高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化

摘要：采用不同的转化液制备大肠杆菌（Escherichia coli）JM109感受态细胞，并进行pUC18质粒的转化，考察细菌生长状态、转化液、转化的热激时间和转化后所用培养基对转化率的影响。结果表明，菌液A600 nm为0.705时采用TB转化液制备感受态细胞，在42 ℃热激45 s，转化后采用SOC培养基振荡培养，转化效率最高，可达8.59×108 CFU/μg质粒。

关键词：JM109；感受态细胞；转化效率

Preparation and Transformation Conditions for Efficient JM109 Competent Cells

Abstract： Competent cells of Escherichia coli JM109 were prepared by different transformation liquid， and pUC18 was transformed into the competent cells. The effects of different growth state of bacteria， transformation liquid， heat shock time and culture medium after heat shock on transformation efficiency were studied. The results showed that the highest transformation rate could be obtained by preparing the competent cells by TB transformation liquid when bacteria A600 nm was 0.705， heat shocked at 42 ℃ for 45 s and then culturing in SOC medium. The transformation efficiency could reach to 8.59×108 CFU/μg plasmid.

Key words： JM109； competent cell； transformation efficiency

在自然条件下很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，而人工构建的质粒载体一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移；如需将质粒载体转移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。将大肠杆菌受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、化学试剂法等）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competent cell）[1]。不同的大肠杆菌菌株制备感受态时所要求的菌体密度不同[2]，本研究利用不同的转化液将大肠杆菌（Escherichia coli）JM109菌株制备成感受态细胞，进行pUC18质粒的转化，考察热激时间和培养基对转化率的影响，优化转化条件，旨在为感受态的制备提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种和质粒 Escherichia coli JM109菌株由山东博奥克生物科技有限公司研发中心提供；pUC18质粒为该研发中心实验室保存。

1.1.2 主要试剂及仪器 KCl、NaCl、CaCl2、Pipes、MnCl2、MgCl2等试剂均为分析纯，购自Sigma公司；酵母粉、胰蛋白胨购自美国Oxoid公司。

主要仪器有高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、数显恒温水浴锅（江苏荣华仪器制造有限公司）、立式压力蒸气灭菌器（上海新诺仪器设备有限公司）、紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、超净工作台（北京德天佑科技发展有限公司）、电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团）等。1.1.3 培养基及溶液的配制 ①LB培养基。胰蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加入950 mL去离子水，用5 mol/L NaOH

调pH至7.0，定容至1 L，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。②SOB培养基。胰蛋白胨20 g、酵母提取物5 g、氯化钠0.5 g、1 mol/L氯化钾2.5 mL，加入去离子水充分溶解后定容至1 L。分成100 mL的小份，高压灭菌。培养基冷却至室温后再在每小份中加1 mL灭过菌的1 mol/L氯化镁（用0.22 μm的滤膜过滤除菌）。③SOC培养基。每100 mL SOB培养基中加2 mL灭菌的1 mol/L葡萄糖。④TB转化液。0.760 g Pipes、0.816 g CaCl2、1.660 g KCl加入去离子水230 mL，用KOH调pH至7.0后过滤除菌，4 ℃保存。⑤100 mg/mL氨苄青霉素。称取1 g氨苄青霉素，加入去离子水溶解后定容至10 mL，过滤除菌，-20 ℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌生长状态及转化液对感受态细胞转化率的影响 取-70 ℃保存的JM109菌种划线于无氨苄青霉素的LB平板，37 ℃倒置培养过夜，挑单菌落37 ℃振荡培养过夜。第2天按1%的接种量接种于LB培养基中，振荡培养至A600 nm分别为0.30±0.02、0.40±0.02、0.50±0.02、0.60±0.02、0.70±0.02、0.80±0.02、0.90±0.02、1.00±0.02时各取50 mL菌液，4 ℃、4 500 r/min离心10 min，每个处理两管，1号管加入10 mL 0.1 mol/L预冷的CaCl2溶液，2号管加入10 mL TB转化液，重悬细胞，冰浴30 min，4 ℃、4 500 r/min离心5 min收集细胞，轻轻悬浮细胞（1号管加入1 mL 0.1 mol/L预冷的含15%甘油的CaCl2溶液，2号管加入含10% DMSO的TB转化液），冰上放置几分钟即成感受态细胞悬液，分装后-70 ℃保存备用。用0.01 ng的pUC18质粒转化100 μL感受态细胞，冰上放置30 min，42 ℃热激30～90 s，再在冰上放置2 min，加入400 μL无氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，取适当菌液涂至含有氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜，2 d后观察菌落的数量。转化率（CFU/μg）=■

1.2.2 热激时间对感受态细胞转化率的影响 按“1.2.1”确定的优化方案制备

JM109感受态细胞，加入0.01 ng pUC18质粒，冰浴30 min，42 ℃分别热激15、25、35、45、55、65、75、85 s后置于冰上2 min，加入400 μL无氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，涂适量菌液至含有氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃倒置培养过夜，计数并计算转化率。

1.2.3 转化后所用的培养基对感受态细胞转化率的影响 按“1.2.2”优化的条件转化大肠杆菌感受态细胞，分别加入400 μL无氨苄青霉素的LB培养基、SOC培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，涂适量菌液至相应含有氨苄青霉素的平板培养基，37 ℃倒置培养过夜，计数并计算转化率。

2 结果与分析

2.1 细菌生长状态及转化液对感受态细胞转化率的影响

摇菌过程分别在JM109菌液的A600 nm为0.302、0.417、0.486、0.611、0.705、0.794、0.913、1.016时取样，用CaCl2和TB转化液两种方法制备感受态细胞，质粒pUC18的转化率结果见表1。由表1可知，相同的菌液浓度条件下，以TB转化液制备的JM109感受态细胞转化率远远高于以CaCl2溶液制备的感受态细胞，且转化率随菌液A600 nm的升高均呈先升高后下降的变化趋势。菌液A600 nm为0.705时采用TB转化液制成的感受态细胞转化率最高，极显著高于其他处理（P<0.01）。菌液浓度过低，大肠杆菌细胞总量很少，制成感受态细胞时接受外源DNA的能力有限，因而转化率较低；但菌液浓度过高，大肠杆菌处于生长平台后期，细胞活力下降，也会导致转化率较低。

低温（0 ℃）CaCl2溶液中，Ca2+会使细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物[3]。此时将该体系转移到

42 ℃下作短暂的热激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收[3]。Ca2+处理的感受态细胞转化率一般能达到5×106～2×107 CFU/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。如在Ca2+的基础上联合其他的金属离子（如K+、Mn2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1 000倍[4-8]，因此其他条件相同时TB转化液制得的感受态细胞转化率比CaCl2溶液制得的高许多。

2.2 热激时间对感受态细胞转化率的影响

培养JM109菌液至A600 nm约为0.7，采用TB转化液制备感受态细胞，在42 ℃分别热激15、25、35、45、55、65、75、85 s，转化率如图1所示。由图1可知，转化率先随着热激时间的延长而迅速升高，到45 s时转化率最高，为2.×108 CFU/μg，之后再延长热激时间，转化率有所降低。热激时间过短，细胞膜上出现的间隙少，不利于外源DNA进入，但热激时间过长会导致细胞死亡。

2.3 转化后所用培养基对感受态细胞转化率的影响

按优化的条件制备感受态细胞并进行质粒转化，分别在无氨苄青霉素的LB培养基和SOC培养基中培养1 h，涂适量菌液至相应含有氨苄青霉素的平板培养基，37 ℃倒置培养过夜。菌落计数和计算结果表明，LB培养基中感受态细胞转化率为4.27×108 CFU/μg，SOC培养基中感受态细胞转化率为8.59×108 CFU/μg，二者之间的差异达极显著水平。这可能是因为SOC培养基比LB培养基具有更丰富的营养，质粒转进菌体内后菌体复苏快，利于菌体生长增殖，转化率较高。

3 小结与讨论

大肠杆菌感受态细胞的转化效率受很多因素的影响，其中之一就是细菌细胞必须处于对数生长早期，由生长过度或发育不全的细菌制备的感受态细胞转化效率较低。另外一个重要的因素是Ca2+，Ca2+能与细胞膜形成复合物PHP/Ca以利于外源DNA的渗入，本实验结果表明用K+、Pipes与Ca2+按一定比例搭配使用制作感受态细胞时，其转化效率优于单纯使用Ca2+[1，2]。

大肠杆菌加热至42 ℃时短暂热刺激处理细菌细胞，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，形成间歇利于质粒DNA分子进入细胞，本实验显示热激45 s时，JM109感受态的转化效率最高。另外细菌的培养基也影响感受态的转化效率。SOC培养基中富含多种营养物质，当外源DNA导入感受态时能提供给菌体大量营养，使细菌快速生长繁殖[6]。

参考文献：

[1] SAMBROOK J， RUSSELL D W. 分子克隆实验指南[M]. 黄培堂，译. 第三版.北京：科学出版社，2002. 87-99.

[2] 涂知明，陈明洁，何光源，等.三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化[J].华中科技大学学报（自然科学版），2006，34（4）：112-115.

[3] 楼士林，杨盛昌，龙敏南，等.基因工程[M].北京：科学出版社，2002.263-2.

[4] 游雷鸣，翁海波，韩绍印，等.大肠杆菌JM109感受态形成因素分析[J].生物技术，2007，17（2）：37-40.

[5] 张岚岚，徐春燕，徐昌杰.大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素[J].细胞生物学

杂志，2004，26（4）：429-432.

[6] 杨 坤，巩振辉，李大伟. 大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立[J].北方园艺，2010（14）：127-130.

[7] 刘卫今，蒋 勇，完迪迪.简单高效的感受态细胞制备和质粒转化体系的建立[J].安徽农业科学，2008，36（7）：2745-2746.

[8] 李路饴，易建华.大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨[J].生命科学研究，1998，2（3）：44-50.