２０１０年３８卷第ｌ０期 广州化工 ・１６７・ 液相色谱质谱法测定虾中１ ６种磺胺类药物残留 ，王瑞龙 ，朱品玲 ，方成俊 ，陈俊玉 （１福建东山出入境检验检疫局，福建 漳州 ３６３４０１；２福建漳州出入境检验检疫局，福建漳州 ３６３０００； ３福建宁德出入境检验检疫局，福建宁德３５５０１７） 摘 要：建立了虾中１６种磺胺类药物残留的高效液相色谱一串联质谱（ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ）测定方法。试样用乙腈和无水硫酸钠提 取两次，合并提取液，旋转蒸干后，用甲醇水溶解残余物，经正己烷脱脂后，采用ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ选择反应监测（ＳＲＭ）正离子模式测定， 同时对虾中１６种磺胺类药物残留进行定性分析和定量分析。 关键词：高效液相色谱一串联质谱法；磺胺；多残留；虾 Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １６ Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｓｈｒｉｍｐｓ ｂｙ ＬＣ——ＭＳ／ＭＳ ＣＨＥＮ Ｊｕｎ ，ＷＡＮＧ Ｒｕｉ—ｌｏｎｇ ，ＺＨＵ Ｐｉｎ—ｌｉｎｇ。，ＦＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ一 ｎ ，ＣＨＥＮ Ｊｕｎ—ｙｕ （１ Ｄｏｎｇｓｈａｎ Ｅｎｔｒｙ＆Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｆｕｊｉａｎｇ Ｄｏｎｇｓｈａｎ ３６３４０１； ２ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ Ｅｎｔｙｒ＆Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｆｕｊｉａｎｇ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ３６３０００； ３ Ｎｉｎｇｄｅ Ｅｎｔｙｒ＆Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｆｕｊｉａｎｇ Ｎｉｎｇｄｅ ３５５０１７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ １ ６ ｓｕｆｆｏｎａｍｉｄｅｓ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｅｅｌｓ ａｎｄ ｓｈｒｉｍｐｓ ｗａｓ ｄｅｖｅｌ— ｏｐｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙｒ（ＨＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ）．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃ－ ｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ａｎｄ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ．Ｔｈｅ ｓｕｐｅｍａｔａｎｔ ｗａｓ ｄｒｉｅｄ ｂｙ ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｅｒ．Ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｗａｓ ｄｉｓ－ ｓｏｌｖｅｄ ｗｉｔｈ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｃｌｅａｎｅｄ—ｕｐ ｂｙ ｈｅｘａｎｅ．Ｔｈｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ｗａｓ ｏｐｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １ ６ ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈ ｐｅｆｆｏｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙｒ（ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ）；ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ； ｍｕｈｉｒｅｓｉｄｕｅ；ｓｈｒｉｍｐｓ 磺胺类药物（ＳＡｓ）是对具有氨基苯磺酰胺结构的一类药物 的总称，具有芳氨基和磺酰胺基，是常用的广谱抗菌素，在水产 １ 实验部分 养殖中应用非常广泛。但是，磺胺类药物能够产生排尿和造血 紊乱等副作用…。这些药物在虾养殖中的广泛和大量地使用必 １．１仪器与试剂 然会导致其残留污染的加重，严重危害人类的健康。因此我国 Ａｇｉｌｅｎｔ ６４１０Ｂ液相色谱三重串联四级杆质谱仪，配有电喷 农业部、日本、国际食品法典委员会、欧盟和欧美等大多数国家 雾离子（ＥＳＩ）源。分散机，离心机，氮吹仪，旋涡振荡器。 规定食品和饲料中磺胺类药物的最大残留限量标准 。Ｊ，这些 磺胺类药物标准品的纯度均不低于９９．０％，均购于Ｄｒ．Ｅｈ— 规定中以日本“肯定列表”最为详尽和严格，日本规定磺胺甲基 ｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ ＧｍｂＨ；乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵均为色谱纯（Ｍｅｒｃｋ公 嘧啶为０．０２ｍｇ／ｋｇ，磺胺二甲嘧啶为０．０１ｍｇ／ｋｇ，磺胺二甲氧嘧 司）；实验用水均为超纯水（电阻率达到１８．２Ｍ１２．ｅｍ）；硫酸钠为 啶为０．０４ｍｇ／ｋｇ，磺胺二甲基嘧啶为０．Ｏ１ｍｇ／ｋｇ，其它的按一律 分析纯；０．１％甲酸溶液（含２．５ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸铵）。 标准为０．０１ｍｇ／ｋｇ。 标准储备液及工作液的配制：分别称取标准品各１０．０ ｍｇ， 磺胺类药物残留在动物组织中的检测方法主要有酶联免疫 用甲醇溶解后转移至１００ｍＬ棕色容量瓶中，用甲醇定容，于 法 、高效液相色谱法 Ｊ、液相色谱质谱法 ］，为提高检测 一２０￣Ｃ条件下保存。使用时将上述标准储备溶液混合，用甲醇 效率，多残留检测已成为发展的必然趋势。由于仪器灵敏度以 稀释成不同浓度的标准工作液。 及选择性上的优势，ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ以及ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ逐渐成为 １．２分析条件 多残留检测的重要手段。本研究建立了同时检测虾中１６种磺 １．２．１色谱条件 胺类残留的ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ检测方法。 色谱柱为ＣＩ８（Ｋｅｎｅｔｅｘ Ｃ１８，２．１×ｌＯＯｍｍ，２．６ ｍ）；进样体 积为ＩＯＩｘＬ；柱温为３０℃；流动相：Ａ为０．１％甲酸水溶液（含 ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸铵），Ｂ为乙腈，流速为０．２ｍｌＪｍｉｎ；梯度条件见表１。 作者简介：，男，福建东山出入境检验检疫局，助理工程师，通讯联系人。Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｊｕｎ２３２２２７５１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｔｏｍ ・１６８・ 广州化工 ２０１０年３８卷第ｌ０期 表１ 分离ｌ６种磺胺类药物的梯度洗脱程序 Ｔａｂｌｅ １ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ １６ ＳＡ ｒｅｓｉｄｕｅｓ。ＴＭＰ ａｎｄ ＰＹＲ 乙腈提取。合并乙腈提取液，加入ｌＯｍＬ异丙醇４５￣Ｃ旋转蒸干。 准确加入２．ＯｍＬ甲醇水（体积比为２０：８０，水为０．１％甲酸水） 涡旋振荡溶解残留物，再加入２．ＯｍＬ正己烷涡旋混合１ｍｉｎ，转移 于５ｍＬ具塞离心管中，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取下层液体过 ０．２２ｍ滤膜，滤液用于ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ测定。 ２结果与讨论 ２．１ 结果 ２．１．１线性关系 测定各药物质量浓度均为２５，５０，１００，２００，５００１ｘｇ／Ｌ的混合 标准溶液，得到的线性回归方程。各药物均在２５—５００ｐ，ｇ／Ｌ进 样质量范围内与其峰面积呈线性关系，相关系数均大于０．９９。 ２．ｔ．２检测限和定量限 在５ ｇ／， 添加水平时，各药物峰的信噪比均大于３，故将其 定为检出限。在１０１ｘｇ／ｋｇ添加水平时，各药物峰的信噪比均大 于１０，且回收率、相对标准偏差（ＲＳＤ）满足条件，故将其定为定 量限。 ｛ｉ ｉ１．２．２质谱条件 大气压电喷雾离子源（ＥＳＩ），正离子模式；毛细管电压为 ４０００Ｖ，雾化器压力为３８ｐｓｉ，氮气温度为３５０￣Ｃ，流速为９Ｌ／ｍｉｎ； 采用多反应监测（ＭＲＭ）模式，各种药物的采集参数见表２。 一 一 ～ 一 一 睨一 一 一 一 一 ～１．３样品前处理 准确称取５．０ｇ均质样品置于５０ｍＬ具塞离心管中，１０ｇ无水 硫酸钠，再加入２０ｍＬ乙腈，均质１ｍｉｎ，于涡旋混合器上提取 ２．１．３回收率和精密度 分别称取２份阴性虾试样，添加混合标准溶液，使加标水平 ｍ ｍ 加 加 吣 ∞ 加 加 吣 鹏 加分别达到５，ｌＯ￣Ｌｇ／ｋｇ，充分混匀，按照本文建立的方法进行测定， 每个添加水平作６份平行测定。结果见表２。 １ｒａｉｎ，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，收集上清液。残渣再加入２０ｍＬ 加 ｎ 表２测定１６种磺胺类药物的质谱条件和回收率 Ｔａｂｌｅ ２ ＥＳＩ—ＭＳ／ＭＳ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ １６ ＳＡ ｄｒｕｇｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｎ一 ｍｉｎ Ｆ唧ｅｎｔｏ∥Ｖ ＣＥ／Ｖ Ａ 。 （ ｋｇ） ｗ／％ ｅｃｏｖｅ ＲＥｅｌｓ，ＲＳＤ／％ Ｅｄｓ ，ｍｐ Ｏ Ｏ ０ Ｏ Ｏ ∞ Ｏ ｍ Ｏ ∞ Ｏｍ ｍｐ Ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ ２．７ ９３．１ ８５．３ 磺胺嘧啶 Ｓｕｌｆａｐｙｒｉｄｉｎｅ ３．４ ９７．２ ９４．１ 磺胺吡啶 Ｓｕｌｆａｔｈｉａｚｏｌｅ ３．３ ８７．３ ８５．８ 磺胺噻唑 Ｓｕｌｆａｍｅｒａｚｉｎｅ ４．Ｏ ８ ６ １ ９７．９ Ｌ Ｌ ９２．３ ８ ４ ７ ６ ７ ３ ４ 磺胺甲基嘧啶 ｓｕｌｆａｍｏｘｏｌｅ ５．４ ８９４．６ ９３．Ｏ 磺胺恶唑 Ｓｕｌｆａｄｉｍｉｄｉｎｅ ５．８ ８９．０ ８９．５ 磺胺二甲基嘧啶 Ｓｕｌｆａｍｅｔｅｒ ６．２ ９５．８ ９０．５ 磺胺对甲氧嘧啶 Ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｄａｚｉｎｅ ７．１ ８６．７ ８１．０ 磺胺甲氧哒嗪 Ｓｕｌｆａｒｎｅｔｈｉｚｏｌｅ ６．６ ８９．４ ８３．８ 磺胺甲二唑 ７．６ ８２．５ ８３．７ 磺胺间甲氧嘧啶 ２０１０年３８卷第１０期 广州化工 ・１６９・ ２．２讨论 ２．２．１色谱柱的选择 文献 报道用于ＳＡｓ分析的色谱柱多采用反相色谱柱， 如Ｃ８、Ｃ１８柱。实验分别对Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８，ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ—Ｃ１８ 和Ｋｅｎｅｔｅｘ Ｃ１８色谱柱进行比较，结果发现：在Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８， ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ—Ｃ１８上一些ＳＡｓ没能得到很好的分离；而采用 Ｋｅｎｅｔｅｘ Ｃ１８时各种ＳＡｓ均获得良好的分离效果且比较稳定，并 且在普通液相上实现了很好的分离效果。 ２．２．２流动相的选择 ３ 结论 本文建立了虾中１６种磺胺类药物残留的ＨＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ测 定方法。方法准确度和精密度高，且方法的定量限达到５ ｋｇ， 能够满足美国、日本、欧盟等国家的出口限量要求，并且已经用 于水产品中磺胺类药物残留的确证检验。所建立的多残留检测 方法大大地提高了检测的稳定性和可靠性，对水产品的安全卫 生工作意义重大。 参考文献 ［１］ 张海琪，宋刑刑，等．液相色谱一串联质谱法同时测定大黄鱼中２０ 种磺胺类药物残留［Ｊ］．分析化学研究简报，２００７，３５（２）：２６８． ［２］Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）ＮＯ ５０８／１９９９ ｏｆ４／３／１９９９，ａ ｍｅｎｄｉｎｇ ａｎ— ｎｅｘｅｓ Ｉ ｔｏ ＩＶ ｔｏ ｃｏｕｎｃｉｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＥＣ）ＮＯ ２３７７／９０ ｌａｙｉｎｇ ｄｏｗｎ ａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｓｉｄｕｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ 流动相的ｐＨ值对ＳＡｓ的分离和保留具有显著的影响。虽 然质谱分析并不要求在色谱柱上完全分离，但所要分析的ＳＡｓ 药物中存在３组母离子和子离子均相同的化合物（磺胺邻二甲 氧嘧啶和磺胺问二甲氧嘧啶，磺胺氯哒嗪和磺胺氯吡嗪，磺胺问 甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺邻甲氧嘧啶），对于这类化合物 的质谱分析则要求必须在色谱柱上分离，否则会互相干扰测定。 采用０．１％甲酸来控制流动相的ｐＨ值，同时在流动相的水相中 加入醋酸铵，可以在保持较好分离度的前提下获得理想的色谱 峰、减／Ｊ，￣ｎ合峰、增大分子离子峰的峰强度。本文采用乙腈、 ０．１％甲酸溶液（含２．５ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸铵）为流动相，采用合适的梯 度淋洗条件，很好地实现了ＳＡｓ的分离，并且各峰峰形尖锐，峰 对称性好。 ２．２．３质谱条件的优化 ｖｅｔｅｒｉｌｌａｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｆｏｏｄ ｓｔｕｆｆｓ ｏｆ ａｎｉｍａｌ［Ｊ］．Ｊ Ｅｕｒ Ｃｏｍｕ— ｍｕｎ，１９９９，６０（２）：１６—１７． ［３］ Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａ ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ．Ｒｅｓｉｄｕｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｎ ｆｏｏｄ．Ｆｏｏｄ ｖｏｌ— ｕｍｅ：Ｊａｐａｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｌｉｓｔ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉｎａ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｅｓｓ． ［４］ 张鸿雁，崔小军，等．动物源性食品中磺胺类药物的多残留酶联免 疫测定方法研究进展［Ｊ］．食品研究与开发，２００８，２９（９）：１８１． ［５］徐维海，林黎明，等．水产品中１４种磺胺类药物残留的ＨＰＬＣ法同 时测定［Ｊ］．分析测试学报，２００４，２３（５）：１２２． ［６］ 李存，江海洋，等．高效液相色谱一荧光一紫外法测定动物肌肉组 织中多类药物残留［Ｊ］．分析化学（ＦＥＮＸＩ ＨＵＡＸＵＥ）研究报告， ２００９，３７（８）：１１０２． 根据磺胺类化合物具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质， 选用ＥＳＩ＋作为离子化模式，采用仪器自带优化软件ｏｐｉｔｉｍｅｒ进 行质谱条件的优化，实验结果表明，磺胺在离子源ＥＳＩ＋电离方 式下，可获得较高丰度的［Ｍ＋Ｈ］ 母离子。另外，分析目标物 中存在三组母离子和子离子均相同的化合物，在数据分析时，软 件自动处理会出现三组分析物的识别错误，必须手动加以修改， ［７］ 董丹，邵兵，等．液相色谱一电喷雾串联四极杆质谱法测定鸡肉中 １７种磺胺类药物的残留［Ｊ］．色谱，２００５，２３（４）：４０４． ［８］ 庞国芳，曹彦忠等．液相色谱一串联质谱同时测定家禽组织中ｌ６ 种磺胺残留［Ｊ］．分析化学（ＦＥＮＸＩ ＨＵＡＸＵＥ）研究报告，２００５，３３ （９）：１２５２． 这给数据分析带来极大的不方便，可以采用分时间段扫描的方 法，在提高灵敏度的同时，增加数据处理的方便性，但是磺胺间 甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪的保留时间软件仍无法区别，必须手动 输入。
