）为上述条件下， 每分钟催化生成１ ｇｍｏｌ对硝基苯酚所需的酶量。 以甘草为底物的酶活测定：取１００ ｇｌ酶液与 ４００ ｕｌ甘草酸缓冲溶液反应，一定温度下反应一段 时间后，沸水浴处理１０ ｍｉｎ使酶失活，样品与甲醇 的混合比例为１：９，用ＨＰＬＣ检测ＧＬ、ＧＡＭＧ和 ＧＡ的含量。采用高效液相色谱外标法对甘草酸、 ＧＡＭＧ和甘草次酸进行测定，仪器设置参数为： 岛津ＬＣ一１０Ａ，色谱柱：Ｓｈｉｍ．ｐａｃｋ，ＶＰ—ＯＤＳ，检 测器：ＳＰＤ，检测波长：２５４ｎｍ，流动相：甲醇：０．６％ 乙酸＝８１：１９，进样量：１０ ｕ１，流速：１ ｍｌ・ｍｉｎ～， ・３６７４・ 化工学报 第６６卷 一 图６糖苷酶Ｆ处理前后ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图 Ｆｉｇ．６ ＳＤＳ．ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ 一一 一 ｌ＋ ＰＮＧａｓｅＦ 图７毕赤酵母表达突变酶的比酶活测定 Ｆｉｇ．７ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｐ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｗｉｔｈ／ｗｉｔｈｏｕｔ ＰＮＧａｓｅ Ｆ ｄｅｎｏｔｅｄ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ＰＮＧａｓｅ Ｆ：＋ｄｅｎｏｔｅｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｌ＋ 生了变化。酶切前大小与自身含有糖基化的ＰＧＵＳ—Ｐ 一利用ＨＰＬＣ分析考察了突变酶水解甘草酸模式 （催化特异性）有无发生变化，图８显示了各突变 酶水解甘草酸反应的结果。甘草酸（ＧＬ）为底物， 产物为单葡萄糖醛酸基甘草次酸（ＧＡＭＧ）和甘草 次酸（ＧＡ），三者的保留时间分别为５．２ ｍｉｎ，１ １．６ ｍｉｎ和２１－３ ｍｉｎ［２４］。从图８的结果可以看出， ＰＧＵＳ—Ｐ一２６、ＰＧＵＳ．Ｐ ３５和ＰＧＵＳ．Ｐ一２５９对甘草酸 致，而酶切后大小则与无糖基化的ＰＧＵＳ．Ｅ大小 保持一致，糖苷酶Ｆ酶切结果表明３个突变酶均发 生了糖基修饰。 ２－３突变酶的催化特性分析 为检测获得的突变酶是否具有活性，对纯化得 到的突变酶样品进行了以Ｐ．ＮＰＧ为底物的酶活检 查，如图７所示，发现不同糖基化位点比酶活呈现 较大差异。ＰＧＵＳ．Ｐ．３５的比酶活为１４１．５ Ｕ・ｍｇ～， 明显高于对照ＰＧＵＳ—Ｐ的１０６．１ Ｕ・ｍｇ－ ， 的水解模式均未发生变化，与对照ＰＧＵＳ．Ｐ一样生成 ＧＡＭＧ和ＧＡ两种产物。表明不同位点糖基化修饰 不会改变Ｂ．葡萄糖醛酸苷酶的催化反应类型。该结 ＰＧＵＳ—Ｐ一２５９与ＰＧｕｓ—Ｐ相比也有所提高，为１２５．５ Ｕ・ｍｇ～，而ＰＧＵＳ．Ｐ一２６的比酶活却下降为６０．０７ Ｕ・ｍｇ～。此种现象可能与发生糖基化的位点不同 有关系，ＰＧＵＳ．Ｐ．２６的突变位点的糖基修饰可能影 响到了酶的正常活性导致其比酶活下降。Ｍｉｌｌｅｒ等曾 报道过当把ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｐａｓｅ（ＥＬ）的Ｎ３７３、Ｎ４４９ 和Ｎ４７１位的糖链去除后，ＥＬ的酶活降低了７０％，但 去除Ｎ６２位的糖链，ＥＬ的酶活反而提高了５倍［２２－２３］， 也说明了不同糖基化位点对酶活的影响不同。 论与江南大学余晓斌课题组报道的Ⅳ－糖基化对弹 性蛋白酶的底物特异性没有显著影响是一致的【５Ｊ。 大多数情况下，发生了Ⅳ＿糖基化的蛋白质的催化 特性要优于与其对应的没有被糖基修饰的蛋白，尽管 有时候糖基修饰并未引起蛋白结构的显著改变【２引。 糖链的添加可能通过影响酶蛋白环状结构域与催化 残基的相互作用来影响酶与底物之间的亲和力【２６Ｊ。 为了考察新引入糖基修饰的突变酶在实际催化反应 体系中的催化性质，采用Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ双倒数 ＞ ｇ 》 ｔｉｍｅ／ｍｉｎ 图８ 突变酶水解甘草酸（ＧＬ）的模式 Ｆｉｇ．８ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ 第９期 王小艳等：糖基化改造Ｂ－葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性 ・３６７５・ 作图法计算酶反应动力学常数（ ， ， 砒， ，ｍ），结果如表３所示。ＰＧＵＳ．Ｐ．３５的最大反应 速率 与ＰＧＵＳ．Ｐ相比得到提高，为１２０．４８ ｇｍｏｌ・（Ｌ・ｍｉｎ）～。三者的 和 ａｔ与ＰＧＵＳ—Ｐ相 比均减小，说明新引入的糖基化不同程度地提高了 Ｂ．葡萄糖醛酸苷酶与甘草酸底物的亲和力，可能是 糖基修饰使得酶蛋白空间构象更有利于底物的结 合，而且３株突变酶ＰＧＵＳ．Ｐ一２６、ＰＧＵＳ—Ｐ一３５和 ＰＧＵＳ—Ｐ一２５９的 ａｔ／ 与ＰＧＵＳ—Ｐ相比分别提高了 ３０．１％，２３．９％和１２．６％，表明其催化底物甘草酸的 效率同时也得到提高。 ２．４突变酶热稳定性分析 大量研究表明，Ⅳ＿糖基化可以提高蛋白的稳定 性，其原因主要有两个：一是糖链的形成可以降低 未折叠蛋白的无序度，即提高了一些未折叠的糖蛋 白的稳定性；二是由于糖链本身是一些分子量较大 的亲水基团，会增加蛋白的可溶性并且有利于抑制 蛋白聚集体的形成【２ 。另外，也有研究表明，虽然 有时候一些糖蛋白的糖基化并没有显著改变蛋白的 二级结构，但会减缓其热失活过程，一定程度上抑 制了热变性过程中蛋白的聚集【２引，这也进一步证明 了糖基化可提高蛋白稳定性。为验证不同位点新引 入的Ⅳ＿糖基化对Ｂ一葡萄糖醛酸苷酶热稳定性的影 响，首先在大肠杆菌中表达了相应的含有这３个突 变序列的Ｂ一葡萄糖醛酸苷酶，分别命名为 ＰＧＵＳ．Ｅ．２６、ＰＧＵＳ—Ｅ一３５和ＰＧＵＳ．Ｅ．２５９，然后同 时考察了有糖基修饰的ＰＧＵＳ—Ｐ．２６、ＰＧＵＳ—Ｐ一３５和 ＰＧＵＳ．Ｐ．２５９和无糖基修饰的ＰＧＵＳ．Ｅ．２６、 ＰＧＵＳ—Ｅ一３５和ＰＧＵＳ．Ｅ一２５９在６５℃时的热稳定性。 将酶液置于６５℃水浴中，每隔３０ ｍｉｎ时间间隔取 样，测定酶活，以保温前的酶活为对照并记为ｌ００％， 测定结果如图９所示。 在６５℃保温时，糖基化突变酶ＰＧＵＳ．Ｐ．３５和 ＰＧＵＳ—Ｐ．２５９的热稳定性与对照ＰＧＵＳ—Ｐ相比得到 提高。６５℃保温９０ ｍｉｎ时，二者剩余酶活力分别维 持在９５％和９３％，而ＰＧＵＳ—Ｐ剩余酶活为８４％左右。 但ＰＧＵＳ—Ｐ．２６在６５℃保温９０ ｍｉｎ时的剩余酶活仅 为７４％左右。继续延长保温时间可以发现， ＰＧＵＳ．Ｐ．３５，ＰＧＵＳ．Ｐ．２５９两突变体的剩余酶活下降 非常缓慢，３ ｈ后仍然保留高达８５％以上的剩余酶 活，而ＰＧＵＳ．Ｐ只保留７０％以上的酶活。且糖基化 系统中表达的ＰＧＵＳ．Ｐ一２６，ＰＧＵＳ—Ｐ一３５和 ＰＧＵＳ．Ｐ一２５９热稳定性均显著高于非糖基化系统中 的表达的相应酶，上述结果表明糖基修饰提高了该 酶的热稳定性。 此外，从图９（ａ）可以看出，ＰＧＵＳ—Ｅ．２６与其 对照ＰＧＵＳ．Ｅ相比提高约１０％，表明该位点的氨基 酸突变有利于热稳定性的提高，但糖基修饰的 ＰＧＵＳ．Ｐ．２６的热稳定性却低于对照ＰＧＵＳ．Ｐ，原因 可能是该位点的糖基修饰影响了酶的局部结构导致 其稳定性降低。而ＰＧＵＳ—Ｅ一３５和ＰＧＵＳ．Ｅ．２５９的热 稳定性与ＰＧＵＳ—Ｅ相比并未有显著变化趋势『图９ （ｂ），（ｃ）１，说明相应位点的氨基酸突变对稳定性 影响不大，但糖基修饰的ＰＧＵＳ．Ｐ．３５和ＰＧＵＳ—Ｐ一２５９ 热稳定性与对照ＰＧＵＳ．Ｐ相比明显提高，进一步说 明二者的热稳定性提高确实是由引入的糖基化引起 的。上述结果表明糖基化对Ｂ一葡萄糖醛酸苷酶的热 稳定性有显著影响，且不同位点的糖基化对该酶的 影响有明显差异，这与文献中报道的不同位点上的 糖基化对酶具有明显不同影响的结论是一致的『８］。 ３ 结 论 本研究以糖基修饰作为一种新的酶稳定性改 造手段，以毕赤酵母重组表达ＰＧＵＳ—Ｐ为研究对象， 在对ＰＧＵＳ．Ｐ结构模拟的基础上，采用半理性设计 方法对其进行糖基改性，利用定点突变方法在Ｂ一葡 萄糖醛酸苷酶氨基酸序列中引入３个具有ＥＡＳ序列 的新Ⅳ＿糖基化位点，经活性检测和ＰＡＳ染色及糖苷 酶Ｆ酶切分析，获得了糖基修饰的突变酶ＰＧＵＳ－Ｐ．２６、 ＰＧＵＳ．Ｐ一３５、ＰＧＵＳ—Ｐ一２５９。研究发现引入糖基化后 得到了稳定性优良的两株突变酶ＰＧＵＳ．Ｐ一３５和 ＰＧＵＳ．Ｐ一２５９，６５℃保温９０ ｍｉｎ时，二者剩余酶活 ・３６７６・ 化工学报 第６６卷 ：三 茗 。 专 兰 羔 羔 ＼五【＾；０∞ ＡＩ 一 ｔ１ｍｅ／ｍｉｎ ｔｉｍｅ／ｍｉｎ ｆｂ１ （ａ） ｔｉｍｅ／ｍｉｎ （ｃ） 图９突变酶热稳定性分析 Ｆｉｇ．９ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ 力分别维持在９５％和９３％；而ＰＧＵＳ．Ｐ一２６的热稳 定性无明显变化，推测可能与之前模拟的该位点氨 Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｓｔｏｒａｇｅ ｉｎ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ＶＩＩ 基酸的改变引起其结构的细微改变有关。此外，引 入糖基化后，ＰＧＵＳ．Ｐ一２６、ＰＧＵＳ—Ｐ．３５和ＰＧＵＳ．Ｐ ２５９ 对底物甘草酸的亲和力均增加，催化效率分别提高 ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００４，１０１（９）：３０８３—３０８８． ［５］Ｈａｎ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｄｉｎｇ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｙ，ｓｔｔａｂｉｌｉｙ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｔｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｌａｓｔａｓｅ 了３０．１％，２３．９％和１２．６％。本研究初步探究糖基化 的位点对蛋白质结构以及催化特性的影响，推测位于 ｔｕｒｎ／ｌｏｏｐ区的糖链的添加可能会在一定程度上影响 到一些ｌｏｏｐ环的柔性，从而改变蛋白质结构的刚性。 Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ Ｓｋｒｏｐｅｔａ Ｄ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｎ－ｇｌｙｃａｎｓ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］ｌ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ＆ｔｒｙ，２００９，１７（７）：２６４５－２６５３． Ｓｔｅｎｇｅｌ Ｃ，Ｎｅｗｍａｎ Ｓ Ｄａｙ ＪＭ，ＴｕｔｉｌｌＨ Ｊ，ＲｅｅｄＭ Ｊ，ＰｕｒｏｈｉｔＡ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓ ｏｎ ＳＴＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ：ａ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１４，５４：３２—３７． ［６］ Ｓｈｉ Ｙｕｍｅｉ（石玉梅），Ｚｈｅｎｇ Ｌｅｉ（郑磊），Ｌｉ Ｊｕａｎ（李娟）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ】ｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（现代生物医学进展），２０１１，１１（２４）：５１９０－５１９２． ［７］ Ｙａｓｕｄａ Ｉｋｅｄａ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｈ，Ｔｓｕｋｕｂａ Ｌ Ｏｋａｍｏｔｏ Ｋ，Ｎｉｓｈｉｓｈｉｔａ Ｋ， ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆＮ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｅ［Ｊ］ｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆ ｏＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，１９９９，２６６（ｒ２）：３８３—３９１． ［８］Ｆｏｎｓｅｃａ－Ｍａｌｄｏｎａｄｏ Ｒ，Ｖｉｅｉｒａ Ｄ Ｓ，Ａｌｐｏｎｔｉ Ｊ Ｓ，Ｂｏｎｎｅｉｌ Ｅ，Ｔｈｉｂａｕｌｔ Ｐ， Ｗａｒｄ Ｒ Ｊ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｅ ｔｐａａｅｒｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｈｅ ｔｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｙ ｏｆ ａ ＧＨ１１ｔ ｘｙｌｎａｓｅ［ａＪ】．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，２０１３，２８８（３５）：２５５２２－ｒ２５５３４． ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８３（１）：７６—８２． Ｌｉａｏ Ｘ，Ｗａｎｇ ｗ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｗｕ Ｑ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｒｉｎ ［９］Ａｎｕｍｕｌａ Ｋ Ｉ Ｌ．Ｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ—ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，２０００，２８３（１）：ｒ ｌ７—２６． ｚｙｍｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ１．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，２８２ ｆ３８１：２７７２８－２７７３５． ＬｅＢｏｗｉｔｚ ＪＨ，Ｇｒｕｂｂ ＪＨ，Ｍａｇａ ＪＡ，ＳｃｈｍｉｅｌＤＨ，ＶｏｇｌｅｒＣ，ＳｌｙＷＳ． ［１０】Ｋａｓｔｕｒｉ Ｌ，Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ Ｒ，Ｗｕｎｎｅｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎ ａｎ Ａｓｎ－－Ｘ－－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｓｅｑｕｏｎ Ｃａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｃｏｒｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆａｎｄ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ１ ．第９期 王小艳等：糖基化改造Ｂ一葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性 ・３６７７・ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．．１９９５．２７０：１４７５６－１４７６１． Ｃｕｌｙｂａ Ｅ Ｋ．Ｐｒｉｃｅ Ｊ Ｌ． ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｔｉｖｅ—ｓｔａｔｅ ｓａｔｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｌａｃｉｎｇ ａｒｏｍａｔｉｃ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｕｒｎｓ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１ ｌ，３３１（６０１７）：５７１—５７５． ［１２］ Ｊｏｓｈｕａ Ｌ Ｐｒｉｃｅ，Ｄａｖｉｄ Ｌ Ｐｏｗｅｒｓ，Ｅｖａｎ Ｔ Ｐｏｗｅｒｓ，ｅｔ ａ１．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｏｎ ｉｓ ｓｉｍｉｌａｒｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｕｒｎ ｃｏｎｔｅｘｔｓ［Ｊ１．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１ １，１０８（３４）：１４１２７—１４１３２． ［１３］ Ｏｄｏｎ Ｖ Ｖ，Ｌａｕｒａ Ａ，Ｐａｌｏｍａｒｅｓｂ Ｅ Ｄ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆＮ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｈｔｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ ｌａｃｃａｓｅ［Ｊ］． Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，４５：２３３—２３９． ［１４】 Ａｋａｏ Ｔ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ，ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆｌｏｒａ ［Ｊ］ｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０００，２３（１２）： １４１８．１４２３． ［１５】 Ｆｅｎｇ Ｓ Ｊ，Ｌｉ Ｃ，Ｘｕ Ｘ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｘ Ｙ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ－ｄ—ｍｏｎｏ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ—ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａ 西且Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ， ２００６，４３：６３－６７． ［１６］ Ｋｉｍ Ｄ Ｈ，Ｌｅｅ Ｓ Ｗ，Ｈａｎ Ｍ Ｊ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ｔｏ １８ｂｅｔａ－ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ－３一Ｏ－ｂｅｔａ－Ｄ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＬＪ－２２，ａ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉｍｕ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｉｅｔｉｎ，１９９９，２２（３）：３２０－３２２． ［１７】 ＫｕｒａｍｏｔｏＴ，ＩｔｏＹ，ＯｄａＭ，ＴａｍｕｒａＹ，Ｋｉｔａｈａｔａ Ｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｃ ａｃｉｄ ３－Ｏ—ｍｏｎｏ－Ｂ－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ ｆｒｏｍ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ｂｙ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ ＭＧ－２７［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ＆ｔｒｙ，１９９４，５８（３）：４５５—４５８． ［１８］ ＰａｒｋＨＹ，ＫｉｍＮＹ，ＨａｎＭ Ｊ，ＢａｅＥＡ，ＫｉｍＤＨ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｂｅｔａ－・ｄ－・ｇｌｕｅｕｒｏｎｉｄａｓｅｓ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ ｔｏ １８１３－ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｅ ａｃｉｄ－．３－．Ｏ－ｂｅｔａ－－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＬＪ－２２［ＪＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００５，１５（４）：７９２－７９９． ［１９］ Ｚｏｕ Ｓ，Ｘｉｅ Ｌ，Ｌｉｕ Ｋａｌｅｅｍ Ｉ， ａ１．Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ １３－ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２， １５７（３）：３９９—４０４． ［２０］Ｗａｌｌａｃｅ Ｂ Ｄ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｌａｎｅ Ｋ Ｔ，Ｓｃ０ｔｔ Ｊ Ｅ，Ｏｒａｎｓ，Ｊ，Ｋｏｏ Ｊ Ｓ， Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ Ｍ，Ｊｏｂｉｎ Ｃ，Ｙｅｈ Ｌ Ａ，Ｍａｎｉ Ｓ，Ｒｅｄｉｎｂｏ Ｍ Ｒ．Ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｔｏｘｉｃｉｙｔ ｂｙ ｉｈｎｉｂｉｔｉｎｇ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１０，３３０（６００５）：８３１－８３５． ｆ２１］Ｐｅｔｒｅｓｃｕ Ａ Ｊ，Ｍｉｌａｃ Ａ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ ｆｏｌｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，１４（２）：１０３－１１４． ［２２］Ｍｉｌｌｅｒ Ｇ Ｃ，Ｌｏｎｇ Ｃ Ｊ，Ｂｏｊｉｌｏｖａ Ｅ Ｄ，Ｍａｒｃｈａｄｉｅｒ Ｄ，Ｂａｄｅｌｌｉｎｏ Ｋ Ｏ， Ｂｌａｎｃｈａｒｄ Ｎ，Ｆｕｋｉ Ｉ Ｖ，Ｇｌｉｃｋ Ｊ Ｍ．Ｒａｄｅｒ Ｄ Ｊ．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｐａｓｅ［ＪＪ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２００４，４５（１１）：２０８０—２０８７． ［２３］Ｂｒｏｗｎ Ｒ Ｊ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｇ Ｃ，Ｇｒｉｆｆｏｎ Ｎ，Ｌｏｎｇ Ｃ Ｊ，Ｒａｄｅｒ Ｄ Ｊ． Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｐａｓｅ ａｔ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ一１１６ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｃｔｉｖｉｙｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ］． ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，２００７，４８（５）：１１３２—１１３９． ［２４】Ｚｏｕ Ｓ Ｌｉｕ Ｇ Ｋａｌｅｅｍ Ｉ，Ｌｉ Ｃ．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ￣－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ Ｌｉ一３【Ｊ】．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，４８： ３５８—３６３． ［２５］Ａｐｗｅｉｌｅｒ Ｒ，Ｈｅｒｍｊａｋｏｂ Ｈ，Ｓｈａｒｏｎ Ｎ．Ｏｎ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，ａｓ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ—ＰＲＯＴ ｄａｔａｂａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９９，１４７３（１）：４－８． ［２６］Ｎｉｃｋ Ｈｏｌｍｅｓ．Ａ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２１： ６４６—６４７． ［２７］Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ Ｂ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｓ Ｅ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ＠ｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ１．， １９９９，３（６）：６４３—６４９． ［２８］Ｗａｎｇ Ｃ，Ｅｕｆｅｍｉ Ｍ，Ｔｕｒａｎｏ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｏｉｅｔｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｙｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ，１９９６，３５ （２３）：７２９９－９３０７．
