・药品鉴定・ ２０１４年４Ｂ第４卷第７期 高效液相法测定母液中的３一甲基黄嘌呤的含量 刘 晖 石磊。 王麟 １．石药集团新诺威制药股份有限公司，河北栾城０５１４３０；２．河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北石家庄０５００２６ 【摘要】目的建立母液中３一甲基黄嘌呤含量的测定方法。方法采用高效液相色谱法，分析柱为ｃ ｓ色谱柱， 进行等度洗脱，流速１．ＯｍＬ／ｍｉｎ，检测波长：２７３ ｎｍ，柱温为３５￣Ｃ。结果３一甲基黄嘌呤浓度在ｌＯ０￣８００ｍｇ／Ｌ范围 内呈良好线形关系，实验有较好的精密度，其ＲＳＤ为０．２１％。平均回收率为９８．３８％，ＲＳＤ为０．２９％。结论 该检测方法操作性强、灵敏度高、准确、重复性好，可用于生产母液中３一甲基黄嘌呤的含量测定。 【关键词】高效液相色谱法；３～甲基黄嘌呤 【中图分类号】Ｒ９１７ ［文献标识码］Ｂ 【文章编号】２０９５—０６１６（２０１４）０７－１ １０－０３ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ３—．ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｕｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｕＵ Ｈｕｉ ＳＨＩ Ｌｅｆ ＷＡＮＧ Ｌｉｔ ｆ１．ＣＳＰＣ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｌｕａｎｃｈｅｎｇ ０５１４３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｂｅｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００２６，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｏｆ ３－ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ ｉｎ ｍｏｔｈｅｒ ｌｉｑｕｏｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ａ Ｍｅｒｃｋ ＲＰ－１ ８ ｃｏｌｕｍ ａｔ ３５℃．Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ５ｇ／Ｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｍｅｔｈａｎｏｌ（８０：２０，ｖ／ｖ），ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ｍＬ／ｍｉｎ ａｎｄ ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｔ ２７３ ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｉｎｅ ａｒｒａｎｇｅ ｗａｓ １００－８００ ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｉｓ ｇｏｏｄ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ ０．２１％． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ３一ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ ｗａｓ ９９．３８％ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．２９％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ． ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｅｄ ｃｈｒ０ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；３一ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ ３一甲基黄嘌呤（３一ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ；结构式 见图１）属于嘌呤类化合物，在医药工业中是合成 企业在化学合成生产３一甲基黄嘌呤过程中会 产生大量３一甲基黄嘌呤母液，母液中含有较多色 素，同时由于与３一甲基黄嘌呤结构相似、极性相近 的杂质共存于母液中，不易分离，不能使用滴定法 和紫外分光光度法进行定量分析。参阅文献［９－１３１， 嘌呤类衍生物的重要医药中间体，如ＭＲＳ １７５４和 ＤＭＰＴＸｌｌ＿ ，已酮可可碱（舒安灵）『４ｌ，也可通过其钠 盐的甲基化生产可可碱［５１、咖啡因等黄嘌呤系列产 品；同时３一甲基黄嘌呤作为一种母核，在其他领域 也有着较为广泛的应用ｌ６＿７］。 目前，全球可可碱的市场需求量约１０００吨／ 年，主要由印度和中国生产，通过３一甲基黄嘌呤甲 基化生产可可碱ｌ ８】，是国内外化学合成方法生产可 可碱的主要方式，因此作为主原料的３一甲基黄嘌 本分析方法采用液相法（外标法），利用反相色谱柱 可以快速、准确测定母液中３一甲基黄嘌呤的含量。 目前，对于从生产母液中检测３一甲基黄嘌呤 的分析方法尚未见到相关报道，故该方法具有一定 创新性 呤的成本就决定了可可碱的成本。检测母液中３一 甲基黄嘌呤含量并建立回收方法可以降低企业生 产成本，减轻环保压力。 Ｏ １ 实验部分 １．１试样与试剂 ３～甲基黄嘌呤对照品（石药集团新诺威提供， 纯度９９％）；甲醇（天津四友精细化学品公司，色谱 级）；氢氧化钠（北京化工厂，分析纯），其他试剂均 Ｎ ／＞ 为分析纯。 １ ２仪器与色谱条件 ｌ 图１ ３一甲基黄嘌呤 高效液相色谱仪（安捷伦１２００系列，包括 Ｇｌ３１４型单元泵、ＶＷＤ型可变波长检测器、７７２５ｉ 型手动进样器、安捷伦１２００系列工作站，美捷 １ １ ０中田医药斜学ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ２０１４年４月第４卷第７期 ・药品鉴定・ 司）；柱温箱（ＣＢＬ Ｍｏｄｅｌ １００型柱温箱，美国 Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司）。 进样２０ Ｌ，共取样８次，记录色谱图，其ＲＤＳ值为 １．１１％。说明待测样品在８ ｈ内稳定。 ２．５回收率实验 色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｘｔｅｎｄ ＲＰ—Ｃ 。（４．６×２５０ ｍｍ， ５ ｍ）；柱箱温度：３５℃；流动相：４．５ｇ／Ｌ；磷酸二 氢钾水溶液一甲醇＝８０：２０；检验波长：２７３ｎｍ； 进样量：２０ Ｌ。 １．３对照溶液制备 精密量取同批样品各５份（已知浓度）分别置 于２５ｍＬ容量瓶中，各个加入１２５０ｍｇ／Ｌ对照品液１、 ２、４、６、８ｍＬ，稀释定容并检测，计算平均回收率为 ９９．５２％，ＲＳＤ值为Ｏ．７９％。 ２．６样品测定 精密称量３一甲基黄嘌呤对照品５０ｍｇ至 １００ｍＬ容量瓶中，并用０．２ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液 按照样品欲处理要求进行处理后，分别吸取对 照液、样品溶液各２Ｏ Ｌ进样测定，３批样品的含量 ５ｍＬ溶解，然后用纯化水定容至标准刻度，可以得 到浓度约为５００ｍｇ／Ｌ的３一甲基黄嘌呤对照液。 １．４样品处理 由于３一甲基黄嘌呤在碱性条件下，水溶性增 加，而在酸性条件下在水中溶解度降低。所以量取 一定量的３一甲基黄嘌呤母液，调节母液的ｐＨ值在 ８．０～８．５之间，用纯化水稀释相应倍数并经０．４５ ｍ 膜滤过后备用。另外，在该ｐＨ条件下做３一甲基 黄嘌呤稳定性实验，室温放置４８ｈ后观察检测，其 质量浓度和色谱纯度没有明显变化，证明３一甲基 黄嘌呤母液在该条件下稳定并符合实验要求。 ２结果与讨论 ２．１ 色谱条件的选择 本实验选用４．５ｇ／Ｌ磷酸二氢钾水溶液一甲醇 作流动相，以４．５ｇ／Ｌ磷酸二氢钾水溶液一甲醇按 ８０：２０，６０：４０，５０：５０比例混合后进行实验。 发现当４．５ｇ／Ｌ磷酸二氢钾水溶液一甲醇＝为８０： ２０时，３一甲基黄嘌呤的分离效果理想，保留时间在 １０ｍｉｎ内。 ２．２标准曲线 准确称取３一甲基黄嘌呤对照品１００ｍｇ，置 于１００ｍＬ容量瓶中，用少量０．２ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠 溶液溶解并纯化水定容，摇匀。精密量取１．０，２．０， ３．０，４．０，５．０，６．０，７．０，８．０ｍＬ于１０ｍＬ容量瓶中， 纯化水稀释定容，各取２０ Ｌ进样测定，记录色谱 图。以溶液质量浓度（ｅ）对峰面积（Ｙ）绘制标准 曲线，得回归方程：ｙ＝２．０２２８×１ ０４ｃ＋１．４１１ ２， ｒ＝Ｏ．９９９ １，３一甲基黄嘌呤在１００～８００ｍｇ／Ｌ内 线性关系良好。 ２．３精密度实验 取１．３项下对照品溶液，每次２０ Ｌ，分别重复 进样６次，测得６个峰面积，其ＲＳＤ值为０．２１％。 ２．４稳定性实验 取相同批号的待测样品，每１ｈ取样１次，每次 结果分别为３１２０、３０７０、３１５０ｍｇ／Ｌ，其ＲＳＤ分别为 ０．２７％、０．３１％、０．２８％ ３结论 本文基本建立了采用高效液相色谱法来测定 生产母液中３一甲基黄嘌呤的含量，待测样品液虽 呈弱碱性，但基本在ｐＨ ８．５以下，属于可控范围，不 影响检测结果，由此可知样品只需简单用０．４５ ｍ 膜过滤后即可测定。但由于生产母液中杂质含量 较高，较大量进样后容易造成柱压增高，同时考虑 流动相中的盐溶液对色谱柱的影响，故采用流动 相一２０％甲醇一６０％甲醇一１００％甲醇清洗色谱 柱效果较好。 经过以上实验，可知该检测方法线性关系较 好，利用本方法测定样品中３一甲基黄嘌呤的含量， 该检测方法具有较快速、简捷、灵敏度高、重复性 好，适用于在３一甲基黄嘌呤生产及母液回收过程 中含量的测定，具有一定的工业化参考价值。 ［参考文献】 ［１】Ｍａｒｉａ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｌｏ，Ｊｏｓｅ Ｂｒｅａ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａ－ ｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ １——ａｎｄ ８－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ——３——ｆｕ－— ｒｕｒｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅｓ ａｓ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ［Ｊ］．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００９，１７：６７５５—６７６０． ［２］Ｍａ Ｄｏｎｇ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ８－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｘａｎｔｈｉｎｅｓ ｖｉａ ５， ６一ｄｉａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌｓ：Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ａ２Ａａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅ—ｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００８，４９： ４６３３－４６３５． ［３］Ｍａｒｉａ Ｉｓａｂｅｌ Ｎｉｅｔｏ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ １－ａｌｋｙｌ－８－ ｓｕｂｓｔｉ－ｔｕｔｅｄ－３一（３一ｍｅｔｈ０ｘｙｐｒｏｐｙ１）ｘａｎｔｈｉｎｅｓ ａｓ ｐｕｔａｔｉｖｅ Ａ２Ａｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ［Ｊ］．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００９， １７：３４２６—３４３２． （下转第１３３页） ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ十一医药舛等１１ １ ２０１４年４月第４卷第７期 ・临床护理・ 提高和使患儿的痛苦减少。在本研究中，采用 桡动脉采血的观察组的一次成功率为９７．Ｏ％， 明显高于采用股动脉采血的对照组的７７．０％ （Ｐ＜０．０５）；而观察组未发生误人静脉的情况，对照 组的误人静脉率为８．Ｏ％，两组比较差异具有统计学意 义（Ｐ＜Ｏ．０５）。 照组的７９．０％（Ｐ＜０．０５）；观察组的穿刺时间为 （２．８１±０．８２）ｍｉｎ，明显短于对照组的（６．０２±１．２５）ｍｉｎ （Ｐ＜０．０５ ｏ 总之，桡动脉采血较之股动脉采血时对患儿的 不良影响明显要小，具有操作方便、安全、简单、穿 刺成功率高等优点，值得推广应用。 ［参考文献】 股动脉采血部位结构相对特殊且皮肤较为疏 松，穿刺成功后很难固定，且股动脉是大血管，其压 力较高，穿刺后按压不当则容易造成血肿［９］，同时 在股动脉采血时无法再温箱内进行操作，且需要 打开患儿包被而不利于新生儿尤其是早产儿的 ［１】余景建，莫改章，莫淦开，等．桡动脉穿刺在新生儿采血 中的应用［Ｊ］．中国当代医药，２０１３，２０（１６）：１９２—１９３． ［２】王珍珍．桡动脉采血在新生儿科的临床应用［Ｊ］．中国 当代医药，２０１１，１８（３３）：１１７—１１８． ［３］张凤琴，倪小丽．新生儿两种动脉采血部位的比较『Ｊ１． 临床护理杂志，２０１０，９（６）：７５—７６． ［４］林少群，周雪霞，徐秀凤．桡动脉在新生儿采血中的应 用【Ｊ］．中外健康文摘，２０１０，９（９）：１２一ｌ３． 保暖ｆｌ０］，另外新生儿腹股沟处皱褶较多，常有胎 脂聚集，易滑且潮湿，在此处穿刺容易引起细菌繁 殖。而桡动脉采血部位在手腕处，无需将包被和 衣服松解，卷起袖管，根据解剖位置取血即可，且 能够在温箱里进行操作，另外其穿刺采血部位表 浅，容易进行固定和触及，因而不易穿刺失败而导 致出现瘀斑或血肿。在本研究中，观察组未见血肿 ［５肖定琼，曾定芳，胡秀容．不同动脉采集血气分析标本 ５】的临床比较［Ｊ］．中外健康文摘，２０１１，８（１４）：５９—６０． ［６］吴本清．新生儿危重症监护诊疗与护理［Ｍ］．北京：人 民卫生出版社，２００９：３１９． 出现，而瘀斑发生率为２．０％，对照组的血肿发生率 为７．０％，瘀斑发生率为１２．０％，两组比较差异均有 统计学意义（Ｐ＜０．０５ ｏ 股动脉由于位置较深，易激怒患儿而致其四 肢不自主活动多，因而导致操作难度大，往往需要 两人协作，对初学者不易掌握；另外由于穿刺成功 ［７】徐庆，陆蕊君，杨海燕．新生儿桡动脉穿刺抽血气的体 会［Ｊ］．全科护理，２００８，６（１１Ａ）：２８８２． ［８】许芬娟．５．５号头皮针行桡动脉采血的效果观察［Ｊ］．护 理学报，２００８，１５（６）：６９． 后难以进行固定，有时针头会从血管中滑出而致采 血失败，从而需要进行反复穿刺而导致操作时间 长且使患儿局部疼痛反应强烈。而桡动脉采血则 不受体位和操作地点的，同时采血部位表 浅，容易进行固定，可有效减少患儿躁动及哭 闹，且一人即可进行操作，简便易行。在本研 究中，观察组重度疼痛率为３０．０％，明显低于对 ［９］宋小宁，邵俊慧，王秀香．不同部位动脉采血穿刺方法的 临床应用分析［Ｊ】．中国医学创新，２０１０，７（３）：１ｌ６＿ｌ１７． ［１０】刘小群，李静．两种动脉采血方法在ＮＩＣＵ中的 应用与分析『Ｊ］．医学理论与实践，２０１３，２６（１２）： １６５９－１６６０． （收稿日期：２０１４—０１—１４） （上接第ｌ１１页） 【４】宋丽华，谢业兴．己酮可可碱的合成工艺改进［Ｊ】．山东 医药工业，２０１１，２０（５）：４． ４８－５０． 【８】李兴泰，舒瑞友，丰宇胜．３一甲基黄嘌呤二钠盐甲化 制备可可碱的新方法［Ｐ］．中国专利，ＣＮ１０１２２００３２， ２００８—０７—０６． ［５］李兴泰，舒瑞友，丰宇胜．可可碱生产方法【Ｐ］．中国专 利，ＣＮ１０１８９６４８４Ａ，２０１０—１ １－２４． ［９］王靖宇，姚尧，张颖，等．简化ＲＰ—ＨＰＬＣ法同时测定 茶碱和可可碱的含量【Ｊ］．化学世界，２０１０，５１（１）： １２一ｌ５． 【６］刘晖，刘琨，赵会娟．一种３一甲基一７一丙基黄嘌呤的 制备方法［Ｐ］．中国专利，ＣＮ１０２７１８７６４Ａ，２０１２—１０—１０． ［７］舒瑞友．丙戊茶碱的合成［Ｊ】．齐鲁药事，２００４，２３（４）： （收稿日期：２０１４—０１—０２） ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ十一玉药斜誓１ ３３
