附 录 A （规范性附录）
枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定
A.1 原理
每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。 A.2 培养基
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。
按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。 A.2.1 枯草芽孢杆菌培养基 A.2.1.1 成分
营养琼脂 33g；蒸馏水 1000mL。 A.2.1.2 制法
将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。 A.2.2 酿酒酵母菌培养基 A.2.2.1 成分
孟加拉红培养基 36.6g；蒸馏水 1000mL。 A.2.2.2 制法
将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。 A.2.3 植物乳杆菌培养基 A.2.3.1 成分
蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氢二钾 2g；柠檬酸三铵 2g；乙酸钠 5g；葡萄糖 20g；吐温-80 1mL；七水硫酸镁 0.58g；四水硫酸锰 0.25g；琼脂粉 20g；灭菌碳酸钙 3g；蒸馏水 1000mL。 A.2.3.2 制法
将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中，最后加入琼脂粉，定容至1000mL；121℃灭菌20min。 A.2.4 麦康凯培养基 A.2.4.1 成分
蛋白胨 17g；脙胨 3g；猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5g；氯化钠 5g；琼脂 17g；蒸馏水 1000mL；%结晶紫水溶液 10mL；%中性红水溶液 5mL。 A.2.4.2 制法
A.将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正。将琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。
B.临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后 倾注平板。
（注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌）
A.3 仪器与设备
A.3.1 超净工作台。 A.3.2 天平：感量：0.01g。 A.3.3 震荡器。
A.3.4 高压灭菌器：≥121℃。 A.3.5 生化培养箱：±1℃。 A.3.6 玻璃培养皿。 A.3.7 移液器：精度为1μL。
A.3.8 显微镜：1000倍。 A.3.9 玻璃或塑料涂布棒。 A.4 样品制备
按GB/T 的规定，采取有代表性的样品200g，按GB/T20195制备试样，装入样品瓶中做好标记后备用。
A.5 测定步骤
A.5.1 样品稀释
准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成10稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10稀释液1mL移入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀即成10稀释液；再换一支无菌吸管吸取10菌液1mL移入装有9mL无菌水试管中，即成10稀释液；以此类推，连续稀释，制成10、10、10、10、10等一系列稀释度菌液，供平板接种用。 A.5.2 涂布
枯草芽孢杆菌用涂布法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液，加至直径为9cm的培养基平皿的琼脂培养基表面，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀涂于琼脂表面。每个稀释梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。
酿酒酵母菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL，加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45℃左右(实验中用手触摸温热即可)，在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。
植物乳杆菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL，加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45℃左右(实验中用手触摸温热即可)，在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。 A.5.3 培养
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枯草芽孢杆菌培养基平皿置培养箱内37℃倒置培养17-22h；酿酒酵母菌培养基平皿冷凝后置培养箱内28℃倒置培养48h；植物乳杆菌培养基平皿冷凝后37℃培养箱倒置培养48h，分别观察菌落形态，鉴别后计数。 A.5.4 菌落特征
A.5.4.1 枯草芽孢杆菌：培养基平皿置培养箱内37℃倒置培养24h后，菌落不规则，粗糙，不透明，不闪光，蔓延，污白色。
A.5.4.2 酿酒酵母菌：培养基平皿置培养箱内28℃倒置培养48h后，菌落散布在培养基内部，特征为中间粉红色边缘半透明的凸起实心菌落，边缘较整齐。
A.5.4.3 粪肠球菌：平板培养48h的菌落形态，表面菌落约3毫米宽，凸起，圆，光滑，细密，白色，偶尔浅黄或深黄色；培养基内部菌落呈乳白色不规则散布，边缘不整齐，稍成半球状凸起的实心菌落。 A.5.5 菌落计数 A.5.5.1 结果计算
枯草芽孢杆菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数×稀释倍数×10。 酿酒酵母菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数×稀释倍数。 粪肠球菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数×稀释倍数。 A.5.5.2 菌落计数办法
只计算枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和粪肠球菌（特征）的菌落。
当只有一个稀释度，其菌落数在30～300之间时，则以该菌落数乘以稀释倍数。
若有两个稀释度，其菌落数均在30～300之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，计算两者的平均数乘以稀释倍数；若大于2则计数其中较小的菌落数乘以稀释倍数。
结果表示：每克样品中的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和粪肠球菌菌数，单位为CFU/g,保留三位有效数字。
A.6 杂菌率
A.6.1 杂菌培养和计数
取10、10、10三个稀释度的样品液1mL于麦康凯培养基上，充分涂布，待液体完全吸收后倒置于37℃培养箱中培养24-48小时，计数，参照A.5.5计算杂菌数。 A.6.2 结果计算
杂菌率（%）=（杂菌数/酿酒酵母菌活菌数）×100
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附 录 B （规范性附录）
嗜酸乳杆菌的计数和杂菌率的测定
B.1 原理
每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。 B.2 培养基和稀释液
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。
按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。 B.2.1 嗜酸乳杆菌培养基 B.2.1.1 成分
蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氢二钾 2g；柠檬酸三铵 2g；乙酸钠 5g；葡萄糖 20g；吐温-80 1mL；七水硫酸镁 0.58g；四水硫酸锰 0.25g；琼脂粉 20g；碳酸钙 3g；蒸馏水 1000mL。 B.2.1.2 制法
将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中，最后加入琼脂粉，定容至1000mL；121℃灭菌20min。
B.3 仪器与设备
B.3.1 超净工作台。 B.3.2 天平：感量：0.01g。 B.3.3 震荡器。
B.3.4 高压灭菌器：≥121℃。 B.3.5 生化培养箱：±1℃。 B.3.6 玻璃培养皿。 B.3.7 移液器：精度为1μL。 B.3.8 显微镜：1000倍。 B.3.9 玻璃或塑料涂布棒。 B.4 样品制备
按GB/T 的规定，采取有代表性的样品200g，按GB/T20195制备试样，装入样品瓶中做好标记后备用。
B.5 测定步骤
B.5.1 样品稀释
准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成10稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10稀释液1mL移入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀即成10稀释液；再换一支无菌吸管吸取10菌液1mL移入装有9mL无菌水试管中，即成10稀释液；以此类推，连续稀释，制成10、10、10、10、10等一系列稀释度菌液，供平板接种用。 B.5.2 涂布
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每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL，加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45℃左右(实验中用手触摸温热即可)，在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。 B.5.3 培养
嗜酸乳杆菌培养基平皿冷凝后37℃培养箱倒置培养48h，分别观察菌落形态后计数。 B.5.4 菌落特征
平板培养48h的菌落形态，表面菌落约3毫米宽，凸起，圆，光滑，细密，白色，偶尔浅黄或深黄色；培养基内部菌落呈乳白色不规则散布，边缘不整齐，稍成半球状凸起的实心菌落。 B.5.5 菌落计数 B.5.5.1 结果计算
嗜酸乳杆菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数×稀释倍数。 B.5.5.2 菌落计数办法
只计算嗜酸乳杆菌（特征）的菌落。
当只有一个稀释度，其菌落数在30～300之间时，则以该菌落数乘以稀释倍数。
若有两个稀释度，其菌落数均在30～300之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，计算两者的平均数乘以稀释倍数；若大于2则计数其中较小的菌落数乘以稀释倍数。
结果表示：每克样品中的嗜酸乳杆菌菌数，单位为CFU/g,保留三位有效数字。 B.6 杂菌率 B.6.1 杂菌计数
目标菌以外的菌均视为杂菌，对嗜酸乳杆菌进行计数的同时对杂菌进行计数。 B.6.2 结果计算
杂菌率(%)＝（杂菌数/嗜酸乳杆菌活菌数）×100
芽孢杆菌检测流程（丁酸梭菌）
1、此检测方法用来计算每克芽孢杆菌粉剂的活芽孢数量。 2、仪器、设备
分析天平（0.0001g）、超净工作台、涡旋振荡器、恒温振荡器、恒温培养箱、三角瓶、玻璃珠、试管、量筒，1000μL移液、100μL移液，涂布棒，培养皿。
3、无菌器材、溶液
无菌蒸馏水、灭菌后的GAM琼脂培养基、已灭过菌的移液管、涂布棒、试管、培养皿等。
4、测定步骤
●样品预处理：准确称取1.0000g固体样品于已灭菌并烘干的玻璃珠三角瓶中，加入100ml蒸馏水，于摇床上20℃以下摇匀30min。 ●样品的稀释：
1) 取6只无菌试管分别加入9ml无菌水，试管上标记样品号和稀释倍数。操作在超净台中进行。
2）吸取1ml已处理好的试样溶液于第一支试管中，于涡旋振荡器上混匀1min左右，再从第一支试管中吸取1ml试样溶液于第二支试管中，依次进行到第6只试管，混匀备用。
●稀释样品的平板培养
准确移取1ml第6只试管试样到已灭菌的空平板中（共6个平板）各个平板均标记菌批
号、日期、稀释度。向已加入试样液的空平板中倾入30ml左右的GAM固体培养基，轻轻旋转使之混匀。混匀完成后，倒置放于厌氧培养罐内，并放入三菱牌厌氧产气袋一袋，拧紧罐口，放在37℃恒温箱中倒置培养24~36h。注：平板使用前应保证无污染。
● 计数
1）培养24~48h后，计平板中的菌落数。 2）小于30或大于300个菌落的平板不计。 3）计算
试样中芽孢杆菌的芽孢数N(单位cfu/g)按式(1)计算
N=C/M*108 ………………………………（1） 式中：C-----几个有效平板的平均菌落数，单位为个 M-----试样的称样量，单位为(g) 108----试样稀释倍数。 注解：
a）所有器皿必须洁净、无菌；不得使用矿质化的玻璃器皿。 b）移样器具用之前需校正。
c）允许差：两次平行测定的相对偏差不大于10%。
