你真的了解热图吗

热图（heatmap）是分⼦⽣物学⽂章⾥（尤其是RNA-seq相关论⽂）经常出现的图⽚。但热图⼀般有哪些⽤途，具体涉及哪些不同的参数画法，不⼀定所有的⼈都清楚。本篇短⽂，我们来说⼀说这个问题。1. 关于热图的⽤途

热图的⽤途⼀般有两个。以RNA-seq为例，热图可以：1）直观呈现多样本多个基因的全局表达量变化；2）呈现多样本或多基因表达量的聚类关系。

第⼀个问题很容易理解，毕竟使⽤颜⾊（例如红绿的深浅）来展⽰多个样本多个基因的表达量⾼低，既直观⼜美观。

第⼆个问题，则需要考虑：你是否要做聚类，是对样本聚类还是对基因聚类。

先介绍需要聚类的情况。例如，对于下图，就是利⽤12个基因的表达量（右侧字符为gene ID）对48个包含正常⼈和病⼈的样本（下⽅字符为样本ID）进⾏聚类的结果。我们很容易观察到图中⼈群在系统关系上（图上⽅的树形结构）分为了两类。由此，我们从中了解了两类⼈群的基因表达模式，并对他们进⾏了分类。如果深⼊⼀点讲，这种聚类本质上利⽤了多组值间两两的差异程度（欧式距离、相关系数等），对多组值进⾏层级聚类，以最终得到样本间聚类的远近关系。

图1 两组⼈12个基因表达的聚类图

因此，如果你关⼼样本（或基因）在检测到的表达量⽔平如何分类，相关关系如何，那么你可以选择聚类。在这⾥，你还可以选择：仅在样本⽔平聚类、仅在基因⽔平聚类或两者都选择（如图1）。

但并⾮任何时候，聚类都是最佳的选择。尤其，当你预先设定好的样本排序或基因排序已经很有⽣物学意义，并且想在最终的图⽚中呈现，就应该放弃聚类。例如，你已经按照⼀个代谢通路对基因排好序，只想通过热图展⽰这条通路上基因的表达量如何变化。因为聚类会将原来很有⽣物学意义的基因排列打乱了。那么选择不聚类，维持原来数据的排序就是最好的选择（如图2）

图2 植物⽣长激素代谢通路热图

2. 热图中绘制软件和参数

如果你对R语⾔有所了解，那么R软件包中的ggplots是不错的选择。如果你不懂这些编程语⾔，也有其他简单易⽤的热图绘制软件供选择，例如我们10⽉30⽇的⽂章中介绍的heml1.0。同时热图绘制中主要涉及的⼏个关键参数，我们最后再介绍⼀下：聚类：

也就是上⽂提到的，是否聚类（是按⾏聚类、按列聚类还是两者都选），⼀般软件有这样的选项。例如在R语⾔ggplots 的heatmap.2 命令中的参数Rowv（⾏聚类）和Colv（列聚类）。数据均⼀化：

⼤家如何仔细看热图，⼀定会发现图旁边⼀般会有⼀个图例（如下图）：

图3 热图中的图例

⼤部分热图图例的变化范围极⼩，⼀般是以0为中⼼，变异范围在±3以内。这是由于绘图的数据通常变异范围极⼤。例如RNA的表达量，低丰度的基因的表达量可能在RPKM<10以内。⽽⾼丰度基因则RPKM值可以达到10000+。如果不对数据进⾏均⼀化，很难在同⼀套颜⾊变化幅度范围内展现如此⼤尺度的数值变异。通常，热图软件都可以选择对绘图数值进⾏标准正态分布化（Z score）。也就是将⼀组值通过均⼀化，使其符合均值为0，⽅差为1的标准正态分布。这⾥⼜将涉及到⼀个问题：我们是选择按⾏均⼀化、按列均⼀化还是对所有值均⼀化。󰀀 按⾏均⼀化：将每⼀⾏数值分别单独处理，使其符合标准正态分布；󰀀 按列均⼀化：将每⼀列数值分别单独处理，使其符合标准正态分布；

󰀀 对所有值均⼀化：将所有的⾏列数据⼀起处理，使其符合标准正态分布；

不同处理⽅式，背后的意义也会有所不同。例如，如果在聚类过程中，你想让⾼表达的基因对样本的分类起到更⼤的作⽤，那么选择“对所有值均⼀化”也是较好的选择。但通常在热图绘制过程中，我们⼀般是以基因为单位来观测这些表达量数值的变化的。这意味着，这些基因⽆论表达量⾼低，其地位理论上是平等的（⾄少也是相似的）。即，如果A基因表达量从10变化到20，B基因表达量从100变化到200，我们更关⼼它们变化的倍数（都是2倍）⽽不是变化的绝对值（10 vs 190）。那么，我们应该以基因为单位进⾏归⼀化。例如在图1中，每⼀⾏代表⼀个基因，则我们应该选择按⾏进⾏均⼀化。

按基因均⼀化，可以最⼤程度地呈现每⼀个基因的变化信息，避免⼀个超⾼表达的基因掩盖了其他基因的变化。因此，在热图绘制中，这是常⽤的归⼀化策略。