少白细胞混合血小板的制备及临床观察
目的：探討少白细胞混合血小板（LDPPCs）的制备方法及临床应用的安全性。方法：利用富血小板血浆法制备出浓缩血小板(PCs)后，将7人份PCs混合，离心洗涤清除袋底的白细胞、红细胞以及血浆，然后加入其中1人份的新鲜血浆200 ml悬浮即为LDPPCs。用血小板的MPV、P-LCR、计数、pH和白细胞、红细胞残余量、血小板活化试验、黏附试验等指标来评价血小板洗涤前后的质量变化。随机选择临床内科需要输注血小板的32名患者，分为两组。观察组每次输注1个治疗量（血小板数≥2.5×1011）少白细胞混合血小板，对照组每次输注1个治疗量（血小板数≥2.5×1011）单采血小板，检测输前、输后患者24 h血小板计数，并计算血小板校正增加值（CCI）及血小板回收率。结果：洗涤混合前、后及保存72 h的MPV、P-LCR、白细胞、红细胞残余量、pH值分别为(8.10±0.12)、(7.20±0.18)、（7.30±0.21）fl，（0.158±0.011）％、（0.146±0.031）%、（0.148±0.024）%，（598.76±803.24）×106、（46.69±60.17）×106 、（46.69±60.17）×106，（69.±49.34）×109、（1.25±1.16）×109、（1.25±1.16）×109，（7.08±0.23）、（6.93±0.39）、（6.93±0.17）。PCs和LDPPCs的PAC-1、黏附率分别为（2.85±0.42）％、（7.65±0.73）％，（4.65±0.34）％、（4.68±0.51）％。LDPPCs、单采血小板临床输注24 h后CCI分别为(10.56±5.09)、（12.13±8.82）。洗涤前后P-LCR、pH值相比差异无统计学意义，MPV、白细胞、红细胞残余量相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：利用此方法制备的LDPPCs的各项质量指标符合国家标准，临床输注是安全的，疗效是确切的，未观察不良反应，可以作为单采血小板的有益补充。
[Abstract] Objective: To discuss the method of making leukocyte-depleted pool platelet concentrates(LDPPCs), and its safety in clinical application. Methods: Platelet concentrate suspend(PCs) were prepared with the rich plasma method. 7 person’s PCs were pooled, decreased white cells and red cells after centrifugation, then transferred suspension of LDPPCs to the specific bags of platelet. Washed it with 0.9% salt solution twice, transferred suspension and added 200ml plasma to make LDPPCs. Using MPV,P-LCR, count, pH and hangover of white and red cells, activation test and adhesive test of platelet, to evaluate the quality change of platelet before and after washing. Randomly selected 32 patients needed to be transfused platelet, and to divide into 2 teams (observation and control).Patients in observation team were transfused 1 cure dosage （platelet count ≥2.5×1011）of LDPPCs, while those in control were transport 1 cure dosage （platelet count ≥2.5×1011）of pheresis platelets. Counted the number of platelet before and after 24 h of transfusion and calculated CCI and recovery rates of platelet. Result: MPV, P-LCR, white and red cells, pH of before and after washing、and stored for 72 h were respectively as: （8.10±0.12）,（7.20±0.18），（7.30±0.21）fl；（0.158±0.011）％，（0.146±0.031）%，（0.148±0.024）%，（598.76±803.24）×106，（46.69±60.17）×106，（46.69±60.17）×106；（69.±49.34）×109，（1.25±1.16）×109，（1.25±1.16）×109；（7.08±0.23），（6.93±0.39），（6.93±0.17）。PAC-1 and adhensive rate of PCs and LDPPCs were respectively as: （2.85±0.42）％，（7.65±0.73）％；（4.65±0.34）％，（4.68±0.51）％。CCI of LDPPCs and pheresis platelets after transfusion 24h were respectively as :(10.56±5.09)and（12.13±8.82）。
P-LCR and pH index before and after washing were not different significantly, while MPV, white and red cells were significantly different（P＜0.05）.Conclusion: The various quality index of LDPPCs in this way meets the standards of our country, and it is safe in clinical usage. Its cure effect is indeed, and can be used as supplement to pheresis platelets .
[Key words] Leukocyte-depleted pool platelet concentrates; Platelet-rich plasma; Leucocyte filtration
国内目前对临床上出现的由于血小板数目减少或功能不良导致的出血性疾病的预防和治疗，多采用输注血小板制剂。近年来，机采血小板由于其纯度、浓度高，白细胞混入少，止血效果显著，在临床上得到了广泛应用，而手工浓缩血小板悬液（platelet concentrate suspend，PCs）由于一个治疗量需要输注多人份，且白细胞混入过多，输血反应频繁，临床使用逐渐减少，大量地浪费了血液资源。为了充分利用无偿献血资源，改善以往PCs的诸多弊端，笔者利用无菌连接技术和白细胞过滤、洗涤技术，将多人份的PCs去白细胞后，用其中1人份的血浆悬浮浓缩血小板，制备出少白细胞混合血小板（leukocyte-depleted pool platelet concentrates，LDPPCs）。现将制备方法及临床观察报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
采集在MAP多联袋内的6 h内的400 ml新鲜全血制备的PCs(2 U/袋)、不同规格的无菌塑料空袋（上海莱斯公司生产）、血小板白细胞过滤器（南京赛尔金公司）、大容量低温离心机(德国Heraeus公司产)、KX-21型血小板计数仪(日本东亚公司产品)、全自动无菌接口机（日本泰尔茂公司生产）、0.9%生理盐水(国产)、恒温血小板震荡仪(美国产)、高频热合机、分浆夹、pH计等。
1.2LDPPCs制备方法
1.2.1 PCs的制备随机提取利用MAP多联袋采集的6 h内的400 ml新鲜全血,称重平衡后，置大容量低温离心机，以1 200×g、9 min、22℃离心，然后采用富浆法手工制备成富血小板血浆（PRP）。将PRP平衡后，以2 475×g、15 min、22℃离心，在分浆器上将其中1份血小板的血浆全部分离出来，并保留此份分出的血浆作为最终血小板产品的悬浮液，其余PRP袋中分离出大部分血浆，每袋剩余约40 ml血浆用于悬浮袋底的血小板，即制备得PCs(2 U/袋)。取样检测血小板产品的各项相关指标。
1.2.2 混合、洗涤将贮存期内已经解聚的检测结果合格后的14 U PCs，分别通过无菌接口机与已经全部全部分离出血浆的血小板袋无菌连接并混合，使14 U PCs均盛入此袋内。平衡后置入大容量低温离心机，22℃、580×g,轻离心5 min,清除袋底的白细胞、红细胞，将上清液即少白细胞血小板挤压转移到500 ml的血小板专用保存袋内。将0.9%生理盐水300 ml加入到血小板专用保存袋内，平
衡后置入离心机内，于22℃、2 475×g，离心15 min，移去上清液，再加入0.9%生理盐水300 ml，室温静置30 min，平衡后置入离心机内，22℃、2 475×g，离心15 min，移出全部上清液，再加入已经分离出的单人份新鲜血浆200 ml悬浮血小板即为LDPPCs，放入血小板恒温保存箱在22℃静置1 h后，然后水平震荡（60次/min）解聚，取样检测洗涤血小板的各项指标。将已经解聚的少白细胞混合洗涤血小板继续置入血小板恒温保存箱在22℃震荡保存72 h，检测血小板各项指标。
1.2.3 过滤 将盛有混合血小板的塑料袋与血小板白细胞过滤器，通过无菌接口机无菌连接，进一步滤除混合血小板中的白细胞，所得产品即为1个治疗量的去白细胞混合浓缩血小板悬液，其中血小板计数≥2.5×1011个/袋。
1.3 质量指标
用血小板的平均体积（MPV）、分布宽度（P-LCR）、计数、pH和白细胞、红细胞残余量、血小板活化试验（PAC-1）、粘附试验等指标来评价血小板洗涤前后的质量变化。
1.4 临床观察
随机选择临床内科需要输注血小板的32名患者，分为两组。观察组每次输注1个治疗量（血小板数≥2.5×1011）LDPPCs，对照组每次输注1个治疗量（血小板数≥2.5×1011）单采血小板，检测输前、输后24 h血小板计数，并计算CCI及血小板回收率。
体表面积(S)=0.0061×身高+0.0124×体重-0.0099
1.5 统计学方法
各组数据以“均数±标准差”表示，组间进行t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 血小板混合前后质量指标变化见表1, 单采血小板输注后的结果和少白细胞混合血小板输注后的结果见表2。
2.2 血小板制备过程中不同阶段血小板的早期活化实验指标（PAC-1）和粘附实验指标见表3。
3 讨论
传统的手工浓缩血小板由于其红细胞、白细胞混入多，每个治疗量需要连续输入多袋，且需要做交叉配血、输血反应多等缺点，近几年随着单采血小板的出现而逐渐在临床应用减少。国内为了避免输血不良反应，也有对血小板进行洗涤的报道，但多针对机采血小板，个别对手工血小板进行洗涤的，最后的悬浮液大多用生理盐水，致使制备的血小板不能保存[1~3]。为了避免传统手工浓缩血小板的诸多不足，充分利用无偿献血资源，笔者利用上述方法制备了LDPPCs，LDPPCs与传统的手工PCs不同，结果表明（表1），每一个成人治疗量的LDPPCs中白细胞和红细胞的残余量分别为(46.69±60.17)×106/L 、(1.25±1.16)×109/L，符合国家标准要求[4] ，基本可以避免非溶血性的发热反应。同时比较了浓缩血小板、混合洗涤过滤后血小板、单采血小板、少白细胞混合血小板的早期活化实验指标（表3），PAC-1均低于10%，说明制备过程对血小板的早期活化无影响。在临床输注过程中，与机采血小板相比效果没有明显差异，但两组的血小板回收率均较低，这可能是由于血液病患者的体内血小板计数偏低，属于治疗性输注，输入的血小板进入体内后多数参与了止血过程，造成了体内循环中的实际血小板数量不高。
少白细胞混合血小板MPV明显低于洗涤混合前的血小板（P＜0.05），这可能与反复离心有关[5]，因为MPV小的血小板总是靠近血浆界面，而MPV大的血小板接近红细胞界面，经过离心后，MPV大的血小板部分在洗涤去红细胞和白细胞过程中被去除。这可能也是少白细胞混合血小板制备过程中血小板丢失的原因之一。
在血小板免疫输注无效方面，由于血小板表面主要存在三大类抗原系统，即HLA-Ⅰ抗原、红细胞血型系統抗原、血小板膜糖蛋白上的特异性抗原（HPA），这些多种抗原的存在，在临床输血时可能导致输注无效。但研究表明，血小板输注无效主要由HLA抗体引起，约占79.9%，其次是HLA抗体与血小板抗体共存，约占17.6%，由血小板特异性抗体引起的仅占2.7%[6]。因此，对于患者而言单采血小板、少白细胞混合血小板，在HLA抗原方面均不可能与患者一致；在红细胞血型抗原方面，因是ABO同型输注，则两种制剂均与患者的红细胞血型抗原是一致的；在HPA方面，单采血小板的HPA则明显少于少白细胞混合血小板。但由于临床输注无效的产生与HPA的关系并不密切，且笔者在临床观察中（见表2），LDPPCs与单采血小板相比，未见输注无效的产生，CCI与血小板回收率未见明显差异，故尽管LDPPCs的HPA的种类是单采血小板的7倍，但对临床疗效影响不密切。
在细菌污染方面，血小板是最易受到细菌污染的血液成分之一。因为采集过程的皮肤消毒，以及制备过程的无菌连接等环节的不规范操作，可能是22℃保存血小板细菌污染的主要原因。因此改变采血时皮肤消毒方法和严格规范无菌接口的操作是避免细菌污染的主要方法之一[7~9]。笔者利用上述方法制备的LDPPCs未见细菌污染。
综上所述，LDPPCs与传统的PCs相比，由于红细胞混入少，输注时可以避免做交叉配合实验，同时由于白细胞的去除，对预防非溶血性输血反应有一定的作用，在临床应用方面是安全的，且有效地利用了无偿献血资源，可以作为单采
血小板临床应用的有益补充，也是今后国内血小板应用的一个方向。
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