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白鲢蛋白质酶解工艺及其产物对大鼠ACE抑制活性的研究
黄艳春 熊善柏* 赵思明 刘张虎
（华中农业大学食品科技学院，武汉．430070）
摘要 研究了四种蛋白酶水解白鲢鱼肉的工艺条件，并采用离体培养的方法研究其水解产物对大鼠血管紧张素转换酶(antiotensin I-concerting enzyme,ACE)的抑制活性。研究结果表明1398中性蛋白酶、Flavorzyme、Alcalase和Protamex的最适水解温度分别为40℃、55℃、55℃和50℃，最适起始pH分别为7.5、7.0、7.5和6.5。Flavorzyme的水解产物具有较高的ACE抑制活性，其12h的水解产物水解度为28.05％， ACE活性抑制率为.75％。在优化酶解条件下，采用Flavorzyme水解白鲢不同部位的蛋白质，可溶性氮利用率均可达90％，水解度22％-40％，在酶解液浓度相同时(1mg/ml)，白肉酶解产物对ACE的抑制率最高。
关键词 白鲢；蛋白酶；血管紧张素转换酶；降压肽
食物蛋白质酶解产物中的一些短肽具有广泛的生理调节功能，如降血脂、降胆固醇、免疫调节等，其中具有降血压活性的血管紧张素转化酶(Angiotensin-I Converting Enzyme, ACE)抑制肽是目前研究的热点之一[1-3]。
高血压是最常见的一种慢性病，也是对人类健康威胁最大的疾病之一。据有关部门统计，全球高血压患病人数已达6亿，我国高血压患者人数已达1.3亿[4,5]。常规的降血压药(ACE抑制剂)作用时间短，停药后会产生血压反跳，并有损害肾功能和引起低血压、干咳等副作用。在以天然、健康为主题的今天，人们越来越倾向于预防保健和食疗，来源于食品的降血压肽具有巨大的潜在市场[6]。
日本是研究ACE抑制肽最早的国家，我国这方面的研究起步较晚，目前有少量报道是用大豆[7]、麦胚[8]和酪蛋白[9]等制取ACE抑制肽。2003年我国淡水养殖总产量为1900万吨，其中白鲢等低值鱼占60%以上[10]，以白鲢为原料开发生产降血压肽，具有产量大、价格低的优势。本文研究了四种蛋白酶水解白鲢蛋白质的工艺条件，对水解产物的体外降血压活性进行了测定，筛选出可以生产高活性降血压肽的酶，并比较了白鲢不同部位酶解产物对ACE抑制效果。
1 材料与方法
1.1材料 白鲢购于市场，去除内脏，洗净后，去头尾、去皮和脂肪，取肉，冻藏备用。
1.2 试剂1.398中性蛋白酶(1.0×105u/g), 无锡星达生物工程有限公司；Flavorzyme(3×104 u/g)、Alcalase(23.8×104 u/ml）、Protamex(25.7×104 u/g), 诺维信天津公司；SHR大鼠血清(ACE粗提物),军事医学科学院实验动物研究所；ACE底物(HGG), 海军总医院；其他化学试剂为国产分析纯； 1.3 试验方法 1.3.1酶解工艺
白鲢鱼肉→匀浆→酶解→灭酶→过滤→酶解液 1.3.2蛋白酶活力测定：福林酚法[11] 1.3.3 总氮含量：微量凯氏定氮法[12]
1.3.4 氨基态氮测定：中性甲醛滴定法[13] 1.3.5 水解度测定[14]：
DH =（水解液中游离氨基氮/样品总氮量）×100％ 基金课题：湖北省重大科技攻关项目（2001AA201A06）; 武汉市农产品加工技术及产业化重大专项（2002200513205） 黄艳春：女，硕士，教员，籍贯：北京市；主要研究方向为食品蛋白质及其酶解产物的功能评价。 * 通讯作者，xiongsb@mail.hzau.edu.cn
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http://www.paper.edu.cn 1.3.6氮利用率测定[15]： 氮利用率=（蛋白质水解液中的总氮含量/样品总氮量）×100％ 1.3.7 ACE活性测定： 根据Nakamura等[16]的方法改进，具体操作如下： 取50µl HGG与50µl酶解液混匀，37℃水浴中预热10分钟，加入50µl ACE粗提液，37℃反应60分钟后，用200µl 1N HCl终止反应。加入1.5ml乙酸乙酯萃取马尿酸，漩涡混合15s，3200rpm/min 离心10min。取上层的乙酸乙酯1ml转入另一洁净试管中，置于120℃干燥箱干燥15min，加热除去乙酸乙酯。然后用3ml的蒸馏水溶解马尿酸，在228nm处测定其OD值。ACE的抑制程度用％来表示，计算方法为： ACE抑制率＝（B-A）/ (B-C) ×100％ A：在有ACE及ACE抑制物存在的条件下的OD值（实测值） B：无ACE抑制物存在的条件下测得的OD值（对照值） C：无ACE粗提液存在的条件下测得的OD值（空白值） 2 结果与分析 2.1 四种蛋白酶水解工艺参数研究 2.1.1 反应温度对水解效果的影响 按肉水比1:4比例加水打浆，然后分别加入1398中性蛋白酶、Flavorzyme、，Alcalase和Protamex，在不同的温度下水解120min，并测定水解度和氮收率，结果如图1所示。 中性蛋白酶12中性蛋白酶80Flavorzyme11Flavorzyme Alcalase7010AlcalaseProtamex9Protamex 608507 05 304 303540455055606570303540455055606570温度（℃）温度（℃） a. 温度对水解度的影响 b. 温度对氮收率的影响 图1 反应温度对蛋白酶水解效果的影响 氮收率（％）由图1可知，1398中性酶、Flavorzyme、Alcalase、Protamex的最适酶解温度分别为40℃、50℃、55℃、50℃。在最适反应温度下Flavorzyme水解度和氨基态氮生产速率最大，而1398中性酶的氮收率最高。 2.1.2 起始pH值对蛋白酶水解效果的影响 将鱼肉打浆(肉水比1:4)后，用4mol/L的HCl或NaOH调至不同pH值，再分别加入四种蛋白酶，在各自最适温度下水解120min，结果如图2所示。 中性蛋白酶中性蛋白酶10012FlavorzymeFlavorzyme 80Alcalase10AlcalaseProtamex Protamex608 406 204456710 456710起始pH值起始pH a起始pH对水解度的影响 b 起始pH对氮收率的图2 起始pH对蛋白酶水解效果的影响 水解度（％）水解度（%） 2
氮收率（%） http://www.paper.edu.cn 由图2可见，1398中性酶，Flavorzyme，Alcalase，Protamex的最适pH分别为7.5、7.0、7.5、6.5，此时水解度最大。而氮收率在所选的pH范围内呈现平缓上升的趋势，这是因为随着pH的升高，鱼肉中蛋白质溶出量增大的原因。 2.1.3 加酶量对蛋白酶水解效果的影响 在各酶的最适温度和起始pH下，加酶量对水解效果的影响见图3。随酶量的增加，水解度和氮收率都有增高的趋势。对于1398中性酶而言，加酶量为2100u/g.pr时水解度达到最大，再增加酶量并不能使水解度有所提高。而另外三种酶在加酶量达到2400u/g.pr时，水解度增加缓慢，从经济角度考虑，选2400u/g.pr为宜。 1490 1280 7010 1398中性酶601398中性酶8Flavorzyme FlavorzymeAlcalase506AlcalaseProtamex Protamex40407001400210028003500 07001400210028003500加酶量（u/g.pr）加酶量（u/g.pr） a加酶量对水解度的影响 b 加酶量对氮收率的影响 图3 加酶量对蛋白酶水解效果的影响 氮收率％DH% 2.2不同水解时间与水解度及ACE抑制作用之间的关系 在各酶的适宜酶解温度、pH值和加酶量条件下，分别酶解1、2、4、6、8、12、16、24h，水解产物的水解度和ACE抑制率如图4所示。随时间延长，水解度呈上升趋势。四种酶的水解产物都存在一定的抑制活性，只是活性强弱有差别。Flavorzyme 12h的水解产物ACE抑制率高达.75％，水解度为28.05％。其它三种酶虽然在6-8h前有较高的ACE抑制活性，但是水解度比较低。从已发现的ACE抑制肽或类似物可看出，ACE是一类专一性相对较宽的酶，因而经酶解后的水解物中ACE抑制肽类物质并非简单的有或无[5]，因此在选择蛋白酶水解蛋白质制备ACE抑制肽时，蛋白酶的特异性比酶的活性更为重要[17]。 1398中性酶1398中性酶5080 FlavorzymeFlavorzyme7040AlcalaseAlcalase60 ProtamexProtamex3050 402030 201010 00 159131721159131721 时间（h）ACE抑制率%水解度%时间（h）a 时间对水解度的影响 b ACE抑制率趋势曲线 图4 时间对蛋白酶水解效果及ACE抑制率的影响 2.3 Flavorzyme对白鲢不同部位水解效果和ACE抑制活性的影响 根据上述试验结果对Flavorzyme的水解工艺条件进行优化，其最佳工艺组合为：料液比1∶6，起始pH 8.0，加酶量5000u/g.Pr，在50℃水解12h。以此工艺对白鲢不同部位的蛋白质进行水解，结果如图5所示。 3
http://www.paper.edu.cn 100鱼皮百分比％806040200红白混合肉背部白肉两侧白肉红肉DH%氮利用率％腹部红肉两侧白肉背部白肉红白混合肉腹部鱼皮01020304050ACE抑制率%a Flavorzyme对白鲢不同部位水解效果的影响 b 不同部位酶解液（1mg/ml）的ACE抑制率 图5 Flavorzyme对白鲢不同部位水解效果和ACE抑制活性的影响 由图5可以看出，在优化酶解条件下，Flavorzyme对鲢鱼不同部位蛋白质的水解效果都较好，可溶性蛋白利用率在90％左右，水解度在22％至40％之间。在酶解液浓度相同条件下，背部白肉和两侧白肉的抑制活性最高，鱼皮和红肉次之，腹部活性最低。 3. 结 论 采用单因素实验方法，，确定了1398中性酶，Flavorzyme、Alcalase和Protamex对白鲢鱼肉进行酶解的工艺参数，其最适温度分别为40℃、50℃、55℃、50℃，最适起始pH分别为7.5、7.0、7.5、6.5，Flavorzyme、Alcalase和Protamex最适加酶量为2400 u/g.pr、1398中性酶为2100u/g.pr。离体培养试验结果表明，Flavorzyme 12小时的水解产物对ACE的抑制率达到了.75%，此时其水解度为28.05%；在优化条件下，采用Flavorzyme水解白鲢不同部位的蛋白质，其可溶性蛋白利用率在90％左右，水解度在22％至40％之间，在酶解液浓度相同条件下，白肉对ACE的抑制活性最高。 参考文献 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 辛志宏, 马海乐，吴守一．食品蛋白质中血管紧张素转化酶抑制肽的研究[J]．江苏大学学报(自科版)，2003, 24（4）：17-21 曹文红, 章超桦．食品蛋白质降血压肽及其酶法制备(一)[J]．食品科技，2002，4：9-10 Naoyuki, Yamamoto. Antihypertensive Peptides Derived from Food Proteins [J]. J Biopolymers, 1997, 43:119-128 http://www.windrug.com/pic/55/17/228.htm http://www.fx120.net/JBZT/NK-1/XNK-1/GAXY/ZHILIAO/20030830125815.htm 安茂竹，孙静，高景芳等．血管紧张素转换酶抑制剂的不良反应及防治[J] ．中国新药杂志1999，8(5)： 403-404 吴建平．丁霄霖．大豆降压肽的研制(I)——生产高活性ACEI肽酶系的筛选[J]．中国油脂，1998，23(2)：49-51 [辛志宏，马海乐，吴守一等．从小麦胚芽蛋白中分离和鉴定血管紧张素转化酶抑制肽的研究．食品科学，2003，24（7）：130-133 吕桂善，姜瞻梅，周文红等．酪蛋白水解进程的研究．食品工业科技，2003，8：24-27 10. http://cn.biz.yahoo.com/040512/10/2un5_1.html 11. 高雯，姜培荣，张之佳等．食品酶学原理与分析方法．黑龙江科学技术出版社．1991 12. 大连轻工业学院．食品分析．中国轻工业出版社．1994 13. 蔡武城，袁厚积．生物物质常用化学分析方法．科学出版社．1982 14. 赵淮新，冯志彪．蛋白质水解物水解度的测定．食品科学，1994，11：65-67 4
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Study on Enzymic Hydrolysis of Silver Carp Meat and Angiotensin
I-Converting Enzyme Inhibitory Activity
Huang yanchun, Xiong shanbai, Zhao siming, Liu zhanghu
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)
Abstract
The enzymatic hydrolytic parameters of silver carp meat and the effect of enzymes on the activity of Angiotensin I-Converting Enzyme(ACE) in the spontaneously hypertensive rats(SHR) serum were investigated. The optimum conditions for As.1398 neutrase, Flavorzyme, Alcalase and Protamex was temperature 40℃, 55℃, 55℃ and 50℃, pH7.5, 7.0, 7.5 and 6.5, respectively. In vitro experimental results indicated that the hydrolysates of 12h, with higher degree of hydrolysis(DH=28.05%), obtained from Flavorzyme had higher ACE inhibitory activity(.75%). Different parts of silver carp were hydrolyzed with Flavorzyme in the optimum conditions. They all showed good hydrolytic effect, DH(22%-40%) and the recovery ratio of nitrogen about 90%. The hydrolysate of white muscle had higher ACE inhibitory activity than other parts with the same concentration(1mg/ml).
Key words fish protein ; hydrolysis; SHR serum; ACE; antihypertensive peptides
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