大鼠Langendroff离体心脏局部缺血再灌注模型建立及功能评价

中国比较医学杂志

CHINESEJOUＲNALOFCOMPAＲATIVEMEDICINEDecember，2013Vol．23No．12

檵檵檵檵殝研究报告

檵殝檵殝大鼠Langendroff离体心脏局部缺血

再灌注模型建立及功能评价

1

陈婵娟，潘

123

昡，赵明镜，鲁卫星

（1.北京中医药大学，北京100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京100007；

3.北京中医药大学第三附属医院心内科，北京100029）

【摘要】目的

建立大鼠Langendorff离体心脏局部缺血再灌注模型的方法并进行功能评价。方法

将26

只Wistar大鼠随机分成2组，对照组（control，n=12）和模型组（model，n=14）。两组均建立标准的Langendorff离H液持续灌注（95%O2+5%CO2过饱和，K-H液持续灌注平衡20体心脏灌注模型：K-左心室插入球囊压力管），min后对照组K-H液持续灌注105min；模型组同对照组平衡20min后穿线结扎冠状动脉左前降支第一对角支下TTC染色观察心肌梗死、造成局部停灌（缺血）30min，而后剪断结扎线复灌（再灌注）75min。伊文思蓝、缺缘部位，

血面积；记录左心室压力及心率变化过程，比较各组平衡20min、局部缺血30min、再灌15min、再灌30min、再灌75min的血流动力学指标及灌流液中肌酸激酶（creatinekinase，CK）和乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）漏出量。结果

对照组血供正常，模型组局部缺血、梗死明显；对照组、模型组平衡末心肌酶学及血流动力学各参数

无明显差异（P＞0.05），模型组局部缺血、再灌注各个观测时刻心肌酶学及血流动力学参数均与对照组有显著差异（P＜0.05），说明模型组经历局部缺血、再灌注损伤，心肌酶漏出明显升高，心脏收缩功能、舒张功能受损，心肌耗氧量升高。结论

大鼠Langendorff离体心脏局部缺血灌注模型稳定可靠，掌握制作要点及注意事项后，可顺利

为心肌局部缺血再灌注损伤的研究提供更接近临床疾病状态的实验途径。快速地成功制备，

【关键词】大鼠；Langendorff离体心脏；局部缺血再灌注；模型制备与评价【中图分类号】Ｒ33

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856（2013）12-0021-06

doi：10.3969．j．issn．1671.7856.2013.012.006

EstablishmentandassessmentofaLangendorffperfused

ratheartmodelofischemia-reperfusion

CHENChan-juan1，PANXuan1，ZHAOMing-jing2，LUWei-xing3（1.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijig100029，China；

2.DongzhimenHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijig100007；

3.DepartmentofCardiology，theThirdAffiliatedHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029）【Abstract】ObjectiveMethods

ToexploreandsummarizeaLangendorffperfusedratheartmodelofischemia-reperfusion．

Twenty-sixWistaradultratsweredividedintotwogroupsrandomly：controlgroup（n=12）andmodelgroup

（n=14）．Eachratunderwentopen-chestsurgery．Theheartswereremovedandimmediatelycannulatedandeffectively

［基金项目］国家自然科学基金（81273691）。

［作者简介］陈婵娟（1985－），女，在读博士生，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药对心血管疾病的预防与mail：ccjqlgcj@126．com。治疗。E-［通讯作者］鲁卫星（1959－），男，主任医师，博士生导师，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药防治心血管mail：weixinglu918@sina．com。疾病的研究。E-

檵檵檵檵殝22

中国比较医学杂志2013年12月第23卷第12期ChinJCompMed，December2013，Vol．23．No．12

perfusedinLangendorffapparatus．Afluid-filledlatexballoonwasinsertedvialeftatriumintotheleftventricleformeasurementoftheleftventricularfunction．Heartsofthecontrolgroupreceivedcontinuousperfusionwithoutischemiafor105min．Heartsofthemodelgroupreceived20mincontinuousperfusionforstabilizationandthenunderwent30minischemiabyleftanteriordescendingcoronaryartery（LAD）ligationand75minreperfusion．ThenEvansblueandTTCstainingwereusedtoobservethemyocardialinfarctionarea．ComparedthelevelsofperfusateCKandLDH，hemodynamicindex，heartratesofthecontrolandmodelgroupsatdifferenttimepoints：endof20mincontinuousperfusion，endof30minischemia，reperfusion15min，30minand75min．Ｒesults

Heartsofthecontrolgroupshowednormalbloodsupply，

whilethemodelgroupshowedevidentlocalischemiaandinfarction．Therewasnosignificantdifferencebetweenthecontrolandmodelgroupsinmyocardialenzymesandhemodynamicindexesattheendof20mincontinuousperfusion（P＜0.05）．Intherestofthetime，themyocardialenzymologyandhemodynamicindexesinthemodelgrouphadsignificantdifferencescomparedwiththatofthecontrolgroup（P＜0.05），whichindicatedlocalischemia，reperfusioninjury，andincreasedmyocardialenzymeleakage，impairmentoftheheartsystolicanddiastolicfunction，andincreaseofmyocardialoxygenconsumptioninthehearts．Conclusions

Langendorffperfusedratheartmodelsofischemia-reperfusionisstableand

effective．Aftermasteringthesurgicalskillsandkeepingaboveattentions，themodelcanbeestablishedsuccessfullyandquickly．Thismodelismoreclosetoclinicconditions，andprovidesanewexperimentalapproachinresearchofmyocardialischemia-reperfusioninjury．

【Keywords】Ｒat，Langendorffperfusedheart；Ischemia-reperfusioninjury；Modelestablishment；Modelassessment

缺血再灌注损伤广泛存在于心、脑、肾、周围血

管病等多种组织器官，是临床上缺血性心血管疾病心脏介入术疗效不佳和器官移植领域亟待的防治、

［1］

解决的问题。抗缺血再灌注损伤药物的研究和由于大鼠的冠脉走形及血液开发正处于实验阶段，

循环途径上比较接近人类、冠状动脉侧支循环少，心肌缺血及梗死出现早，模型稳定性好，故大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型被广泛用于该病发生

［2］

发展机制的探索、可行性干预措施的研究等。由影响因素比较于离体心脏不受神经体液的调节，少，可控性及可复制性较强，是心肌缺血/再灌注形态、功能及电生理学研究的重要模型

［3］

有限公司）、戊巴比妥钠（美国Biotopped公司）、余市场分析纯均购于北京化学试剂公司及国药集团

化学试剂有限公司。1.1.3

设备及材料：Langendorff（澳大利亚AD

InstrumentsPtyLtd实验室，ML870B2Langendorff

System）、LE13206）、恒温水浴（LETIC公司，电子天

JA1003）、PH仪（上海精密科平（上海精科天平厂，

PHS-3B）、学仪器有限公司，蠕动泵（Gilson公司，

Miniplus3）、多导生理仪（美国BiopacMP150）、医用带线缝合针（上海医二元气（95%O2+5%CO2）、

规格圆3/82.5×85/0）、自用缝合针厂有限公司，制球囊及导管。

1.2实验方法1.2.1

Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液的配置：以H液为例［5］：氯化钠118、碳酸氢钠25、氯配置1LK-

。以往离体

［4］

心脏缺血再灌注模型大多是全心停灌造模，这与

临床上冠心病心肌梗死介入术后再通的疾病状态

不能达到模拟临床疾病状态的目的。有较大差异，

本文采用26只Wistar大鼠建立Langendorff离体心

脏模型，通过结扎冠状动脉左前降支造成离体心脏局部缺血再灌注模型，提供更接近临床疾病状态的离体心脏局部缺血再灌注模型的建立和功能评价的方法11.11.1.1

材料和方法材料

化钾4.7、磷酸二氢钾1.2、葡萄糖11.1、硫酸镁

1.2、无水氯化钙1.25（单位：mmol/L），将前6种分析纯依次溶于常温去离子水，氯化钙单溶后缓慢倒入，充分搅拌至完全溶解。调PH至7.3～7.4生理范围，定容至1L。

1.2.2分组及Langendorff模型制备

应用随机数字表法将26只雄性Wistar大鼠随

3

机分为两组。取大鼠，称重，按1×10U/1kg腹腔30min后充分肝素化，按1mL/注射肝素生理盐水，

kg给予3%戊巴比妥腹腔注射麻醉。动物充分麻醉后，置于动物台上并固定。开胸暴露主动脉弓，轻提主动脉与无名动脉汇合处，从主动脉弓以下剪断

实验动物：雄性Wistar大鼠26只，体重（300

～350）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提

0007。供，许可证号：SCXK（京）2009-1.1.2药品：肝素钠（江苏常州千红生化制药股份

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23

主动脉，提着主动脉断端，剪下完整的心脏，迅速放

入预备好的平皿（内为0℃K-H液），提前将蠕动泵调为7.5mL/min，排净Langendorff管路中气体，以

免空气挤入主动脉，造成空气栓塞，立刻用眼科镊夹持主动脉管壁将灌注管道插入主动脉，

置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，

0号线系线固定，逆行灌注正式开始。将右心耳剪开一个小口以便灌流液

流出。建立标准的Langendorff离体心脏灌注模型后

［6、7］

，保持恒定状态：恒温（38℃）恒流（实时测冠

脉流量CF为10±0.1mL/min）、

95%O2+5%CO2混合气持续对灌流液进行鼓泡式氧合，测量灌注压

为60～80mmHg。待心脏复跳且搏动良好，心律齐，剪开左心耳，经左心耳破孔、二尖瓣，将自制心

室内压球囊测压管送入左心室，

测压导管通过压力感受装置连接多导生理记录仪，

记录全程心率（heartrate，HＲ）、左心室舒张终末压（leftventricularend-diastolicpressure，LVEDP）、收缩终末压（left

ventricularend-systolicpressure，LVESP）等从而计算出左心室发展压（leftventriculardevelopedpressure，

LVDP）、左室内压下降最大速率（-dp/dtmax）、左室内压上升最大速率（+dp/dtmax）等心功能指标。模型组在放球囊之前穿线包绕冠状动脉左前降支，方法如下：以左冠状静脉主干（心大静脉）为标志，位点为冠状动脉左前降支第一对角支分支以下部位，目的是避免放置球囊之后穿线刺破球囊实验失败。

平衡20min待心脏收缩舒张功能恢复，心律齐，记录下正常指标作为基线，即可开始分组实验。入组标准：心律齐，心率（HＲ）≥220次/min且左室

收缩压（LVSP）≥60mmHg［8］

。对照组：K-

H液持续灌注105min；模型组：穿线结扎冠状动脉左前降支

第一对角支分支以下部位，

造成局部停灌（缺血）30min，而后开放结扎线复灌（再灌注）75min。整个实

验过程中各组均K-H液持续灌注。全程记录左心室压力及心率，测量各组平衡20min、局部缺血30

min、再灌15min、再灌30min、再灌75min的冠脉流量及灌流液中心肌酶学指标CK、

LDH。穿线结扎冠状动脉左前降支方法有垫线法和

推管法，

均可达到闭塞冠脉左前降支造成局部心肌缺血和复灌的效果。日常必须维持Langendorff系

统的管道完整、

密封、清洁和畅通。实验全程中压力感受装置应固定位置，

避免改变位置造成的压力测量标准的变化；应时刻维持恒温储液罐中K-

H液的量，尽量使药液提前氧合，避免断液、断气。

1.2.3统计学方法：采用SAS11.0统计软件，计量资料用均数±标准差（x珋±s）表示，组内采用单因素方差分析，组间采用样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果与分析

2.1

TTC染色（n=4）与伊文思蓝与TTC双染色

（n=4）

伊文思蓝（Evansblue）是血流依赖性染料，正常心肌血供好，被染为蓝色，否则无蓝色。对照组持续灌注105min、

模型组局部缺血30min、再灌注75min后分别经主动脉逆向注入1%伊文思蓝2mL行心肌染色（时间约30s），而后正常心肌被染成蓝

色，

而缺血和梗死心肌染色阴性，可将正常心肌与损伤心肌（包括缺血心肌和梗死心肌）区别开来，尚

不能区分缺血心肌和梗死心肌，

为了更进一步区分缺血心肌和梗死心肌，

必须进行TTC染色［9］

。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，

3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）是脂溶性光敏感复合物，因染色后颜色较易观察且灵敏性高而被广泛用于研究离体心脏缺血/再灌注损伤中

［10］

。因为TTC在脱氢酶完整

的组织（正常和危险心肌）内形成红色沉淀，因此存

活心肌染成砖红色，

梗塞心肌由于缺乏完整的脱氢酶系统，因而不染色，可区分梗死心肌与正常和缺

血心肌。充分染色后迅速剪下心脏，

低温生理盐水冲洗后将左心室切成厚约2mm的切片。血供正常

心肌呈蓝染，缺血心肌呈砖红或苍白。将心肌置于37℃10%TTC中水浴15min。正常心肌呈蓝色，缺血区未梗死心肌呈红色，

梗死心肌组织为白色。切片进行数码照相，

图1见封三。对照组持续灌注105min、模型组局部缺血30

min、再灌注75min后迅速剪下心脏，低温生理盐水冲洗后将左心室切成厚约2mm的切片，置于37℃10%TTC中水浴15min。正常心肌呈红色，缺血区心肌呈白色［9］

。切片进行数码照相，图2见封三。

2.2

心肌酶学参数

肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）是心肌细胞胞质中存在的两类酶，当细胞膜通透性增加时这

些物质能透过胞质释放到冠状动脉中。血清（本实验中为灌流液）磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）的变化可作为判断心肌缺血/再灌注损伤程度及预后的重要指标

［11］

。组内方差分析得出：对照

24

中国比较医学杂志2013年12月第23卷第12期ChinJCompMed，December2013，Vol．23．No．12

组5个时刻CK无统计学差异（P=0.053＞0.05）且

差异无统计学意义；对照组5个两两比较P＞0.05，

时刻LDH差异有统计学意义（P=0.028＜0.05），其中平衡灌注20min与局部缺血30min、再灌注15min、30min、75min差异比较有统计学意义（P=0.06/0.07/0.09/0.22＜0.05），提示平衡灌注20min时的LDH高于局部缺血30min、再灌注15min、30min、75min等4个时刻的LDH，原因可能为摘取心脏手术造成一定的心肌损伤，这种损伤在平LDH衡灌注过程中逐渐恢复。模型组5个时刻CK、不全相等（P=0＜0.01），其中平衡灌注20min与局部缺血30min（P=0.768/0.802＞0.05）、再灌注15min与再灌注30min（P=0.326/0.459＞0.05）、再灌注30min与再灌注75min（P=0.211/0.175＞

LDH两两0.05）差异无统计学意义，其他时刻CK、比较差异均有统计学意义。统计结果结合原始数

LDH开始出现上据提示从局部缺血30min时CK、

升趋势，但平衡灌注20min与局部缺血30min的差

异无统计学意义；从再灌注15min往后差异有统计LDH显著升高的主说明造成心肌损伤CK、学意义，

LDH值要原因不是局部缺血，而是再灌注损伤；CK、在再灌注15min出现高峰，但是再灌注15min与再

灌注30min、再灌注30min与再灌注75min差异无统计学意义，说明缺血再灌注损伤持续存在，随再灌注时间减轻不明显。

LDH与模型组平对照组平衡灌注20minCK、

LDH相比，衡灌注20minCK、差异无统计学意义（P=0.620/0.368＞0.05）。对照组局部缺血30min（假手术）CK、LDH与模型组局部缺血30minCK、

LDH相比，有显著差异（P=0＜0.01）。模型组再灌30min、75minCK漏出量均显著升高，在注15min、

再灌注15min达到高峰，与对照组再灌注15min、30min、75minCK漏出量相比较差异显著（P＜

30min、75minLDH0.01）。模型组再灌注15min、

漏出量均显著升高，在再灌注15min达到高峰，与

Tab．1

参数Variables肌酸激酶

CK（IU/L）乳酸脱氢酶LDH（IU/L）

组别GroupsCMCM

30min、75minLDH漏出量相对照组再灌注15min、

比较差异显著（P＜0.01）见表1。这一现象与既往

［11，12］

，研究相符证实造模成功有效。

2.3血流动力学参数

LVEDP、-dp/dtmax反映左在心功能指标方面，

LVDP、+dp/dtmax反映左心室收缩心室舒张功能，

HＲ反映心脏的氧消耗。对照组与模型功能，

-dp/dtmax、组平衡灌注20minLVDP、+dp/dtmax、

HＲ无差异，说明两组基线一致，有可比性。对照组5个时刻LVEDP、LVESP、LVDP、HＲ、±dp/dtmax之

间差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组平衡灌注20minLVEDP与其他时刻差异显著（P＜0.05，P＜0.01），其他4个时刻之间差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组局部缺血30minLVESP与平衡灌注20min、30、75min差异显著（P=0.001/再灌注15、0.022/0.011、0.038＜0.05），平衡灌注20min、再灌30、75min这4个时刻之间LVESP差异无统注15、

计学意义（P＞0.05），考虑原因为舒张末压力与心脏物理状态关系密切，局部结扎缺血时左室壁部分舒张末压力升高。模型组平衡心肌被捆绑在一起，

灌注末心率与其他时刻差异显著（P＜0.01），其他4个时刻之间差异无统计学意义（P＞0.05），说明无论缺血损伤还是再灌注损伤均会造成心肌耗氧量升高。模型组平衡灌注20min的±dp/dtmax与其他时刻差异显著（P＜0.05，P＜0.01），其他4个时刻之间±dp/dtmax差异无统计学意义（P＜0.05）。对照组与模型组局部缺血30min、再灌注15、30、75min的各项血流动力学参数均有显著差异（P＜0.05，P＜0.01）。模型组局部缺血30min、再灌30、75min的LVEDP、-dp/dtmax均降低，注15、反映模型组左心室舒张功能下降；模型组局部缺血30min、30、75min的LVDP、+dp/dtmax均再灌注15、降低，反映模型组左心室收缩功能下降；模型组局30、75minHＲ升高，再灌注15、反映部缺血30min、

模型组心脏的氧消耗增加（表2）。

［13、14］

LDH含量比较表1各组不同时刻灌流液心肌酶CK、

ComparisonofthelevelofperfusateCKandLDHinvariousgroupsatdifferenttimepoints

数量n810810

平衡灌注20minContinuousperfusion23.19±18．5628.65±25．527.43±7．6510.91±8．15

局部缺血30minIschemia5.68±2．5816.44±4．33AB1.13±1．41B5.96±1．14AB

15min5.26±4．77250.4±109．66AB

1.21±1．52B99.9±59．72AB

再灌注Ｒeperfusion

30min

6.65±13．18151.88±65．57AB

1.48±3．73B57.07±26．91AB

75min8.73±13.03107.78±81.87Ab

2.28±4.01b37±30.33Ab

a表示P＜0.05，A表示P＜0.01；组内比较，b表示P＜0.05，B表示P＜0.01。注：组间比较，

Note：Comparisonbetweenthetwogroups：a：P＜0.05，A：P＜0.01．Comparisoninthesamegroup：b：P＜0.05，B：P＜0.01．

中国比较医学杂志2013年12月第23卷第12期ChinJCompMed，December2013，Vol．23．No．12

25

Tab．2

参数Variable

LVESPLVEDPLVDPHＲ+Dp/dtmax-Dp/dtmax

组别GroupsCMCMCMCMCMCM

表2各组不同时刻血流动力学参数比较

Comparisonofthechangesofhemodynamicparametersinvariousgroupsatdifferenttimepoints

数量n810810810810810810

平衡灌注20minContinuousperfusion74.90±9．1582.76±9．997.63±2．148.58±1．4967.28±11．1474.18±10．18265.83±14．06283.62±31．00732.08±112．78824.29±96．52670.90±135．46608.62±526．27

局部缺血30minIschemia75.79±7．11.82±9．545.81±0．74

aB

15min74.39±3．1759.35±6．6.71±1．25

AB

再灌注Ｒeperfusion

30min69.34±2．7255.71±8．025.58±0．99

AB

75min71.40±4．1053.14±9．11AB5.±0．8511.02±4．08Ab65.51±3．5342.11±8．94Ab269.34±13．53319.77±34．77AB805.48±57．38540.70±93．91Ab729.86±29．79498.95±96．72AB

14.50±3．24AB69.97±7．4150.32±11．40AB280.73±25．85317.59±26．10AB796.48±74．75613.84±99．01716.32±112．08

Ab

10.65±4．30ab67.68±2．98.71±8．40Ab288.11±30．16320.36±32．83aB801.24±40．08593.10±2．57723.86±46．85

Ab

10.21±4．21Ab63.76±2．0445.51±8．80Ab335.30±46．77320.09±35．66B754.38±17．84577.05±92．85Ab703.84±27．84533.40±99．44AB

573.52±98．70aB528.72±124．18AB

LVEDP，mmHg），注：左心室收缩末期压LVESP（mmHg），左心室舒张末期压LVEDP（mmHg），左心室发展压LVEDP（=LVESP-心率HＲ（次/min），a表示P＜0.05，A表示P＜左心室压力最大变化速率dp/dtmax（mmHg/s）、左心室压力最小变化速率dp/dtmin（mmHg/s）。组间比较，0.01；组内比较，b表示P＜0.05，B表示P＜0.01。

Note：Leftventricularend-diastolicpressure，LVEDP（mmHg），leftventricularend-systolicpressure，LVESP（mmHg），leftventriculardevelopeddp/pressure，LVDP（mmHg），maximumrateofleftventricularpressurerise，+dp/dtmax（mmHg/s），leftventricularpressuredropmaximumrate，dtmax（mmHg/s）．Comparisonbetweentwogroups：a：P＜0.05，A：P＜0.01．Comparisoninthesamegroups：b：P＜0.05，B：P＜0.01．

3讨论

缺血再灌注损伤的研究提供更接近临床疾病状态

的实验途径。

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Langendorff离体心脏灌流由15年德国生理

［15］

学家Langendorff发明，原理是采用主动脉插管逆行灌注，提供心脏营养物质，使心脏保持跳动。逆向灌注使主动脉瓣关闭，灌流液通过左右冠状动脉开口进入冠状动脉系统营养心肌后，除了少量直接进入心腔外，绝大多数通过心小、中、大静脉汇集到冠状静脉窦，最后经右心房（耳）、肺动脉和腔静脉断端排出。该模型的优点是制备简单，操作方便，费用低廉；实验因素容易控制，稳定性好，重复

［16］

整体干性强；无其他器官影响及神经体液调节，

［8］

扰因素较少，有利于单个实验因素研究。应用Langendorff模型可将药物溶解于灌流液中给药，药

［7］

物作用路径明确，药物剂量和浓度精确，可用于研

效关系，适合于水溶性好、需要长期给究药物的量-［17，18］

。现使用药的心肌缺血再灌注药效学实验

Langendorff离体心脏灌流模型造成不同程度或不同

等级的心肌缺血可以通过完全阻断（通过夹闭流入

［19］

管道）或部分灌注液流速获得。本实验目的心梗介入术后心肌缺是模拟冠心病局部心肌缺血、

血再灌注损伤等临床疾病状态，研究局部心肌缺血再灌注损伤的药物作用途径，故选用心脏局部缺血再灌注模型，通过闭塞、开放冠脉左前降支造成局部心肌缺血和复灌。本实验证实：掌握制作要点及注意事项后，可顺利快速地成功制备，为心肌局部

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