一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106967672 A(43)申请公布日 2017.07.21

(21)申请号 201710182940.0(22)申请日 2017.03.24

(71)申请人 四川大学华西医院

地址 610041 四川省成都市武侯区国学巷

37号(72)发明人 陈崇　纳飞飞　

(74)专利代理机构 四川力久律师事务所 51221

代理人 熊晓果(51)Int.Cl.

C12N 5/071(2010.01)C12N 5/09(2010.01)A61K 35/13(2015.01)A01K 67/027(2006.01)

权利要求书2页 说明书9页 附图5页

(54)发明名称

一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法

(57)摘要

本发明公开了一种体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，包括获取新鲜的人源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞；体外3D培养条件培养人肺组织及肺癌组织类器官。体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官（organoid）的方法：获取新鲜的人源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞；体外3D培养条件培养人肺癌组织类器官；H&E染色明确结构及形态，q-PCR检测相关基因表达；免疫荧光染色鉴定细胞来源检测相关蛋白表达。以及基于上述的类器官构建小鼠动物模型的方法，对于构建大规模一致性好的人源、原位肺癌动物模型具有重要的意义，为肺癌的基础研究工作提供较好的基础及相关临床应用前景。

CN 106967672 ACN 106967672 A

权　利　要　求　书

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1.一种体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，包括获取新鲜的人源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞；体外3D培养条件培养人肺癌组织类器官。

2.如权利要求1所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，获取新鲜的人源肺癌组织，胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合后使用条件培养基培养。

3.如权利要求2所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，所述条件培养基含有以下成分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、A83-01、FGF10、Nicotinamide、Y-27632*、WNT3a、Glutamax、N2、Gastin中的一种或多种。

4.如权利要求3所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，至少含有其中的FGF10，R-spondin1，Noggin，WNT3a，A83-01，B27/N2。

5.如权利要求3所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，所述条件培养基的成分如下：

6.如权利要求2所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取肺组织和/或肺癌组织剪碎，优选在冰上剪碎或同等低温环境剪碎，或同等低温环境机械破碎；

(2)取剪碎的组织块，胶原酶消化处理，优选在gentalMACS全自动组织处理器上运行Human Lung及Human Tumor程序1，用胶原酶重悬；优选的，剪碎的组织块用量为0.5-1克，胶原酶的用量为10mL；

(3)将胶原酶处理后的组织块，在36-38℃继续消化处理10-30min；优选为37℃摇床上进行消化处理，消化时间优选20min；

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权　利　要　求　书

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(4)将经过消化的溶液转移到全自动组织处理器gentalMACS上；优选地，在gentalMACS上，运行Human Lung及Human Tumor程序2；

(5)步骤4处理后的溶液，在36-38℃继续消化处理5-20min；(6)将步骤5处理好的含有肺组织细胞的液体用80-130μm细胞筛网过滤细胞，优选100μm细胞筛网过滤；过滤后，加入8-15ml DMEM/F12终止消化，离心去除上清液；

(7)去除红细胞，优选使用红细胞裂解液重悬；更优选用5ml红细胞裂解液在冰上裂解2-10min；

(8)离心去除上清液；优选离心温度2-8℃，100-300g离心3-10min；(9)加入DMEM/F12重悬，优选加入10mL DMEM/F12重悬，然后离心去除上清液；(10)细胞计数，混合Martrigel，20000细胞每40μL，滴于48孔板孔中；(11)转移至培养箱，36-38℃，3-8％CO2环境下10-20min，凝固Martrigel；(12)每孔加入150μL细胞培养基，优选细胞培养基是条件培养基，36-38℃、3-8％CO2细胞培养箱中培养；

(13)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出人肺组织类器官或者细胞群；更换的培养基同步骤12中的细胞培养基，优选为条件培养基。

7.一种肺癌动物模型构建方法，包括以下步骤：(1)获取新鲜的人源肺癌组织，胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合后在48孔板中使用条件培养基培养，得到人肺癌组织类器官；

(2)将人肺癌组织类器官，原位注射到免疫缺陷的小鼠肺组织中，得到人源、原位肺癌肿瘤的小鼠；优选地，通过注射将人肺癌组织注射到免疫缺陷的小鼠肺组织中。

8.如权利要求7所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，对步骤1培养得到的人肺癌组织类器官，培养并扩增数量，形成一致性好的人肺癌组织类器官材料。

9.如权利要求7所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，在免疫缺陷的小鼠接受人肺癌类器官后定期采用Micro CT成像技术观察小鼠肺部肿瘤形成情况，优选为，每3-4周进行Micro CT观察。

10.如权利要求3所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，其特征在于，在免疫缺陷的小鼠接受人肺癌组织类器官注射，定期检测，待肿瘤形成后处死小鼠，收集小鼠肺组织，通过免疫荧光、H&E染色等手段检测肿瘤形成状况及肿瘤的来源。

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一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型

方法

技术领域

[0001]本发明属于生物医药领域，特别是人肺正常组织及肺癌组织类器官培养体系，属于细胞培养或组织培养技术。本发明还包括了利用培养得到的肺癌组织构建小鼠动物模型的方法。

背景技术

[0002]肺癌是目前发病率及死亡率第一的恶性肿瘤，肺组织/肺癌组织细胞原代培养及肺癌动物模型是研究肺癌发生、发展及治疗等的重要工具。

[0003]传统的二维细胞培养技术使得培养的细胞在体外环境下逐渐失去其在体内原有状态，其形态、生物功能、遗传等方面的表现和人体内细胞差异极大，不能够满足现有的对于人肺癌医学研究需要。

[0004]体外3D培养条件下使用成熟人体细胞培养人体组织类器官(organoid)，这种类器官可在体外表现出与体内细胞相似的遗传物质以及结构的稳定性，并可以在体内和体外被顺利诱导为具有正常功能的组织细胞。科学家已成功在体外3D培养条件下使用成熟人源组织细胞培养出肝脏、小肠等组织类器官。这些类器官细胞在体外培养条件下保持与体内细胞相似的遗传物质，并且具有形态结构的稳定性，可以在体内外被顺利诱导为具有正常功能的对应组织细胞。这一技术可以为研究提供充足的遗传稳定、均一的体外培养的组织细胞，并将可能对直接研究基因在人体细胞中的作用提供巨大的帮助。[0005]目前还未有关于肺组织及肺癌组织类器官培养的方法，成功在体外构建肺组织及肺癌组织类官培养体系，可以为我们提供充足的遗传稳定、均一的体外培养人源肺正常细胞或肺癌细胞，将对肺及肺癌研究提供巨大的帮助。[0006]另外，当前常用于科学研究的肺癌动物模型主要分为三类，包括基因工程小鼠模型、移植瘤模型以及人源异种移植瘤模型(PDX，patient derivedXenograftmodel)，如表1所示。

[0007]表1肺癌动物模型

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由于小鼠肿瘤基因组研究结果距离直接用于指导人类肿瘤基因组学研究还有较

大距离；而细胞系移植瘤模型则局限于细胞系与人源肿瘤细胞从基因及生物学功能等方面差异；PDX模型虽然部分弥补了上述两种模型的缺陷，且也是当前较为流行的研究人源肿瘤生物学特征或药物筛选及鉴定的主要方法，但仍存在局限，由于皮下移植的原因，传统PDX模型无法提供肺组织原位微环境，进而可能导致人源肿瘤在实验过程中相关生物学特征丢失，无法模拟人体内的情况；另一方面，构建PDX模型对人源肺癌细胞数量有一定的要求(每只小鼠需要5*10^5个细胞对应组织块)，而目前临床肿瘤标本非常珍贵，一些特殊的临床标本如穿刺标本等小标本可供实验研究的组织细胞量较少，可能无法满足模型构建需求。

[0010]

发明内容

[0011]本发明的目的在于克服现有技术中缺少遗传稳定、均一的体外肺组织/肺癌细胞培养方法，所存在的对于肺癌发病机理、肺癌治疗药物研究的问题，提供一种人肺正常组织和/或肺癌组织培养方法。成功采用3D培养技术在体外构建肺组织及肺癌组织类官培养体系，为实验研究提供充足的遗传稳定、均一的，与人体细胞高度一致的体外培养细胞，将对肺及肺癌研究提供巨大的帮助。[0012]为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：[0013]一种体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，包括获取新鲜的人源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞；体外3D培养条件培养人肺癌组织类器官。[0014]本发明中应用了3D培养技术，在体外环境中培养得到了具有遗传稳定、均一的肺组织、肺癌组织细胞。结合对于人肺组织细胞体外培养具有重要意义的培养条件，成功实现了肺组织、肺癌组织的活性培养，且具有非常接近人体内肺组织、肺癌细胞组织的活性特点，对于有关于肺及肺癌的研究试验的基础条件提供了可靠的实验原料，能够实现促进科学研究的作用。[0015]进一步，所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，获取新鲜的人源肺癌组织，胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合后使用条件培养基培养。[0016]进一步，所述条件培养基含有以下成分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin1、A83-01、FGF10、Nicotinamide、Y-27632*、WNT3a、Glutamax、N2、Gastin中的一种或多种。优选的至少必须含有其中的FGF10，R-spondin1，Noggin，WNT3a，A83-01，B27/N2。[0017]进一步，所述体外培养人正常肺组织及肺癌组织类器官的方法，亦称人肺正常组织和/或肺癌组织培养方法，包括以下步骤：[0018](1)取肺组织和/或肺癌组织剪碎，优选在冰上剪碎或同等低温环境剪碎，或同等低温环境机械破碎。肺组织和/或肺癌组织来源于合法途径的实验室提供，或者肺癌治疗患者的检测分析样/留样，或者已有的实验室培育的用于研究的肺癌细胞，可以是任意合法途径得到的肺组织、肺癌组织等。

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(2)取剪碎的组织块，胶原酶消化处理，优选在gentalMACS全自动组织处理器上用

胶原酶重悬。具体的：用胶原酶重悬剪碎的组织块，用gentalMACS全自动组织处理器在C tube中运行Human Lung(人肺)及Human Tumor(人肿瘤)程序1；优选的，剪碎的组织块用量为0.5-1克，胶原酶的用量为10mL。所述gentleMACS为全自动组织处理器，可以使用其他同类的处理仪器进行相应的消化分散处理。[0020](3)将胶原酶处理后的组织块，在36-38℃继续消化处理10-30min。优选为37℃摇床上进行消化处理，消化时间优选20min。优选摇床速度为100-300rpm，最好是220rpm，摇床上完成消化使得组织细胞充分分散开来。[0021](4)将经过消化的溶液转移到全自动组织处理器gentalMACS上。优选地，在gentalMACS上，运行Human Lung及Human Tumor程序2；[0022](5)步骤4处理后的溶液，在36-38℃继续消化处理5-20min。优选37℃、220rpm摇床处理，处理时间优选为10min。[0023](6)将步骤5处理好的含有肺组织细胞的液体用80-130μm细胞筛网过滤细胞，优选100μm细胞筛网过滤；过滤后，加入8-15ml DMEM/F12终止消化，优选加入10ml DMEM/F12终止消化；离心去除上清液，优选离心参数为2-10℃，100-300g，3-8min离心，例如4℃、200g、5min离心处理去除上清液。[0024](7)去除红细胞，优选使用红细胞裂解液重悬。更优选用5ml红细胞裂解液在冰上裂解2-5min，优选5min。[0025](8)离心去除上清液；优选离心温度2-8℃，100-300g离心3-10min。例如4℃，200g，离心5min。离心以后去除了红细胞裂解液以及被裂解液破坏的红细胞，得到纯净的肺组织细胞。[0026](9)加入DMEM/F12重悬，优选加入10mL DMEM/F12重悬；然后离心去除上清液，优选2-10℃，100-300g，3-8min离心去除上清液，最好是4℃，200g，5min离心，去除上清。[0027](10)细胞计数，混合Martrigel，20000细胞每40μL，滴于48孔板孔中。最好是滴于各个板孔的正中，避免细胞培养液滴入孔板孔时接触孔壁，根据实验情况可以选用其他规格的孔板，不影响发明实现。[0028](11)转移至培养箱，36-38℃，3-8％CO2环境下，凝固Martrigel。优选在37℃，5％CO2环境下凝固。优选地，凝固时间为10-20min。[0029](12)每孔加入150μL细胞培养基，优选细胞培养基是条件培养基，36-38℃、3-8％CO2细胞培养箱中培养；优选在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。[0030](13)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出人肺组织类器官或者细胞群。更换的培养基同步骤12中的细胞培养基，优选为条件培养基。

[0031]本发明的上述人肺组织/肺癌组织的培养方法，通过将肺组织/肺癌组织经过机械破碎，消化分散，除去红细胞，加入适当的培养基最终实现了体外培养肺细胞及肺癌细胞形成类器官的目的。而在培养的过程中，可以通过优化培养基的成分，实现对于肺组织细胞的3D培养控制，实现类器官的构建，细胞增殖的同时自然分化形成类器官组织。[0032]进一步优选地，所述条件培养基的成分如下：

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[0033]

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本发明的肺组织/肺癌组织培养方法选用上述特别准备的条件培养基，可以更好

的应用于肺组织/肺癌组织的培养需要，实现3D培养，收集得到类器官，反应出肺组织/肺癌组织的活性特点，应用于不同的研究。

[0036]本发明的另一目的在于克服现有技术中基于基因工程小鼠模型或人源皮下移植瘤模型，在基因层面、肿瘤微环境、肿瘤发展及病理生理等方面与人源肿瘤相差较大，提供一种更接近人源肺癌特征、符合临床研究需求的肺癌模型。实现构建的动物模型具有人源、原位的特点，接近人肺癌组织的生物学特性，能够大规模高一致性的构建动物模型的方法。[0037]为了实现第二个发明目的，提供了以下技术方案：一种肺癌动物模型构建方法，包括以下步骤：[0038](1)获取新鲜的人源肺癌组织，胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合后在48孔板中使用条件培养基培养，得到人肺癌组织类器官。可以是如上所述肺组织/肺癌组织的类器官培养方法进行培养得到的类器官，也可以是其他方法进行培养得到的类器官(目前尚未有人公布过)。本发明主要采用上述方法培养的肺组织/肺癌组织类器官。[0039](2)将人肺癌组织类器官，原位注射到免疫缺陷的小鼠肺组织中，得到人源、原位肺癌的小鼠动物模型。优选地，通过注射将人肺癌组织注射到免疫缺陷的小鼠肺组织中，注射方便简单，精确度高，能够有效的一致的将类器官输送到目标位点。主要是结合了上述3D培养技术培养的高活性肺癌组织类器官，所以经过注射到免疫缺陷的小鼠肺组织中，能够实现稳定的动物模型构建。[0040]其中，对于肺癌组织细胞培养技术同上述的类器官培养技术。[0041]上述的小鼠动物模型的构建方法，基于体外3D培养技术培养的大量的高度一致性的肺癌类器官进行原位注射，体外3D培养的肺癌组织细胞具有较高的活性，在原位注射以后可以分化形成人源、原位肺肿瘤，非常接近人体内肺癌发生情况，可以更好的应用于肺癌研究工作。

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进一步优选地，步骤1培养得到的人肺癌组织类器官，观察肺癌类器官生长特征，

建立完善的肺癌类器官培养体系。[0043]进一步优选地，对步骤1培养得到的人肺癌组织类器官，培养并扩增数量，形成一致性好的人肺癌组织类器官材料。[0044]进一步优选地，在免疫缺陷的小鼠接受人肺癌类器官后定期采用Micro CT成像技术观察小鼠肺部肿瘤形成情况，优选为，每3-4周进行Micro CT观察。更优选第8周进行CT观测。

[0045]进一步优选地，在免疫缺陷的小鼠接受人肺癌组织类器官注射，定期检测，待肿瘤形成后，优选3个月后，处死小鼠，收集小鼠肺组织，通过免疫荧光、H&E染色等手段检测肿瘤形成状况及肿瘤的来源。[0046]进一步，试验开始之前，向伦理委员会申请动物实验同意书，本发明的主要目的是造动物模型，在造动物模型的实验过程中涉及到动物伦理，所以需要向伦理委员会申请动物实验同意书，为伦理科学研究的基础先决条件保障。[0047]与现有技术相比，本发明的有益效果：

[0048]本发明结合肺组织及肺癌组织细胞体内生长特点，设计了适宜的3D培养条件，培养得到的细胞群分化出类器官的形态，更加接近于人体内的肺组织及肺癌组织。

[0049]本发明将3D培养得到的人肺癌组织类器官原位移植到免疫缺陷的小鼠肺部，构建人源原发肺癌肿瘤动物模型，非常接近人类肺癌的生物学特点，具有较高的研究价值。并且，由于采用体外3D培养基传代培养扩增规模，小鼠动物模型的数量更容易扩大，动物模型相互之间具有高度的一致性，非常有利于科学实验研究需要。附图说明：

[0050]图1是原代肺及肺癌类器官培养流程示意图

[0051]图2是新鲜肺组织通过胶原酶解离为单细胞后第2、6、14天(第3代)在Matrixgel中生长情况

[0052]图3是肺正常组织类器官H&E染色(上图：40x；下图：100x)

[0053]图4是新鲜肺癌组织通过胶原酶解离为单细胞后第10天在Matrixgel中生长情况[0054]图5是通过免疫荧光检测肺组织类器官中NKX2.1、Ki67的蛋白表达情况。[0055]图6是通过q-PCR检测人肺组织类器官与肺组织中NKX2.1、SFTPC、HOPX、NCAM、SYN等的基因表达相对水平；

[0056]图7小鼠动物模型构建流程。

[0057]图8是肺癌组织类器官原位注射后3个月，通过免疫荧光检测小鼠肺组中CD298的蛋白表达情况。(CD298仅标记人源细胞)

[0058]图9是肺癌组织类器官原位注射后3个月，通过Micro CT检测小鼠肺组织成瘤情况，及相应肺组织H&E染色。具体实施方式

[0059]本发明中的部分英文缩写解释如下：[0060]DMEM：是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养，购买自

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GIBCO公司。

[0061]DMEM/F12：是F12培养基和DMEM培养基按照1：1结合，称为DMEM/F12培养基。综合了F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度养分的优点。购买自GIBCO公司。[0062]Martrigel，从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。购买自BD公司。[0063]B27，即B27补充剂，市售产品，可用于配制培养基。B27补充剂以50倍的液体浓缩液提供，除其它成分外其包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。购自Life Technologies公司。[00]N-acetylcysteine：N-乙酰半胱氨酸，购买自Sigma公司。[0065]EGF，表皮生长因子，市售产品，购买自R&D公司。[0066]Noggin，细胞生长蛋白成分，市售产品，购买自Peprotech公司。[0067]R-spondin 1，人细胞生长编码蛋白，市售产品，购买自Peprotech公司。[0068]A83-01，TGF-β抑制剂，购买自Tocris Bioscience公司。[0069]FGF10，成纤维细胞生长因子，购买自Peprotech公司。[0070]Nicotinamide，烟酰胺，购买自Sigma公司。[0071]Y-27632*，ROCK特异性通路阻断剂。购买自Abmole Bioscience公司。[0072]WNT3a，WNT激动剂，细胞中激活TCF/LEF-介导的转录的因子，购买自PeproTech公司。

[0073]Glutamax，市售细胞培养添加剂，购自：GIBCO公司。[0074]N2，N2补充剂以100倍的液体浓缩液提供，其包含500μg/ml人转铁蛋白，500μg/ml牛胰岛素，0.63μg/ml黄体酮，1611μg/ml腐胺和0.52μg/ml亚硒酸钠。购自Life Technologies公司。[0075]Gastrin，胃泌素，购买自Sigma公司。[0076]TrypLE，用于解离贴壁哺乳动物细胞的重组消化酶，购买自GIBCO公司。[0077]在本发明的一个具体的实施方案中，本发明还提供对于培养得到的肺组织和/或肺癌组织的传代方法。为了提供足够的肺组织/肺癌组织的类器官进行相应的动物模型构建，需要建立起传代稳定的肺组织/肺癌组织类器官，本发明的以下方案具有优良的稳定性，方便准备大量属性相同的类器官。[0078]一种肺组织、肺癌组织体外培养的传代培养方法，属于组织或类器官的传代培养，包括以下步骤：[0079](1)将培养2周左右的类器官，收集培养皿中的类器官。收集类器官的重量为实验计量方便选用，可以根据实验的需要调整放大实验的比例关系。[0080](2)用TrypLE重悬消化类器官，36-38℃消化5-20min；优选3mlTrypLE重悬类器官，37℃消化15min。[0081](3)加入DMEM/F12终止消化；优选加入5mlDMEM/F12终止消化。经过重悬处理，恢复类器官中细胞的分散性，为扩增培植提供原始细胞。[0082](4)离心去除上清液，优选离心过程为2-8℃，100-300g离心3-20min；最好是200g 

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4℃离心5min。[0083](5)加入Martrigel重悬，滴于48孔板孔中。优选的加入适量的Martrigel试剂进行重悬处理。优选地，Martrigel先在冰上熔化，然后加入到步骤4处理好的细胞液中。[0084](6)转移至培养皿中，在36-39℃，3-8％CO2环境下，凝固Martrigel。最好是放置培养皿至37℃(5％CO2)环境中10min，凝固Martrigel。使Martrigel在体温温度完成相转变，形成凝胶样转化。[0085](7)每孔加入150μL条件培养基，在36-39℃，3-8％CO2细胞培养箱培养。条件培养基的成分和制备肺组织/肺癌组织过程中应用的条件培养基成分相同/一致。[0086](8)每间隔2-3天更换一次培养基，培养出人肺组织类器官或者细胞群。[0087]基于已经培养得到的人肺组织/肺癌组织类器官，进行分散处理，重新配置成培养的细胞原料，进行传代培养，得到相应的组织或类器官材料，更好的扩大人体肺组织及肺癌组织的培养，满足不同的科学研究需要。上述传代培养方法能够很好的保持肺组织及肺癌组织的活性，传代培养的类器官相互之间的差异小，一致性好，适合各种医学研究应用需要。

[0088]下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。[00]实施例1

[0090]肺组织及肺癌组织类器官培养

[0091]按照如图1所示的工艺顺序进行3D培养肺组织/肺癌组织类器官。取肺组织及肺癌组织冰上剪碎，加入10ml胶原酶重悬，在gentalMACS C tube胶原酶中运行Human Lung及Human Tumor程序1。转移至37℃、220rpm摇床消化20min。使用gentalMACS运行Human Lung及Human Tumor程序2。转移至37℃、220rpm摇床消化10min，用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。[0092]取5ml红细胞裂解液重悬，冰上裂解红细胞5min。在4℃离心机中，200g离心5min，去除上清液。加入10ml DMEM/F12重悬，4℃、200离心5min，去除上清液。得到的肺组织细胞。

[0093]细胞计数，混合Martrigel，20,000细胞每40μL，滴于48孔板孔正中，放置培养皿至37℃(5％CO2)10min，凝固Martrigel。每孔加入150μL条件培养基，37℃、5％CO2细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基。[0094]取分离后的单细胞在培养第2、6、14天的时候，进行显微镜观察，如图2所示。新鲜肺组织单细胞在Matrixgel中的生长状态良好。

[0095]将制备得到的肺组织及肺癌组织冷冻切片，进行NKX2.1、Ki67及DAPI染色，在显微镜下观察，可见圆形的细胞团，细胞NKX2.1、Ki67染色阳性，表明3D体外培养肺组织及肺癌组织具有肺组织/肺癌组织的一般特点。H&E染色可见其为多细胞组成的中空或实心的有组织极性的多细胞结构。[0096]对比例关于培养基[0097]普通培养基：采用现有的普通培养基(DMEM+10％FBS)3D条件下培养的分散的原代肺组织细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基，结果肺组织细胞

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在培养过程中细胞附着在培养皿底部，与一般细胞培养结果类似，无法形成有结构的、多细胞成分的类器官。

[0098]低FGF10浓度(100ng/ml)条件培养基：采用低FGF10浓度(100ng/ml)条件培养基在3D条件下中培养原代肺组织细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱培养。对比本发明中的全培养基，低浓度FGF10培养条件下肺组织类器官形成较缓慢，q-PCR检测肺组织相关基因表达发现其中神经内分泌相关基因水平低于来源的肺组织细胞，且肺组织类器官传代代数(短暂传代2-3代)。

[0099]无WNT3a条件培养基：采用不添加WNT3a的条件培养基(对照本发明所述的条件培养基进行配制)在3D条件下中培养原代肺组织细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱培养。对比本发明中的全培养基，该培养条件下肺组织类器官形成较缓慢、形成率低，部分细胞分化或死亡，对肺组织类器官传代培养有。[0100]无R-spondin1条件培养基：采用不添加R-spondin 1的条件培养基在3D条件下中培养原代肺组织细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱培养。对比本发明中的全培养基，该培养条件下肺组织类器官较难形成，部分细胞分化贴壁生长或凋亡；即使部分细胞培养获得类器官，但仍无法进行传代实验。

[0101]对比分析了多种不同的培养基的应用情况，实验结果显示现有的普通培养基或者缺少某些关键成分的条件培养基，细胞培养的结果显示条件培养基对于肺组织的体外3D培养具有较为重要的影响，是控制实现类器官的3D培养以及稳定传代的重要影响因素。最好是能够针对性的进行准备，做到精确配制、现配现用。[0102]实施例2

[0103]肺组织及肺癌组织类器官培养[0104]取肺组织及肺癌组织冰上剪碎，加入10ml胶原酶重悬，在gentalMACS C tube胶原酶中运行Human Lung及Human Tumor程序1。转移至37℃、220rpm摇床消化15min。使用gentalMACS运行Human Lung及Human Tumor程序2。转移至37℃、220rpm摇床消化10min，用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，6min)，去除上清。

[0105]取5ml红细胞裂解液重悬，冰上裂解红细胞6min。在4℃离心机中，200g离心5min，去除上清液。加入10ml DMEM/F12重悬，4℃、200离心7min，去除上清液。[0106]细胞计数，混合Martrigel，20,000细胞每40μL，滴于孔板孔正中，放置培养皿至37℃(5％CO2)12min，凝固Martrigel。每孔加入150μL条件培养基，37℃、5％CO2细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基。[0107]其中，条件培养基配方如下：

[0108]

细胞因子B27

N-acetylcysteineEGFNogginR-spondin 1肺正常组织类器官

50X稀释1mM50ng/ml100ng/ml

250ng/ml(或30％条件培养基)

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肺癌组织类器官50X稀释1mM50ng/ml100ng/ml

250ng/ml(或30％条件培养基)

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A83-01200nM200nMFGF10500ng/ml500ng/mlNicotinamide10mM10mMY-27632*10uM10uMWNT3a25ng/ml(或10％条件培养基)25ng/ml(或10％条件培养基)Glutamax100X稀释100X稀释N2100X稀释100X稀释Gastrin1nM1nM[0109]实施例3[0110]类器官传代

[0111]收集实施例2培养皿中的类器官，3mlTrypLE重悬类器官，37℃消化10min。加入5mlDMEM/F12终止消化，200g、4℃离心5min，根据细胞量加入适量Martrigel重悬，滴于48孔板孔正中。放置培养皿至37℃(5％CO2)10min，凝固Martrigel。然后，每孔加入150μL条件培养基，37℃、5％CO2细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基。得到传代的人肺组织及肺癌组织传代类器官。[0112]试验例1

[0113]类器官传代相关实验[0114]1.病理H&E染色：对培养的肺正常组织培养类器官进行H&E染色，如图3所示，肺组织类器官为多细胞组成，空心或实心状，具有良好的活性特征。[0115]2.在显微镜下观察培养的肺癌组织细胞，如图4所示，通过胶原酶解离为单细胞后肺癌组织细胞在Matrixgel中生长状况良好，第10天展示的情况反应培养实验非常成功。[0116]3.收集类器官，滴入事先准备好的OCT包埋剂中，-80℃冰冻后切片(染色常规)，鉴定细胞来源及相关蛋白表达。免疫荧光染色NKX2.1及Ki67阳性，证实组织中的细胞来源于人肺组织，且处于增殖活跃状态如图5所示。[0117]4.q-PCR：常规收取类器官，提取RNA，逆转录后进行q-PCR，检测肺组织相关基因表达情况。如图6所示，结果显示培养的类器官表达人肺组织NKX2.1、SFTPC、HOPX、NCAM、SYN等相关基因。

[0118]实施例4

[0119]小鼠肺癌动物模型构建[0120]如图7所示的流程，将实施例1培养的人肺癌组织类器官原位注射免疫缺陷小鼠左肺组织中，观察小鼠生长状态，于第8周采用Micro CT成像技术观测小鼠肺部肿瘤形成情况。3个月后(根据Micro CT成像观察结果调整，如图9所示)收集小鼠肺，通过免疫荧光及H&E染色等手段检测肿瘤的形成及其来源，如图8、9所示，小鼠肺部形成了人源、原位的肺癌组织。

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说　明　书　附　图

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图1

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图3

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图5

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图7

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图9

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