红霉素发酵中生长-生物合成的关系
R. L. Smith、H. R. Bungay和R. C. Pittengek 礼来公司，印第安纳波利斯，印第安纳州
1962年1月2日收到出版
摘要
Smith，R. L.（礼来公司，印第安纳波利斯，印第安纳州）、H. R. Bungay和R. C. Pittengek. Growth-biosynthesis relationships in erythromycin fermentation. Appl. Microbiol. 10:293-296. 1962。——红霉素生物合成与生长的关系似乎随在其中微生物生长的发酵培养基而变化。在含有复合氮源的培养基中，抗生素的生产仅在生长停止时发生，而在含有甘氨酸的合成培养基中，两个参数在几乎相同的时间增加。报道通过添加红霉素来自体刺激抗生素生产。还描述的是使用标记的前体作为在很短时间内生物合成速率的指标。
由Gerzon等人（1956）和Wiley等人（1957）的红霉素结构的阐明已经允许有关其生物合成的合理实验。使用放射性示踪物已经表明，内酯环是由丙酸盐形成（Corcoran、Kaneda和Butte，1960；Grisebach、Achenbach和Hofheinz，1960；Vanek等人，1958，1959），红霉脱氧糖胺（desosamine）的甲基来自甲硫氨酸（Majer等人，1959，1961），以及红霉脱氧糖胺和克拉定糖都来自完整糖骨架。虽然这些构建块通过类推到其它生化反应提出可能反应顺序，但是生物合成的实际路径仍不清楚。为了更好地了解生物合成过程，我们开始一项生
长、营养和抗生素生产之间的关系的研究。
材料和方法
生物体和培养方法。将红霉素链霉菌（Streptomyces erythreus）（礼
来编号C-233）的红霉素生产菌株以孢子状态维持在冷藏条件下保持的蛋白胨琼脂斜面。将从这些斜面中的一个斜面生长的十分之一转移到营养培养基开始发酵周期。在32℃下，在设定为246转/分且描述2英寸圈的旋转振荡器上培养48小时后，将1 ml转移到以2个牛奶过滤盘密闭的500 ml广口锥形烧瓶中100 ml发酵罐培养基中。当对初始发酵罐生长进行研究时，将接种物在生理盐水中洗涤三次。
培养基。所用的复合培养基具有以下配方：（营养性）0.5%玉米浸
液固体、1.5%大豆油粕粉、0.5%酵母、0.5% NaCl和0.3% CaCO3；（发酵罐）与营养性相同，其中添加5.0%蔗糖和0.5%酵母。 由蔗糖、甘氨酸和盐组成的合成培养基是由Corum等人（1954）描述的那种培养基，不同的是将硫酸镁与补充矿物质溶液组合并且单独灭菌。
发酵。一式三份的发酵罐烧瓶在所指示的时间通过取回5.5 ml培养
液取样。合成培养基中的菌丝重量是从在配衡的Whatman 1号纸上收集并在105℃下干燥的2 ml样品测定。测定滤液的抗生素含量。全培养液的第二个2 ml样品是用于pH测定，然后过滤以通过蒽酮法测定总糖。在复合培养基中的生长量是同样地对烘箱干燥滤饼进行测定，但对于非菌丝固体不进行校正。
红霉素是通过由Corum等人（1954）描述的微生物学检定法测定。
结果是一式三份平均值，并且在大多数情况下，是至少三个实验的典型值。复合或合成培养基的正常产率为约2000单位/ml。
放射化学实验。给每个100 ml的发酵烧瓶中加入0.1 me丙酸钠
-1-C14（1.0 me/毫摩尔的比活性）；在不同的时间间隔取出发酵培养液的2 ml样品并离心。将上清液流体的部分施加到纸条带并在一些色谱系统中显影。用湿乙醚显影，以缓冲的Whatman 1号纸获得抗生素因素的良好解析率。接种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）板的生物自显影法被用来确定抗生素区域。所有解析的红霉素区域的总放射性是通过纸条带段的气体流计数来测定。通过浸渍计数液体中的一些段检查并确定在液体闪烁计数器的放射性大大提高精度，但导致结论没有变化。在纸色谱解析的红霉素区显示39%的起始放射性，其中此超过85%是在红霉素A中。
在利用甘氨酸-1-C14或甘氨酸-2-C14的实验中，如上所述加入化合物和取样品，不同的是以10-μc量。在这些情况下，培养液的溶剂提取物用假设进行计数，基于丙酸盐-C14的结果，只有红霉素因素会含有标记的碳。
结果
在复合培养基中由红霉素链霉菌生产红霉素是在接近第二天结束时开始，在该时间微生物的生长基本上完成（图1）。生物合成继续，只要糖是以显著量存在，且添加蔗糖到糖耗尽的发酵导致重新生产红霉素；但是，当同时供给大豆油粕粉时可以防止这种刺激（表1）。这样的其它含氮化合物如甘氨酸或氯化铵在未报告的实验中显示，得
到同样的效果，但我们的努力集中于大豆油粕粉，因为它是正常培养基成分。为了更直接地确认氮逆转，必要的是采用短期实验，其中在添加氮源后不久测定生物合成。由于微生物检定缺乏足够的精度来证明抗生素效价的微小差异，所以我们使用标记的丙酸盐摄取作为红霉素生物合成的指标。如4天龄的培养物中由丙酸盐-1-C14的摄取所显示，在已供给蔗糖和有机氮的细胞中正常的合成大大降低（表2）。葡萄糖、麦芽糖和果糖显示与蔗糖相同的抗生素生产刺激；这些效果同样地是通过同时加入含氮营养物进行中和（表3）。
生长
抗生素
生长
糖
抗生素
糖
天数
图1.在复合培养基中抗生素生物合成与糖利用率和微生物生长有关。
表1.在复合培养基中通过大豆粕粉增加来自蔗糖的生物合成和逆转
加入的成分 蔗糖 大豆粕粉
效能增量
运行1 运行 2 运行3
*所指示的成分是在第5天以等于其组成中一半的浓度添加。 +结果是以在第7天和第12天之间出现的变化（单位/ml）给出。
表2.丙酸盐-1-C14的摄取同样受氮和蔗糖存在的影响*
添加丙酸盐-1-C后的时间
14
并入红霉素
对照 供给细胞
计数/min
计数/min
*使细胞在复合培养基上生长4天，然后在一种情况下，供给大豆粕粉和蔗糖；4小时后，添加标记的丙酸盐并如上下文中所述取样品。计数取自已施加10 μl培养液的标准化色谱。结果是两次类似运行的平均值。
表3.由氮逆转糖刺激
供给到复合培养基
糖 大豆粕粉 蔗糖 蔗糖 葡萄糖 葡萄糖 麦芽糖 麦芽糖 果糖 果糖
红霉素的变化相对于对照的变化+
*在第4天以原始培养基浓度的一半的浓度进行添加。 +
结果是作为单位/ml给出，通过其每个变量不同于由第4天和第7天之间的对照（不供给）烧瓶所示的增加。在第7天，对照平均为1,920单位/ml。
