各种酶切位点的保护碱基
酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 切割率% 酶 Acc I 寡核苷酸序列 链长 2 hr 20 hr GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 Afl CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 0 >90 0 >90 III Asc I 12 8 10 12 >90 >90 >90 >90 50 >90 >90 10 >90 >90 >90 >90 >90 >90 >90 >90 >90 25 >90 >90 GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 BamH I Bgl II BssH II BstE II CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 0 75 0 >90 12 25 >90 0 0 >90 10 GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 0 0 12 9 50 0 GGGT(A/T)ACCC BstX AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA I Cla I CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 0 25 0 50 27 8 8 25 0 0 >90 0 0 >90 50 >90 >90 >90 >90 >90 >90 CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG >90 10 12 50 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 Hind III Kpn I Mlu I Nco I Nde I Nhe I Not I Nsi I Pac I CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 0 0 12 10 0 0 75 GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 0 >90 0 >90 12 >90 >90 GACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 CCCATGGG CATGCCATGGCATG CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 8 14 0 50 0 75 8 10 0 0 0 0 0 0 12 18 0 75 0 >90 20 22 75 >90 8 10 0 10 0 25 12 10 50 12 16 0 10 0 10 20 24 10 25 10 90 28 25 >90 >90 >90 0 25 >90 0 25 50 >90 10 12 22 >90 8 10 12 0 0 0 TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG Pme GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC I AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 10 0 0 0 12 24 75 Pst I 8 14 0 10 0 10 22 24 >90 26 >90 >90 0 >90 0 Pvu CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 0 10 0 25 I Sac I Sac II Sal I Sca I Sma I CGAGCTCG 12 8 0 10 10 10 GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA GAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 0 50 0 >90 28 30 0 10 0 50 32 10 75 8 12 10 75 25 75 0 0 10 10 50 >90 >90 >90 50 50 0 25 50 >90 >90 >90 0 >90 >90 >90 CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 10 12 >90 8 10 10 10 12 14 0 0 8 12 0 0 14 8 10 12 10 >90 >90 >90 Spe I Sph I Stu I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT Xba I Xho I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 8 10 0 >90 12 14 75 75 CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 8 10 0 10 0 25 12 10 75 Xma CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 8 10 0 25 0 75 I
2.双酶切的问题
12 14 50 >90 >90 >90 参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
3.酶切底物DNA，切不开
1）底物DNA上没有相应的酶识别位点，或酶切位点被甲基化。
2）PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。
3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA，同样量，用不同的酶切情况可能不同，由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。
4）公司出售的酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用buffer稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。
不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。
5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中，重新制备DNA，也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增，再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响，通常选用GM33做宿主菌转化。
6）底物不纯，含有酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。
4.DNA经酶切后，电泳无带或出现smear现象
DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。可以用DNA上的其他酶，也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。
5.甲基化酶
M.Alu I, M.Bam H I, M.RcoR I不属于CG甲基化，dam甲基化，也不属于dcm甲基化。
甲基化酶作用后，DNA不能被相应的酶切断。
