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中国卫生检验杂志砌年２月第ｌ２卷第１期ａ Ｔ ｅ】舢 ｍｌ ＨＰ，￣ｎＬｔｔｈ￣ｌｕｔｏｒｅ Ｔ ｍｌ哪∞吨Ｆ由啪 ．１２ Ｎ０ （ 【测定方法】 ０ ［支章编号］１００４－８￣５（２Ｏ０２）０１－－００６７－－０３ 蔬果中农药残留毒性的快速检测 骆和东 ，曾海珂 ，朱宝平‘，李永杰 （１厦门市卫生防疫站．福建３６］００４；２厦门蔬菜公司，福建３６１∞１） 一 小 ｍ ［中图分类号）Ｒ１５５ ５－４ ［文献标识码］Ａ 蔬菜、瓜果是人们每天生活的必需品。随着人民生活水 平的提高，健康意识的增强，蔬果中农药残留问题日益引起人 们的重视 特别是近几年来，由于农药的不古理使用，导致农 药残留过量、过滥，使得农药引起的食物中毒逐渐增多 目前 已成为我国主要的中毒原因之一１ ］。因此，加强对农药使用 管理，禁止农药残留超标的蔬菜、瓜果进＾市场已成为当务之 急，而关键之一就是要建立一套简便、快速、直观、高灵敏度的 农残检测方法。 在蔬菜农残的检测上．早期曾采用生物检定法Ｌ２、单项的 比色法、同位素法、酶化学法 目前应用较广泛的有薄层层析 法和仪器分析法（如Ｃａ２和ＧＣ—ＭＳ）等 Ｊ 但这些方法有的由 于准确性低或分析时间长或仪器成本昂贵而无法应用于蔬菜 中农残的快速检测 本文采用从我国引进的蔬菜农药残 留毒性快速检验仪 通过直接测定残留农药对乙酰胆碱酯酶 的抑制率高低而显示农药残留毒性水平，具有简便、快速、准 确、经济的特点，适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类等农残 的快速检测，是目前一种较为有效的筛检方法。 １实验原理 有机磷农药和氨基甲酸酯类杀虫剂都是抑制胆碱酯酶的 神经毒，毒理作用基本相同，主要通过抑制体内的胆碱酯酶活 性，阻碍其分解己酰胆碱的功能而引起神经生理的紊乱ｌ４一，其 原理是： 乙酰胆碱（ 的作用下进行分解 一 Ｆ ．． ．“ 当有机磷或氨基甲酸酯农药存在时 ＡＣｈＥ活性被抑制． 不能水解ＡＣｈ，使ＡＣｈ过度积聚，引起胆碱能活动神经紊乱而 出现中毒 一。为了测定ＡＣｈＥ活性被农药抑制程度 我们加＾ 碘化硫代己酰胆碱（ＡＴＣＩ）作为受质，使之在ＡＣｈＥ催化下分解 成碘化硫代胆碱，再与显色剂二硫代双硝基苯甲酸（ＩＹＹＮＢ）反 应，生成５一琉基一２一硝基苯甲酸，其反应如下： ｏ． ＣＨｌ ＣＩＩ ｍ１ ＩＳ＿ｃＨ Ｈ ＩｌＣＩ－ｃ４３ ～篙一 一《ｌ Ｈ＋ ｃ∞Ｈ 哦化碱代乙酰幔碱（ＡＴＣＩ） 化磕化咀ｌ碱 醴 ｃＨｌ— ｌ—ｃＨ】ＣＲ ＳＨ ｏ】Ｎ 碘化碥 ￣１１ｔ—Ｎｌ—ＣＨ—ＣＨ Ｓ ｓ＠一 吼一０２Ｎ— 》ＳＨ ５一艟錾０－酌 革甲胜（越也 反应后生成的５一巯基一２一硝基苯甲酸呈黄色，我们在 ４１２ｎｍ渡长下测定溶液吸光度随时间变化的曲线，计算出酶抑 制率的大小 当样品中不古抑制乙酰胆碱酯酶的物质时，暧 光值随着时间增加而增加。当样品中含有有机磷或氨基甲酸 酯类等农药时，ＡＣｈＥ活性因受抑制而使暧光值变化溅缓（见 图１）。因此以对照组为基准 由降低的速率计算出ＡＣｈＥ受抑 制程度，其计算机公式为： 牢（ ）＝盟丛塑 嚣 爷 专 誊昔嚣 壁童鱼鱼￣１００ ０ ８Ｏ 留 ０ ＯＯ ０ ６０ ０，ｓｃｔ： 图ｌ酶催化显色反应哑光度Ａ随时间ｔ变化曲线 在农药残留快速检验仪上能直接读出酶抑制率大小，从 而评估样品中农药残留毒性程度 当抑制率≤３５％时 说明试 样中的农药残留毒性小，可以食用。当抑制率≥３５％时，为阳 性反应，应复检并用气相色谱仪等分析仪器确证。 ２材料与方法 ２ １仪器和试荆 ２ １．１ ＵＶＩ￣Ｉ蔬菜枉药残留快速检验仪（兴农盎司） ２ １．２不锈铜取样器，内径曲２５ ４ｍｍ（１英寸） ２ １ ３甲醇（ＡＲ）；１％溴水 ２ １．４ ０ １ｏｔｏｌ／Ｌ磷酸钠盐墟冲液．ｐＨ８ ０ ２ １ ５ 己酰胆碱酯酶（ＡｃｈＦ），３ｍｇ／ｎｄ ２ １ ６碘化硫代乙酰胆碱（Ａ１ｕ） ２１ ６７ｎｔｇ／ｎｄ ２ １ ７ ５，５’一二硫代一２，２’，一二硝基苯甲酸（Ｄ１ＮＢ）， ３ ９８ｒｒＩ ｍＩ ２ ２测定方法 ２ ２ ｌ苹取用内径２５ ４．ｒｉｍａ的取样器切取蔬菜样品４片共 计１８ ，切碎后置于玻璃试管中，加＾２ｍｌ甲醇及１００＝１１％溴 水．振荡３ｍｉｎ后，静置２ｍｉｎ，待测。 ２ ２ ２显色反应在比色管中加＾３ｒｉｄ ０ １ｍｏｌ／Ｌ磷酸钠盐缓 冲液，２０￣ｔａＣｈＺ溶液，以及２０ｄ样品葶取液，混匀后静置２ ５ｒｒ￣．ｎ，再加＾１００ｖｌｍ＇￣Ｂ和２０￣Ｒａ，将此色管置残毒测定仪 比色，读取溶液嗳光度随时间变化值，计算出抑制率大小 ２ ２ ３结果判定酶抑制率≤３５％时，可判定该批试样台格， 若酶抑制率＞３５％ 表示为阳性反应，经复检确认后，判定诚批 试样不台格，应停止其上市交易 维普资讯 http://www.cqvip.com
６８ 中同卫生检验杂志２呻２年２川 【２卷 【期口…Ｊｏｕｍａｌ Ｈ ３结果与讨论 ３ ３反应温度、反应时问对酶抑制率的影响 温度对酶的活 ，针幕量 性和稳定性影响很大，不同的反应温度，酶抑制率也不同 因 此实验必须在恒温条件下进行．使空白和样品的反应温度保 帆 椰 ３．１ 萃取瘩荆的选择蔬菜中农残的提取常用的有机溶剂主 要有甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、己晴等ｌ４。我们 比较了这儿种有机溶剂对ＡＣ］ｒＥ抑制率的影喃（见表１），结果 发现甲醇的影响晶小，并且随着甲醇加＾嚣的增大，对Ａｔ．￣Ｅ 持一致．才能避免由于温度变化而带来的实验误差 不同的酶抑制时间也会影响酶的抑制率一般瞄着酶抑 制时间的延长．抑制率也随之提高，图３显示了Ｏ．３２ｍ ＬＤＤＶ 抑制率变化不太，所以选择甲醇为萃取溶剂，反应请为２Ｏｒａｌ 表１ 不同萃取溶剂及其加入量对酶抑制中率的影响 埘酶的抑制率随反应时间变化的曲线。所以实验操作中必须 准确控制酶抑制时间，使空白和样品的反应时间保持一致 、 ３ ４溴水的影响 硫代磷酸盐类农药经溴水氧化后，对酶的 抑制能力更强 。从表２可 看出，几种常用的含硫有机磷农 药用湟水处理后酶抑制率有显著提高 其机理主要是漠水能 将样品中的Ｐ—ｓ键氧化戒Ｐ—Ｏ键，从而提高检测灵敏度 ３．２ ｐＨ值选择酶促反应和显色反应受ＤＨ的影响很大．选 利用此原理，我们在样品处理中加＾ａ００ｐ １％漠水溶液进行 氧化处理。即提高ＡＣｈＥ检测有机磷的灵敏度，叉增加检测农 药的种类 择体系所适宜的ＤＨ值是非常重要的。我们比较了不同的 值对酶促掘色反应的影响（见图２）以及不同缓冲体系对酶抑 制率的影响，选择＿丰反应体系在ｐＨ８ ０左右磷酸钠盐缓冲液 中进行 Ｉ】－５ ｆ】．４ Ｉ】．３ 表２含硫有机磷农药用溴水处理前后酶抑制率变化的比较 亿２ ０－ｌ ０ ４ ６ Ｉ２ ３ ５ Ａ（ 对反应的影响 不同来源、不同方法制成的ＡＣｈＥ 酶制剂都会影响反应的灵敏度 我们比较了几种不同的酶制 剂的实验效果 以农业试验所提供的ＡＣｈＥ灵敏度较高 泼酶是从饲养的家蝇头部中萃取制成的，这与文献 所报道 的家蝇提取的酶适宜于酶抑制法测定农残是一致的 它是一 坤粉末制剂，实验时只需加＾适量的蒸馏水溶解即可使用．方 便又适于保存。 ３ ６不同检刹方法结果之间的对比采用浚方法对我市蔬菜 ＤＨ 图２ ｐＨ值对酶催化显色反应的影响 批发市场的蔬菜进行抽样检测，并用农药速测卡（纸片法）、薄 层层折法、气相色谱法进行验证比较．结果较为准确可靠（见 表３） 由于农药速测卡（纸片法）容易受温度、色泽、有机溶剂 等的影响而使结果呈假阳性，重复性差。而酶抑制法是根据 酶促显色反应结果读取吸光值随时间变化曲线．减少¨ｒ人为 误差，结果更为可靠 ３ ７精密度实验图３ ＤＤＶ的酶抑韦Ｉ反应时问曲线 分别取同一农药（农地乐）和蔬菜样品（芹 菜）在同样的条件下连续测定６—１０次，其相别标准偏差分别 为１．５４％和１３．ｏ５％（见表４） 测定结果精密度高，重复性好 表３蔬菜中农药残毒测定结果殛比较 维普资讯 http://www.cqvip.com
中国卫生控验杂志∞０２年２月第【２卷第１期 ｌｏ，ａｍｔｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｌ ：Ｉ 表４方法重复性实验结果 ３ ８适用范围和灵敏度 陵检测系统主要适用于有机磷及氨 基甲酸酯类农药，也适用于检澳Ｉ有机硫磺类杀菌ｉｆ【ｊ。由于各 敏度较高。敌敌畏、呋哺丹的榆出限可达到０ ００２，，，ｇ／ｍｌ（以抑 制率３５％计），但对甲胺磷的灵敏度较低．１０，，，ｇ／ｍｌ甲胺磷取样 ２０ｔ￣１抑制２ ５ｎ－ａｎ酶抑制率仅为１４ ６８％ 甲胺磷是高毒农药， 不能用于蔬菜上 ．但由于杀虫效果好、成本低而为不少菜农 所使用。所以在测定甲胺磷等灵敏度较低的农残时．可通过 增大取样量和延长抑制时间来测定 类有机磷及氨基甲酸酯类农药对ＡＣｈＥ的抑制能力不同．其检 出的灵敏度也各不相同。我们比较了几种常用农药在不同浓 度下的酶抑制率（见表５），结果发现浚检测系统对敌敌畏、畦 哺丹、辛硫磷、甲基对硫磷（溴化）、毒死蜱、西维因等农药的灵 表５农药浓度与抑制率的关系 注：抑制时间均为２ ５ｍｉａ ３ ９监测结果从１９９８年开始，我们采用该方法对我市蔬菜 大量的样品（平均每个样品分析时间仅３—５ｒａｉｎ），快速、经济， 批发市场的农残进行抽样监测， 速初筛检验，取得了良好的 成本低，准确率较高，特别通用于我国目前在蔬菜生产上相对 分散、品种多样的特点 因此以酶抑制法快速初筛检测．用ＣＣ 法确证分析，可达到良好的监控效果 监控教果。表６显示近两年所监测我市蔬菜农残的抑制率分 布情况 ２ＯＯＯ年抽检６５３６份，台格率８７．３５％，今年ｌ一７月份 抽检６９００份．台格率９５．７５％。 参考文献 表６ ２０００～２００１年蔬菜农残检测抑制率分布表 ［Ｉ’上晶琳农药中毒居首误食河麒仍有［Ｊ］．健康报，２Ｏ０Ｏ，２—３（３） Ｉ２ 浆顺香．任祖洼，邱孝煊等蔬菜农药残留的预防措施及其启 示［Ｊ］福建农业科技，１９９９，４：２．５—２６． ［３：黄伟坤等编著食品检验与分析［Ｍ］北京：中国轻工业 版杜， １９９７：２９９ ［４ Ｉ卟世 主编，化学性食物中毒 ｌ橙验Ｍ 北京：北 大学¨｝版 牡 ｆ５ Ｅ涨富毒物快速系列分析手册［Ｍ］台肥：安徽科学技术出咂 注：酶抑制率≤１Ｏ％力食用安伞，１Ｉ％一３４％为残留一定１ 性但们 ｉ 食用，≥３５％为不合格 社．［９８６：３５—３６ ６］ 生部食品 生监督柃验所．☆ 生榆验方浊（理化部丹Ｊ注解 ４小结 Ⅲ．Ｌ９８７：１４８ ７ Ｊ Ｃ Ｓ．Ｃｈｉｎ Ｈ…［９９７：３６ 酶抑制法作为一种快速检测蔬果中农残太小的筛椅方 法，与传统的化学方法和仪器丹析法相比，克服了分析速度 Ａｇ，ｉｅ Ｉ｛ｅｓ Ｃｈｉｎａ １９９ Ｌ，４０（２）：１８８—２０３ ８ Ｊ农业部农药植定所土编．新缩农药手册［Ｍ］．北席：农、 出版札． （收穑日艄：２００１—０９—０６） 慢．时间长、成本昂贵等缺路 它直接用抑制率高低来表示农 药残留毒肚大小，直观、简便、灵敏，并能在较短的时间检测较
