Western Blot步骤

1、清洗，安装玻璃板，配胶（若冬天做实验，首先开水浴锅，将有结晶的SDS放入水浴锅中）首先将10%AP配好（0.1gAP+1ml纯水）最后加AP。（每加一步均看管中液体总量与所加量是否一致） 试剂的配置如下表：

制胶成分 单蒸水 Gel Buffer(上下不同） Acrylamide/Bis 10%SDS TEMED 10%AP(过硫酸铵，最后加！） 下层胶（两块*2） 7.5% 8.0ml 4.0ml 4.0ml 180ul 12ul 120ul 10.5% 6.6ml 4.0ml 5.4ml 180ul 12ul 120ul 12.5% 5.4ml 4.0ml 6.6ml 180ul 12ul 120ul 15% 4.0ml 4.0ml 8.0ml 180ul 12ul 120ul 上层胶（两块*2） 5% 4.6ml 2.0ml 1.34ml 80ul 16ul 40ul

上层Gel Buffer 0.5M Tris-HCL,PH6.8 下层Gel Buffer 1.5M Tris-HCL,PH8.8

2、制胶（若冬天需要在板底部包一层保鲜膜），先加入第一后看看是否漏胶，若不漏胶则可继续加，下层胶加至绿线下约0.5cm处（保证正丁醇压胶后，胶能再与缺口同平），管中剩下一些胶，以掌握凝胶时间。加正丁醇，最后一正丁醇由左向右拖一下。（冬天放在水浴锅中凝胶）。凝胶后多放置一会儿，使胶稳定，将正丁醇冲洗干净，用滤纸将残余水吸干，不可碰到胶面，之后在通风处中风干一会儿，加上层压缩胶，要带水加胶，不可弄出气泡。加满后插入梳子，若为无牙的梳子，要向左顶头，保证只坏一个孔，梳子分1.0与1.5mm的（插完梳子后，再补上几胶，待胶凝固）。

3、电泳液配置（两块胶500ml,四块1000ml)

Tris-Base 1.51g Tris-Base 3.03g

甘氨酸 7.2g 500ml 甘氨酸 14.4g 1000ml SDS 0.5g SDS 1.0g 安好电泳槽后，先倒入电泳液看漏不漏，不漏则倒入电泳液。

4、加样，不要使蛋白溢出。

5、电泳：先60V，待Marker跑散（1小时）后改为90V.根据目的蛋白大小定电泳时间。

6、转移液配置

Tris-Base 5.52g Tris-Base 2.76g 甘氨酸 2.93g 甘氨酸 1.465g

甲醇 200ml 1000ml 甲醇 100ml 500ml 10%SDS 3.75ml 10%SDS 1.875ml

7、转膜准备：5*8cm膜, 在电泳液泡1-3min,之后连同胶在转移液中泡30min。

8、转膜：每附一层要赶气泡，海绵和膜可来回滚动赶气泡。胶只可轻压，一点点轻压赶气泡。若为30-80KD蛋白。一般转膜60min左右，若遇到分子量小10-30KD的蛋白，则转膜40min。80-120KD，为100min.120-200KD,为150min.（自己视情况而定）

9、5%脱脂牛奶（TBST配置）封闭1-2h，剪膜（180、130、95、72、55、43、34、26、17、11）

10、附一抗（1：1000稀释）封闭液配置，4℃过夜。

11、洗一抗1*TBS配洗膜液1L，1ml吐温10min*3次（远离摇床开关）

12、附二抗，附1-2h后洗膜，15min*3-6次。 13、曝光（冬天显影液需预热）膜先在滤纸上吸干后放在塑料膜上，加上增强显影液（A:B=1：1)反应3-5min后盖膜，赶走气泡，曝光。