双黄连口服液的 制备 成分检测

双黄连口服液

拼音名：Shuanghuanglian Koufuye

书页号：X9-4

标准编号：WS3-131(Z-43)-95(2)

批准文号：（91）卫药准字Z-83-2号 （91）卫药准字Z-83-3号

本品为金银花、黄芩、连翘等药味经加工制成的口服液。

【性状】 本品为棕红色澄清液体；味甜、微苦。

【鉴别】 取本品1ml,加水5ml，摇匀，作为供试品溶液。另取连翘对照药材0.5g,加75％乙醇10ml,振摇提取1小时，滤过，滤液作为对照药材溶液。再取黄芩甙、绿原酸对照品，分别加75％乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典1990年版一部附录57页)试验，吸取上述四种溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜(5×7cm)上,以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与黄芩甙、绿原酸对照品及连翘对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

【检查】 相对密度 应不低于1.12(中国药典1990年版一部附录34页)pH值，应

为5.0～7.0(中国药典1990年版一部附录40页)。

其他 应符合合剂项下有关的各项规定(中国药典1990年版附录15页)。

【含量测定】 精密量取本品1ml，置25ml量瓶中,加甲醇适量,置热水中充分振摇,放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置，取上清液作为供试品溶液。另取黄芩甙对照品， 加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典1990年版一部附录57页)试验。吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜(14×17cm)上,以醋酸为展开剂,展开，取出，晾干。照色谱法(中国药典1990年版一部附录55页薄层扫描法)进行扫描,波长：λS＝275nm，λR＝400nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。

本品含黄芩以黄芩甙(C12H18O11)计，不得少于0.8％。

【功能与主治】 辛凉解表，清热解毒。用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛。

【用法与用量】 口服，一次20ml，一日3次，小儿酌减或遵医嘱。

【规格】 每支10ml

【贮藏】 密封，避光，置阴凉处。

【使用期限】 二年

一种用于生产浓缩型双黄连口服液制剂的制备方法，制剂中主要含有金银花、黄芩、连翘三种药材。制备时，主要采用的是现代分离、精制技术，采用酸沉、醇沉、利用不同

pH调节、萃取、高速离心等方法，且对药料的深度加工，使药料的有效成分能够得到充分利用，药物浓度增大、有效成分含量提高；缩短生产周期，降低生产成本。因为有效成分含量提高、单位体积内有效浓度增加，其口服用量相应减少，使服用、携带更方便。

1、一种用于生产浓缩型双黄连口服液的制备方法，其特征在于：它依次包括以下工艺步骤： (a)将黄芩切片后加入8-10倍量水煎煮1.5-2.5小时，滤过，药渣再加5-6 倍量水煎煮二次，各0.5-1小时，滤过，合并三次滤液，滤液浓缩并在80℃时加入盐酸溶液适量调节PH值至3以下，保温1小时，放置过夜，将下部沉淀加6～8 倍量水搅匀，用40％氢氧化钠溶液调节PH值至6-8，再加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用浓盐酸调节PH值至1-3，在60℃保温30分钟后放置过夜，滤过，沉淀用乙醇洗至PH值6-8，挥尽乙醇得黄芩粗提取物；再用4-6倍量水混悬，调节PH值至6-8，搅拌至溶解，并加入黄芩粗提取物量2-5％活性炭，搅拌，在 80℃以上保温30-40分钟，过滤，滤液加入稀盐酸，PH值调至6-8，在搅拌下加入等量95％乙醇，抽滤，用盐酸调至2-4，60℃保温30-40分钟，放置过夜，经抽干得到精制黄芩苷提取物。 (b)金银花、连翘加入10-14倍量水温浸半小时后，加热至沸腾，微沸保持 1-2小时，过滤得滤液，药渣再加6-8倍量水微沸保持1-1.5小时，得滤液，弃去药渣；合并两次滤液，蒸发浓缩至相对密度为1.20～1.25(在70～80℃条件下测)，放冷，在搅拌下缓缓加入乙醇，使含醇量达65-75％，置冷藏室内静置24-48小时，滤取上清液，残渣加乙醇适量，搅匀，静置24小时，滤过，合并乙醇液，回收乙醇至无醇味后放出，得金银花、连翘粗提取物；再用一定量的正丁醇分3-4 次进行萃取，收集正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，得精制金银花、连翘提取物。 (c)按配方量将精制黄芩苷提取物、金银花、连翘提取物混合，并加水适量，搅拌至均匀，以40％氢氧化钠溶液调节PH值至7-8，搅匀，放置冷藏罐内，在4～8℃条件下冷藏72小时，之后通过高速离心方式除杂，离心液加入溶解过滤后的蔗糖适量，搅拌，再加入香精适量并调节PH值至6.5-7.5，加水制成总量，灌装，灭菌，即得。

【摘要】 目的 采用HPLC法测定双黄连口服液中黄芩苷的含量。方法 采用十八烷基键合硅胶为固定相；甲醇∶水∶冰乙酸(60∶50∶1)为流动相；流速1.0ml/min；检测波长274nm。结果 黄芩苷在25～220μg范围内呈良好线性(r=0.9995)；平均回收率100.59%，RSD为1.02%(n=9)。结论 本法快速准确，杂质分离完好，重现性好，可用于该制剂中黄芩苷的含量测定。

【关键词】 高效液相色谱法；黄芩苷；双黄连口服液

双黄连口服液处方中含金银花、黄芩和连翘，具有辛凉解表、清热解毒之功效，用于治疗外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛之症状。中国药典［1］采用HPLC法测定双黄连口服液中黄芩苷含量作为控制制剂质量的指标，结果样品黄芩苷峰与杂质峰无法完全分离(图1)。本文通过改变流动相比例测定，结果分离效果好，快速准确，重现性好，可用于本制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国SSI Ⅳ型液相泵，M525紫外检测器，Anastar色谱工作站；赛多利斯BP-211D电子天平。

1.2 试药 黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号200512)；双黄连口服液(哈高科白天鹅药业集团有限公司，批号05117-1；江苏吴中实业股份有限公司苏州长征制药厂，批号050114；中国黑龙江完达山制药，批号050301)；甲醇(色谱纯)、冰乙酸(AR)，重蒸水。

图1 药典流动相样品的HPLC色谱图2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：甲醇：水：冰乙醇(60：50：1)；流速1.0ml/min；检测波长274nm，柱温40℃。

3 试验方法和结果

3.1 对照品液的制备 精密称取黄芩苷对照品20.60mg，置200ml量瓶中，加50%甲醇适量，置水浴中振摇使溶解，放置至室温，稀释至刻度，摇匀，即得。

3.2 标准曲线 精密吸取上述对照品溶液0.25ml，0.50ml，0.75ml，1.00ml，1.25ml，1.50ml，1.75ml，2.00ml，置10ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度。进样20μl，记录色谱图(图2)。以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标绘制回归方程：Y=6535.7X+9508(r=0.9995)，结果黄芩苷在25～220μg范围内呈良好的线性关系。

图2 改进流动相后对照品的HPLC色谱图

3.3 精密度试验 分别精密进对照品溶液20μl，重复进样6次，按上述色谱条件记录峰面积，结果RSD%=0.%。

3.4 样品分离度 按样品测定法制备供试液进样20μl，记录色谱图(图3)，结果峰与相邻杂质峰分离完全，分离度≥2.5。

3.5 重现性试验 取同一批样品(05117-1)，按样品测定法制备供试液，在上述色谱条件下进行5次平行测定，结果RSD=1.56%，表明本法测定的重现性好。

3.6 稳定性试验 取批号05117-1的供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12h测定，结果黄芩苷的峰面积RSD=1.82%，表明溶液基本稳定。

3.7 阴性干扰实验 取阴性对照样品(按《中国药典》2000版一部缺黄芩苷制剂)，精密进阴性对照品溶液20μl，按上述色谱条件记录色谱图(图3)。结果黄芩苷对照品相应无干扰峰出现，说明处方中其他成分对测定结果无干扰。

图3 改进流动相后阴性对照的HPLC色谱图

3.8 回收率试验 采用加样回收法。精密量取已知含量的样品1ml，置50ml量瓶中，分别精密加入浓度为10.30mg/ml；黄芩苷对照品溶液1ml，2ml，3ml，加50%甲醇稀释至刻度。进样20μl，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。表1 加样回收率试验结果

3.9 样品测定 精密量取各样品1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20min，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用45μm液膜过滤，滤液即为供试品溶液，在上述色谱条件下，进样20μl，记录峰面积(图4)，计算黄芩苷含量，结果见表2。

图4 改进流动相后样品的HPLC色谱图表2 双黄连口服液含量测定结果

4 讨论

本法测定双黄连口服液的黄芩苷的含量，操作简单易行，以甲醇：水：冰乙酸(60：50：1)为流动相，样品中黄芩苷与杂质峰完全分离，出峰时间短，峰形稳定，进样量在20～220μg范围内呈良好线性，回收率高且稳定，可以选定上述色谱条件的流动相，作为该制剂黄芩苷的含量测定。

【参考文献】

1 国家药典委员会.中国药典.北京：化学工业出版社，2000，418-419.

2 周玉新.中药指纹图谱研究技术.北京：化学工业出版社，2002，8.

【关键词】 HPLC

【摘要】 目的 建立测定双黄连口服液和败毒颗粒剂中绿原酸含量的方法。 方法 采用高效液相色谱法，在十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱上，以乙腈:0.1%磷酸（13:87）为流动相，检测波长为327nm。 结果 绿原酸含量在（17.84～.20）μg/ml范围与色谱峰面积线性关系良好（r=0.9999）。双黄连样品加样回收率为99.1%～104.3%（RSD=2.02%，n=5）;败毒颗粒样品加样回收率为100.2%～103.7%（RSD=1.72%，n=5）。 结论 测定双黄连口服液、败毒颗粒中绿原酸含量，方法简便、快速、精密度及回收率均较好，可用于双黄连口服液、败毒颗粒中绿原酸的含量测定和产品质量控制。

【关键词】 绿原酸 HPLC法 双黄连口服液 败毒颗粒 含量测定

绿原酸（Chlorogenic acid）为多种中草药的有效成分，具有抗菌消炎、抗氧化、抗细胞衰老，对消化道的癌症有明显抑制作用和调节机体免疫功能的作用 ［1］ 。还具有增色和护色作用，可用于食品、果品保鲜等 ［2］ 。双黄连口服液为中药黄芩、金银花和连翘的提取物 ［3，4］ ，其中除黄芩苷外，绿原酸也是主要成分之一，在《中国药典》、《中国兽药典》中尽管未提及含量要求，但其重要性并不亚于黄芩苷，也可作为产品质量控制的另一指标之一;福建金谷科技开发有限公司生产的败毒颗粒，主成分也是绿原酸。为此，建立这2种产品中绿原酸有效的监测方法，对产品质量的控制具有重要指导意义。HPLC法测定绿原酸含量已有不少报道 ［5～8］ ，但由于不同的中药制剂，成分差异很大，测定条件也变化较大。笔者在前人工作的基础上，对HPLC法测定复方中成药中绿原酸含量

进行了进一步探索，并用于测定双黄连口服液、败毒颗粒产品中绿原酸的含量，效果良好，可作为双黄连口服液、败毒颗粒产品质量控制的检测方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Water高效液相色谱仪;Water1525二元泵;Water2487紫外检测器;色谱柱:Symmertry十八烷基键合硅胶柱（Water公司）;BS201S电子天平（北京塞多利斯天平有限公司）;ShloA快速水分测定仪（上海第二天平仪器厂）;数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂 乙醇、甲醇、磷酸等均为分析纯试剂，乙腈为色谱纯;绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所提供）;水为双蒸水;双黄连口服液、败毒颗粒（福建金谷科技开发有限公司提供）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:SymmetryC 18 4.6×75mm（Waters公司）;流动相:乙腈:0.1%磷酸=13:87;检测波长328nm;流速1ml/min;柱温25℃;理论塔板数不低于2300，进样量5μl。

2.2 对照品溶液的配制 精密称取绿原酸对照品4.46mg，用甲醇溶解并定溶于25ml容量瓶中，配成178.4μg/ml的对照品储备液。

2.3 样品溶液的制备

2.3.1 双黄连口服液样品溶液 精密量取双黄连口服液2.0ml，置100ml锥形瓶中，加

乙醇50ml，50℃下超声提取30min，滤过，滤液置100ml容量瓶中定容，得样品溶液1。

2.3.2 败毒颗粒样品溶液 称取败毒颗粒样品2.00g，加入50ml甲醇，50℃下超声提取30min，滤过，将滤液用甲醇定容至100ml，得样品溶液2。

2.4 标准曲线绘制 分别精密移取1，2，3，4，5ml对照品储备液，用甲醇定容至10ml，配成17.84、35.68、53.52、71.36、.20μg/ml的标准溶液，精密吸取5μl注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，以绿原酸峰面积（Y）对相应的浓度（X）进行线性回归，回归方程为:Y=1.63×10 4 X-2.24×10 4 。回归系数R=0.9999（n=5），线性范围17.84～.20μg/ml。

2.5 进样精密度试验 精密量取5μl35.68μg/ml的对照品溶液进样，连续5次，记录峰面积，如556932、550781、560829、554352、5507，平均值为556360，RSD为0.7%，可见进样精密度良好。

2.6 样品测定

2.6.1 样品色谱图 精密量取对照品溶液、样品溶液1、样品溶液2各5μl进样，记录色谱图，如图1所示，样品中绿原酸色谱峰能与样品内源性物质很好分离，保留时间为2.3min。

图1 对照品、样品色谱图 A-对照品;B-样品溶液1;C-样品溶液2

2.6.2 样品溶液稳定性试验 精密吸取“2.3.1”项下的样品溶液5μl，2.5h进样1次。共测6次，峰面积分别为856943、854349、857684、850927、856366、850813，平

均峰面积为854514，RSD为0.66;依同样的方法，测定”2.3.2”项下的样品溶液，RSD为1.12，表明两样品在15h内均稳定。

2.6.3 双黄连口服液中绿原酸含量测定 取双黄连口服液产品5份，按“2.3.1”项下的方法处理得样品溶液，各精密量取5μl进样，在上述色谱条件测定，按峰面积计算样品溶液中绿原酸的含量，产品中绿原酸含量（mg/ml）分别为2.40、2.43、2.44、2.43、2.40，平均值为2.42，RSD为0.80%。

2.6.4 败毒颗粒中绿原酸含量测定 取败毒颗粒液产品5份，按“2.3.2”项下的方法处理得样品溶液，各精密量取5μl进样，在上述色谱条件测定，按峰面积计算样品溶液中绿原酸的含量，产品中绿原酸含量（mg/ml）分别为0.12、0.13、0.13、0.13、0.12，平均值为0.12，RSD为1.60%。

2.7 加样回收率试验

2.7.1 双黄连口服液回收率试验 量取双黄连样品溶液2.0ml于100ml容量瓶中，加入适量对照品溶液，混匀，按样品溶液的制备方法处理，按上述色谱条件测定样品中绿原酸的含量，计算回收率，结果见表1。

表1 双黄连口服液中绿原酸回收率，RSD=2.02%，n=5（略）

2.7.2 败毒颗粒回收率试验 称取败毒颗粒样品2.00g，加入适量对照品溶液，混匀，按样品溶液的的制备方法处理，按上述色谱条件测定样品中绿原酸的含量，计算回收率，结果见表2。

表2 败毒颗粒中绿原酸回收率，RSD=1.72，n=5（略）

3 讨论

按《中国药典》中HPLC法测定绿原酸，其流动相为0.4%磷酸，流速为0.8ml/min ［3］，我们根据本实验室Water高效液相色谱仪的特性改为0.1%磷酸，流速为1ml/min后保留时间缩短且峰形和分离效果更好（如图1）。实验还表明，用HPLC法测定双黄连口服液、败毒颗粒中主要成分绿原酸的含量，方法简便、准确、可靠，可对福建金谷科技开发有限公司生产的双黄连口服液、败毒颗粒产品中绿原酸含量测定和产品质量控制。《中国药典》和《中国兽药典》中双黄连口服液质量标准是以黄芩苷含量来控制产品质量的，没有把绿原酸含量要求列入标准，但绿原酸也是其主要成分之一，直接影响产品的质量。所以，双黄连口服液产品中绿原酸含量测定的建立，对全面控制双黄连口服液产品质量具有重要意义。

参考文献

1 王天制，李永梅.金银花的研究进展.华西药学杂志，2000，15（4）:292-298.

2 阎巧鹃，韩鲁佳，江正强.金银花中绿原酸提取纯化工艺的优化.中国农业大学学报，2002，7（20）:22-26.

3 中国药典委员会.中国药典（一部），北京:化学工业出版社，2000，418-419;117

【摘要】 ：目的 建立同时测定双黄连口服液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素含量的高效液相色谱法。方法 采用VP-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动

相：乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：278 nm。结果 绿原酸在0.44～6.60 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为97.0%；黄芩苷在0.52～6.18 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为98.98%；连翘苷在0.20～2.04 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 3),平均回收率为103.55%；汉黄芩素在0.13～1.76 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为96.49%。结论 本方法简便可行、准确、快速,可用于双黄连口服液中上述4种成分的含量测定。

【关键词】 双黄连口服液 绿原酸 黄芩苷 连翘苷 汉黄芩素 高效液相色谱法 含量测定

双黄连口服液由金银花、黄芩及连翘经提取精制而成,具有辛凉解表、清热解毒功效,对于上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、病毒性肺炎等细菌和病毒感染性疾病有一定疗效。其中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素是其主要活性成分。2005年版《中华人民共和国药典》(一部)采用高效液相色谱法只测定了绿原酸、黄芩苷、连翘苷的含量[1],而且是采用包括甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸-水的不同流动相分别测定。本试验参照文献[2],通过优化色谱条件,建立了不经提取分离,利用梯度洗脱法同时测定上述4种成分含量的高效液相色谱法,具有简便可行、准确、快速的特点,减少了配制流动相的步骤和进样次数,提高了工作效率,取得了满意效果。

仪器与试药

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪；SPD-10Avp紫外可见检测器；CLSS-VP色谱工作站；CTO-10ASvp柱温箱；7725i手动进样器。绿原酸对照品(批号110753-200212)、黄芩苷对照品(批号110715-200514)、连翘苷对照品(批号110821-200609)、汉黄芩素对照品(批号110514-200403)均由中国药品生物制品检定所提供。双黄连口服液由中国人

民252医院药剂科提供,批号20070115、20070121、20070212。甲醇、乙腈均为色谱纯,磷酸为分析纯,水为三蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：岛津VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)(A＋B＝100%)作梯度洗脱, t＝0→6 min,A：27%；t＝6→10 min,A：30%；t＝10→15 min,A：60%；t＝15→25 min,A：90%；流速：1.0 mL/min；检测波长：278 nm；柱温：25 ℃；进样量20 μL。在上述色谱条件下,4种待测组分与邻近组分达到了基线分离,理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品适量,置10 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别制成浓度为1.10、1.03、0.51、0.44 mg/mL的对照品母液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密吸取双黄连口服液1.0 mL,置50 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

按处方比例及制备工艺,分别制备缺金银花、黄芩、连翘的阴性对照样品,按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取绿原酸对照品母液0.20、0.40、0.75、1.50、3.0 mL,黄芩苷对照品母液0.25、0.50、1.0、2.0、3.0 mL,连翘苷对照品母液0.20、0.40、0.60、1.20、2.0 mL,汉黄芩素对照品母液0.15、0.25、0.50、1.0、2.0 mL,对应加入10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成5个浓度的混合对照品溶液,进样测定,记录色谱图。以峰面积为纵坐标,分别以绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素进样量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程。绿原酸：Y＝1.04×107X＋1.40×105, r＝0.999 6；黄芩苷：Y＝3.87×106X－1.26×104,r＝0.999 9；连翘苷：Y＝6.44×105X＋1.74×104,r＝0.999 9；汉黄芩素：Y＝6.30×106X＋1.45×105,r＝0.999 9。结果表明,绿原酸进样量在0.44～6.60 μg范围内,黄芩苷进样量在0.52～6.18 μg范围内,连翘苷进样量在0.20～2.04 μg范围内,汉黄芩素进样量在0.13～1.76 μg范围内,线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素混合对照品溶液注入液相色谱仪,连续进样5次,绿原酸峰面积RSD＝1.12%,黄芩苷峰面积RSD＝0.86%,连翘苷峰面积RSD＝0.72%,汉黄芩素峰面积RSD＝0.58%。结果表明,所选方法精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样,测定样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的峰面积,结果绿原酸RSD＝1.74%,黄芩苷RSD＝2.04%,连翘苷RSD＝1.81%,汉黄芩素RSD＝2.38%,表明样品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

精密称取同一批号5份样品,按供试品溶液制备方法制备,进样,记录峰面积,结果绿原酸RSD＝1.48%,黄芩苷RSD＝1.53%,连翘苷RSD＝1.34%,汉黄芩素RSD＝1.58%,表明方法重复性良好。

2.7 阴性对照试验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,绘制色谱图。结果阴性对照溶液在供试品溶液及对照品溶液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素保留时间相应位置上均无吸收峰出现,表明阴性对照无干扰。

2.8 加样回收率试验

精密量取同一批号0.2 mL双黄连口服液4份于50 mL容量瓶中,分别加入绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品溶液适量,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤。按“2.1”项下色谱条件进样测定其含量,计算加样回收率,结果见表1。表1 绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素回收率测定结果(略)

2.9 样品含量测定

取3批样品,按“2.2.2”项下方法分别制成供试品溶液,精密吸取对照品溶液和供试品

溶液注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,用外标法计算样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的含量,结果见表2。表2 样品含量测定结果(略)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

2005版《中华人民共和国药典》(一部)高效液相色谱法测定绿原酸的含量时对供试品溶液处理采用加水稀释样品的方法,测定黄芩苷的含量时采用50%甲醇超声处理20 min,测定连翘苷的含量时采用过中性氧化铝柱洗脱。文献报道也多采用上述方法[3-6]。我们在试验中观察到：50%甲醇超声处理20 min与50%、100%甲醇溶解、过滤所得色谱峰的峰面积结果无明显区别,而溶解过滤操作更为简便易行,所以,选择甲醇溶解过滤供试品。制备供试品溶液使用纯甲醇和50%甲醇做溶剂所得色谱峰的峰形、峰面积均无明显区别,从节约成本的角度出发,本试验最终选择50%甲醇溶解、过滤制备供试品溶液。

3.2 检测波长的选择

本试验对绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素4种对照品进行了200～400 nm紫外光谱扫描,结果表明,绿原酸在218 nm处有较强的吸收,在240 nm和295 nm处有次强吸收；黄芩苷在278 nm处有较强的吸收,在315 nm处有次强吸收；连翘苷在228 nm处有较强的吸收,在278 nm处有次强吸收；汉黄芩素在278 nm处有一个最大吸收峰。考虑到连翘苷和汉黄芩素在样品中含量较低,而绿原酸和黄芩苷在样品中含量较高,为了提高连翘苷和汉黄芩素检测灵敏度,以选择汉黄芩素的最大吸收波长278 nm作为检测波长,提高汉黄芩素的检测灵敏度,减少4个成分峰之间峰高的差别。

3.3 流动相的选择

我们在试验中发现,甲醇与水混合压力明显增高,而乙腈同样与水混合并不如此。与甲醇相比,乙腈的洗脱能力强,且粘度较小,柱压大小比较合适,可以满足色谱系统流速在1.0 mL/min条件下检测的要求,并且系统分离效果较好,峰形对称,柱效高,保留时间适宜。因此,综合来看,乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。试验中观察到,乙腈-磷酸比乙腈-水做流动相所得的色谱峰要稍微敏锐,拖尾减少。而且,我们曾经尝试对磷酸的浓度进行0.1%～1.0%调节,发现在此范围内对峰形的变化无明显影响,从保护色谱柱的角度考虑,决定采用乙腈- 0.2%磷酸溶液作为流动相。

洗脱方式的选择

本制剂为中药复方,成分较复杂,且黄芩苷与汉黄芩素分别为黄酮苷和黄酮苷元,极性差别较大,采用等度洗脱法难以达到有效分离。曾选用乙腈-0.2%磷酸(30∶70)的色谱条件,绿原酸与邻近组分分离效果不佳,而汉黄芩素的对照品在40 min左右出峰,保留时间明显延长,样品溶液在同一保留时间里未发现相应的色谱峰。采用梯度洗脱的方法,在检测过程的前6 min保持乙腈的比例为27%,使绿原酸与邻近组分达到基线分离；6～25 min将乙腈的比例逐步提高到90%,一方面缩短汉黄芩素的出峰时间,更重要的是通过大幅度增加乙腈的浓度来提高洗脱效果,结果汉黄芩素对照品在22.5 min左右出峰,供试品与对照品在同一保留时间里有一相应的色谱峰,分离效果较好,峰形对称。在此条件下,黄芩苷和连翘苷的保留时间适宜,峰形对称,分离度好,从而可以将上述4种成分同时测定。

【参考文献】

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.405

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[2] 金永新,要林青,杨晓冬,等.RP-HPLC法同时测定复方鱼腥草片中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量[J].中国药师,2004,7(7)：524－526.

[3] 刘 芳.高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸的含量[J].湖北中医杂志,2003,25(9)：46－47

[4] 陈玉谊.HPLC测定双黄连口服液中黄芩苷的含量[J].海峡药学,2003, 15(4)：47－48.

[5] 张玉洁,黄海欣.HPLC测定双黄连口服液中连翘苷的含量[J].华西药学杂志,2005,20(4)：360－361.

[6] 方崇波.高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J].医药导报,2004,23(12)：951－952.