不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响

TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineeringVol.29No.1Jan.2013

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不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响

王永忠1,2，冉尧1,2，陈蓉1,2，廖强1,2，朱恂1,2

（1.重庆大学低品位能源利用技术及系统教育部重点实验室，重庆400030；

2.重庆大学工程热物理研究所，重庆400030）

摘要：该文研究了自然堆积、超声波、NaOH溶液以及H2SO4溶液等不同方法预处理后的稻草秸秆基质固态酶解特性，结合SEM电镜扫描、傅里叶变换红外光谱（FTIR）及X射线衍射对预处理前后稻草秸秆基质的结构特性进行了观察和分析，获得了稻草秸秆固态酶解的最佳预处理条件。结果表明自然堆积9d、质量分数分别为1.0%的NaOH溶液和15%的H2SO4溶液、超声40min的预处理条件能有效除去包裹在纤维素基质外表面的木质素和半纤维素，提高基质的酶解糖化效率。该试验中质量分数为1.0%的NaOH溶液预处理后的稻草秸秆通过酶解作用获得的还原糖产率最高，为126.3mg/g。该研究可为探索提高纤维素基质酶解糖化效率的方法提供参考。关键词：糖化作用，秸秆，超声波，固态酶解，预处理doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.01.030中图分类号：TK6文献标志码：A文章编号：1002-6819(2013)-01-0225-07王永忠，冉尧，陈蓉，等.不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响[J].农业工程学报，2013，29(1)：225－231.

WangYongzhong,RanYao,ChenRong,etal.Effectsofdifferentpretreatmentmethodsonenzymolysischaracteristicsofricestrawinsolidstate[J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering(TransactionsoftheCSAE),2013,29(1):225－231.(inChinesewithEnglishabstract)

0引

言

在木质纤维素转化能源过程中，纤维素的酶解糖化是最关键的步骤，也是木质纤维素能源化转化过程中的性步骤。只有当木质纤维素通过酶解作用转化为葡萄糖、木糖等单糖后，才能通过发酵过程转化为各种生物能源，如乙醇、H2等[1-3]。然而传统的酶解作用在液态条件下进行，由此产生一系列问题，例如酶解糖化效率和水解产物浓度低，单糖浓缩过程需消耗大量能量，产生大量的废水，反应器体积过大[3-5]。目前，人们提出的固态酶解糖化方法能有效地克服这些问题[5-7]。固态酶解是指基质中游离水含量低的条件下进行纤维素基质的酶解糖化作用。

木质纤维素原料具有结晶度高和木质化两大特征[6-9]，因此，在酶解前对木质纤维素进行适当的预处理可以改变其理化结构，降低结晶度，有效去除木质素，增加纤维素酶等水解酶在基质表面的吸附性能，提高酶解效率[8-11]。目前，人们对不同

收稿日期：2012-08-31



预处理方法对纤维素基质液态条件下的酶解特性进行了许多研究[10-13]，而关于预处理方法对固态酶解反应特性的影响还未见报道。开展这方面的研究有助于探索提高纤维素基质酶解糖化效率的方法，促进纤维素基质固态酶解糖化技术的发展和应用。

本文以稻草秸秆为原料，分别对稻草秸秆进行了自然堆积、NaOH、H2SO4、超声波等预处理，利用处理后的秸秆基质进行了固态酶解试验，分析了不同预处理方法对固态基质酶解特性的影响及预处理前后稻草秸秆基质的表观特性及化学结构的变化，并对试验结果进行了显著性分析。

1材料和方法

修订日期：2012-12-14

基金项目：国家自然科学基金项目（No.50976130,No.51136007），国

家杰出青年基金项目（No.50825602）

作者简介：王永忠（1967－），男，四川资阳人，副教授，主要研究方向为环境与能源生物技术中的热物理问题。重庆重庆大学工程热物理研究所400030。Email:wangyzh@cqu.edu.cn

1.1材料

稻草秸秆取自重庆郊区，秸秆剪切成2～4cm小段，洗净并烘干至恒质量，放置于密封器皿中待用。纤维素酶采用商业用绿色木酶，购自上海展云化工有限公司，活性大于15U/mg。其他化学试剂均为分析纯。

1.2稻草秸秆预处理方法1.2.1自然堆积

取备用稻草秸秆50g，置于1000mL烧杯中，并加入200mL蒸馏水，混合均匀后用保鲜膜封好烧杯口，以维持烧杯中基质的含水率。在室温

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农业工程学报2013年

为30℃左右的条件下进行自然堆积预处理，分别于堆积的第0、3、6、9、12天从烧杯中称取4.0g稻草基质烘干粉碎，取过60目筛[14]的基质进行酶解试验。

1.2.2NaOH预处理

取备用秸秆50g，按固液比1:10（g/mL）的比例加入NaOH溶液并使秸秆充分润侵，于室温（30℃左右）下处理24h。NaOH溶液质量分数分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%[15-17]。处理完成后，用蒸馏水对秸秆进行冲洗至中性，并在105℃下烘箱中烘干至恒质量。对烘干后稻草基质粉碎，取过60目筛的稻草粉末进行固态酶解试验。1.2.3H2SO4预处理

取备用秸秆，按固液比1∶10（g/mL）加入H2SO4溶液润侵，于室温（30℃左右）下处理24h。H2SO4溶液质量分数为1%、5%、10%、15%、20%、25%[18-20]。处理完成后，用蒸馏水对秸秆进行冲洗至中性，并在105℃的烘箱中烘干至恒质量。对烘干后稻草基质进行粉碎，取过60目筛的稻草粉末进行固态酶解试验。1.2.4超声波预处理

对洗净干燥后的稻草秸秆粉碎，取过60目筛的稻草粉末在冰浴条件下进行超声波预处理。超声功率为180W，固液比为1∶15（g/mL），超声时间分别为5、10、20、30、40、60min[21-24]。处理完成后将基质烘干，进行固态酶解试验。1.3试验步骤1.3.1固态酶解

分别称取4.0g预处理后的秸秆基质进行灭菌，作为酶解基质。冷却后，根据前期试验结果按基质量与加水量为1∶4（g/mL）的比例加入含有纤维素酶的无菌水16mL，混合均匀后填装于50mL离心管中，密封，置于恒温水浴箱中进行纤维素基质的酶解糖化。其中，纤维素酶的添加量为20.0mg，酶解温度控制为50℃，酶解时间为96h。1.3.2测量方法

酶解完成后，在基质中加入6.5mL蒸馏水，在高速冷冻离心机中离心10min（10000r/min），取离心后上清液测量还原糖浓度。还原糖浓度测量采用3,5-二硝基水杨酸法[25]，并根据离心得到的液体总量计算总还原糖量，总还原糖量除以基质初始量得到其产率。

为了进一步分析预处理方法对稻草基质表面特性及化学结构特性的影响，分别取预处理前基质及1.0%NaOH溶液预处理、15%H2SO4溶液预处理及15min超声波预处理后的稻草秸秆基质，进行SEM电镜扫描、傅里叶红外光谱分析及X-射线衍

射分析。由于自然堆积预处理后的基质酶解效率较低，因此没有进行相应的后续观察和扫描。

2结果与分析

2.1自然堆积预处理对酶解结果影响

自然环境中存在着大量微生物，可以分解木质纤维素成分，降低其聚合度；同时，自然堆积不需要消耗能源或者化学试剂。由此，本试验对稻草秸秆进行自然堆积预处理，分析了堆积时间对固态酶解性能的影响（图1）。

图1自然堆积时间对酶解作用的影响

Fig.1

Effectofnaturestackingtimeofcellulosicmaterialon

enzymolysis

由图1发现，随着自然堆积时间延长还原糖产率变化不明显，维持在1.3mg/g左右。12d的自然堆积预处理后，稻草秸秆固态酶解还原糖产率与未预处理的基本相同。结果表明尽管在自然界存在大量微生物，但对木质纤维素具有高效水解作用的微生物种类较少，且其繁殖生长需要消耗水解产生的单糖，同时单纯采用自然堆积的方式对纤维素基质结构的改变很小。因此，单纯的自然堆积所获得的还原糖产率相对较低，采用其他预处理方式如化学、物理法是很有必要的。

2.2NaOH预处理稻草秸秆对固态酶解特性的影响

NaOH能削弱纤维素与半纤维素之间的氢键及皂化半纤维素与木质素之间的酯键，增加木质纤维素的孔隙度。因此，利用稀NaOH溶液对木质纤维素进行处理，可以润涨原料，从而增加其内部表面积，降低聚合度及结晶度，同时去除木质素[10,26]。本试验研究了不同NaOH质量分数处理后稻草秸秆的固态酶解特性。

试验结果见图2。由图发现，当NaOH质量分数从0.5%增加到1.0%，酶解所得还原糖产率从65.4mg/g增加到126.3mg/g，而随着NaOH质量分数进一步增加到5.0%，所得还原糖产率逐渐减少至36.7mg/g。对于固态酶解作用而言，纤维素酶能否

第1期王永忠等：不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响

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有效被纤维素基质吸附是影响木质纤维素原料水解产率的主要因素[11]。已有研究表明，随着NaOH质量分数的提高，预处理后的秸秆基质中纤维素含量增加[27]。因此，当NaOH质量分数从0.5%增加到1.0%时，还原糖产量明显提高。但当NaOH质量分数进一步提高时，经过预处理后稻草秸秆形貌呈絮状，密度明显下降，同时，基质对水的浸润性降低，所以酶解反应效率下降，得到的还原糖产率相应降低。这是因为水不仅是纤维素基质酶解作用的直接参与者，更是作为传质媒介直接影响纤维素酶在纤维素基质表面的吸附。当预处理后的基质浸润性降低时，也就降低了基质的吸水膨胀性和其表面对纤维素酶的有效吸附性。另一方面，随着基质对水浸润性的降低，基质孔隙中含水率下降，造成基质反应位点产生的糖类积累，黏度增强，抑制了纤维素酶的迁移和吸附，这也进一步阻碍了酶解反应的进行[28-29]。

图2NaOH质量分数对酶解作用的影响

Fig.2EffectofmassfractionofNaOHonenzymolysis

本试验中，质量分数为1.0%的NaOH溶液对稻草秸秆预处理后固态酶解效果最佳，还原糖产率为126.3mg/g。

2.3H2SO4预处理稻草秸秆对固态酶解特性的影响

稀酸预处理能有效去除木质纤维素中的半纤维素，降低木质纤维素聚合度。本试验研究了常温下不同质量分数的H2SO4预处理稻草秸秆后的酶解特性。

试验结果如图3所示，随着H2SO4质量分数从1%提高到15%，还原糖产率从12.7mg/g逐渐增加到99.7mg/g，而随着H2SO4质量分数的继续增大，还原糖产率则呈下降趋势，当H2SO4质量分数增大至25%时，得到的还原糖产率仅为24.3mg/g。这是由于随着H2SO4质量分数的增加，基质中被分解木质素和半纤维素增多，由木质素和半纤维素形成的保护层逐渐被破坏，基质微纤丝中的纤维素被暴露，从而增加了纤维素酶与纤维素接触的几率，促进了酶解作用，由此提高了还原糖产率。而随着预

处理H2SO4质量分数的进一步增大，H2SO4不仅引起木质素和半纤维素的溶解，同时，还导致纤维素中的游离羟基发生酯化作用，生成硫酸氢酯，甚至在强酸作用下，发生反应，生成糠醛一类的化学物质[30-31]。因此，预处理后的基质中纤维素含量下降，引起酶解反应的还原糖产率降低。此外，较强质量分数的酸预处理还易造成暴露的纤维素再结晶，这也是引起纤维素酶水解效率下降的原因之一。

图3H2SO4质量分数对酶解作用的影响

Fig.3EffectofmassfractionofH2SO4onenzymolysis

本试验中，当H2SO4质量分数为15%的时候，还原糖产率最高达99.7mg/g，此时酶解效果最佳。2.4超声波预处理对稻草秸秆固态酶解特性的影响

超声波具有空化、机械传质等作用，来自超声波产生的微射流对秸杆表面产生冲击、剪切，且空化作用所产生的热量及自由基均可使大分子降解，从而降低木质纤维素的结晶度。在一定功率条件下的超声波预处理过程中，超声时间对预处理效果影响显著，为此，本试验研究了超声波预处理时间对超声预处理后的稻草秸秆酶解性能的影响。

试验结果见图4。从图可看出，随着超声时间增加，酶解后得到还原糖产率呈逐渐增加的趋势。当超声波预处理时间从5min增加到20min时，酶解后基质还原糖产率从9.1mg/g缓慢增加至10.6mg/g。这是由于在较短的预处理时间内，超声波对稻草秸秆的预处理效果较差，不能明显提高酶解效率。随着超声时间继续增加到40min，酶解后基质还原糖产率显著增加到25.4mg/g，在这个预处理时间内，超声波产生的机械力和空化作用能对稻草基质表面进行充分的侵蚀，木质纤维素结晶度显著降低，因此，酶解效率显著提高。然而，随着超声处理时间从40min增加到60min，酶解后基质还原糖产率下降至25.3mg/g。这是由于随着超声波预处理时间继续增加，来自超声波的机械力作用和空化作用使大分子间的化学键断裂，生成了大量的可溶性小分子，这些小分子又可与体系

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农业工程学报2013年

中裂解下来的其他单体发生聚合反应，引起酶解反应后产生的还原糖产率明显下降。该试验表明，超声波预处理时间为40min时，酶解作用效率最佳，得到的还原糖产率最大。

图4超声波时间对酶解作用的影响Fig.4Effectofultrasonictimeonenzymolysis

2.5预处理方法对稻草秸秆基质表面特性的影响

利用电镜观察和比较预处理前后基质的形貌变化，对于判断木质纤维素材料预处理效果和分析其对酶解效率的影响具有重要作用。试验中，分别选取未处理稻草秸秆及1.0%NaOH预处理、15%H2SO4预处理和40min超声波预处理后稻草秸秆进行了电镜扫描。扫描结果如图5所示，其中图5a、5b、5c和5d分别是未处理、40min超声波、1.0%NaOH预处理、15%H2SO4预处理后的稻草秸秆电镜扫描图。

从图5中看出，预处理前的稻草秸秆基质表面形貌比较光滑，而通过40min超声波、1.0%NaOH、15%H2SO4预处理后的稻草秸秆基质表面变粗糙，基质宏观结构发生明显改变，表明基质及纤维素表面的保护层被去除，更有利于水解酶的吸附和水解作用的进行。

Fig.5

图5预处理前后稻草电镜扫描

SEMphotographsofricestrawunderdifferentpretreatmentconditions

2.6预处理前后基质的化学特性分析

试验过程中分别对预处理前后基质进行了傅里叶红外光谱（FITR）和X-射线（XRD）扫描，由此分别分析基质内基团和结晶度的改变。

图6所示为预处理前的稻草秸秆及1.0%NaOH、15%H2SO4和40min超声波预处理后稻草秸秆基质的傅里叶红外光谱分析结果。从图中可以看出，预处理前后基质的图谱基本相同，没有明显的新特征峰出现，结合SEM分析，表明稻草秸秆在经过NaOH、H2SO4及超声波预处理后没有发生衍生化作用，主要是基质结构的改变。

前后的X-射线衍射图谱。图7a为经过机械粉碎后的稻草秸秆基质的衍射图谱，与粉碎前的基质相比（结果未显示），其结晶度有一定下降，表明

机械粉碎能在一定程度上降低基质的结晶度，有利于基质的酶解作用；图7b为NaOH预处理后的基质X射线衍射图，从图中发现：NaOH预处理后基质结晶度明显降低，这是由于NaOH预处理能破坏通过氢键与纤维素和半纤维素紧密结合的木质素，因此，纤维素结晶度明显下降，易于被纤维素酶吸附降解；图7c和图7d分别表示H2SO4和超声波预处理后基质的X射线衍射图，二者在22℃左右都表现出明显的纤维素Ⅰ型特征峰，说明H2SO4和超声波预处理并没有明显破坏稻草秸秆的结晶结构，甚至引起了纤维素基质的部分重结晶，这也可能是稻草秸秆在这2种预处理方式下还原糖产率低于NaOH预处理的一个原因。

第1期王永忠等：不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响

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注：图中数值指波数。

Fig.6

图6预处理前后稻草FTIR图谱

FTIRspectraofricestrawunderdifferentpretreatmentconditions

图7预处理前后X射线衍射图

Fig.7XRDspectraofricestrawbeforeandafterpretreatment

4结论

试验表明随着预处理过程中自然堆积时间、NaOH质量分数、H2SO4质量分数的增大和超声时间的延长，预处理后稻草秸秆基质通过酶解作用得到的还原糖产率皆呈先增加后下降的趋势，其中

1.0%NaOH溶液处理后的基质酶解效率最高为126.3mg/g。结果表明，采用1.0%NaOH溶液、15%H2SO4溶液和40min超声时间等预处理能有效除去包裹在纤维素基质外表面的木质素和半纤维素，提高了纤维素酶的水解效率；但分别高于这些参数的预处理条件则易引起基质的重结晶，降低酶解糖化效率。

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Effectsofdifferentpretreatmentmethodsonenzymolysis

characteristicsofricestrawstalkinsolidstate

WangYongzhong1,2,RanYao1,2,ChenRong1,2,LiaoQiang1,2,ZhuXun1,2

(1.KeyLaboratoryofLow-gradeEnergyUtilizationTechnologiesandSystems(MinistryofEducation),ChongqingUniversity,Chongqing400030,China;2.InstituteofEngineeringThermophysics,ChongqingUniversity,Chongqing400030,China)

Abstract:Thecharacteristicsofenzymolysisofricestrawspretreatedbynaturalstacking,ultrasonicwave,NaOHsolutionandH2SO4solutionwereinvestigatedinthiswork,andthephysicalandchemicalstructuresofthesericestrawswereanalyzedbySEM,FTIRandX-ray.Asfornaturalstackingpretreatment,50gricestrawwith2-4cmlengthina1000mLbeakerwasmixedwith200mLdistilledwater,andthenthebeakerwassealedagainstwaterevaporation.Thesubstratewasfermentedbynaturalstackingat30℃anda4.0gsubstratesamplewastakenatintervalsof0,3,6,9,12drespectively,anddriedandground.AsforNaOHpretreatment,50gricestrawwith2-4cmlengthimmersedin0.5%,1.0%,2.0%,3.0%,4.0%,5.0%NaOHsolutionsatratioof1:10(g/mL)waspretreatedfor24hat30°C,respectively.Afterthat,thetreatedsubstratesampleswereindividuallywashedwithwatertobeneutral,andgroundafterdrying.Intheprocessofacidpretreatment,50gsubstrateimmersedin1%,5%,10%,15%,20%and25%H2SO4solutionsatarateof1:10(g/mL)wastreatedfor24hatroomtemperatureof30℃,respectively.Then,thetreatedsubstratesampleswereindividuallywashedwithwatertobeneutralandgroundafterdrying.Duringtheultrasonicpretreatment,thesubstrategroundedwith30meshesatsolid/liquidratioof1:15waspretreatedbyultrasonicwaveatpowerof180Wundericebathcondition.Theultrasonictimesweresetat5,10,20,30,40and60min,respectively.4.0gabovepretreatedsubstratesamplewasautoclavedforenzymaticsubstrate.Theresultsindicatethattheligninandhemicelluloseswhichwrappingoutsidethecellulosecouldberemovedunderoptimalpretreatmentmethodsandparameters,andthehydrolysisefficiencyofstrawstalkwasimproved.However,severeconditionsofpretreatmentwoulddroptheenzymaticefficiencyduetorecrystallizationofcellulose.Thepeakyieldofreducingsugarwith126.3mgpergramsubstratewasobtainedfromricestrawpretreatedby1.0%NaOHsolutionintheexperiment.

Keywords:saccharification,straw,ultrasonics,enzymolysisinsolidstate,pretreatment