PDA TR 33 微生物测试(中文)

Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing Methods 新微生物测试方法的评估、验证和执行

Technical Report No. 33 第33号技术报告

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目录

第一部分: 新微生物方法的选择

1.0 简介. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

1.1 文件范围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 文件目的. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.3 文件结构概览. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2.0 技术概要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

2.1微生物方法类型的一般说明 . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . 2 2.2 技术审核. . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 3 2.3 基于生长的技术. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. .3

2.3.1 ATP生物发光. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ..3 2.3.2 CO2生产的色度检测. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .4 2.3.3 顶部空间压力变更的测量. . . .. . . . . . . . . . . . . .. .. . . .. .4 2.3.4阻抗. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 2.3.5 生物化学分析. . .. . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .4 2.4 基于活性的技术. . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.4.1 固相血细胞计数. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2.4.2 流式荧光细胞计. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 2.5 人工技术. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5.1 脂肪酸概要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.5.2 质谱学. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.5.3 ELISA酶联免疫吸附测定. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 7 2.5.4 荧光探针检测. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . 7 2.5.5 细菌内毒素-鲎变形细胞溶解物测试. . . . . . . . . . . . . ..7 2.6 基于核酸的技术 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ...8

2.6.1 探针. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 2.6.2 核糖型/分子型. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.6.3 聚合酶链反应. . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

3.0监管审查. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

3.1微生物测试总分类. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …10

3.1.1 加工过程中测试. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……10 3.1.2 产品测试 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …10 3.1.3 定性测试. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …..10 3.1.4 定量测试. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …….10 3.2 药典微生物测试方法参考文件. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.2.1 制药用水. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..10 3.2.2 抗菌效力测试. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …..10 3.2.3 微生物限度测试 . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . …….11 3.2.4 无菌测试. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . …11 3.2.5 环境监测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……11

3.2.6 微生物鉴定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 3.3 改变微生物测试方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.3.1 新微生物测试方法介绍的监管观点 . . . . . . . . . . . . . ..11 3.3.2 药典观点. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …12 3.4 药典变更. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …….13 3.5 新微生物方法的管理者评估. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

第二部分: 如何验证并执行新微生物测试方法

4.0 验证流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .15 4.1 设备确认模型. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

4.1.1 供应商/说明要求. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.1.1.1 测试方法选择. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 4.1.1.2 供应商选择. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 4.1.2 验证方法设计 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …18 4.1.3 安装确认 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …..18 4.1.4 运行确认. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……. 20 4.1.5 性能确认. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……. …20 4.2验证标准. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 21

4.2.1测试样品制备. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . ……. . . …….23 4.2.2 微生物方法的活性：特别注意. . . . . . . . . . . . . . . . 25

4.2.2.1 样品分布错误. . .. . . . . . . . . . . . . . . …..25 4.2.2.2 细胞形态. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 4.2.2.3 代谢活动. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 4.2.3使用推荐验证标准的方案设计. .. . . . . . . . . . . . . . .26 4.3微生物方法验证的特殊考虑. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4.3.1在实验室和公司内使用多件相同设备. . . . . . . . . . . . 29

4.3.2微生物设备的独特测试要求 . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5.0 术语. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

第一部分

新微生物测量方法的选择

1.0简介

1.1文件范围

本文件的目的是对制药、生物技术和医药设备工业为确保产品质量进行成功评估、验证和实施所需新微生物方法提供指南。这些方法的应用包括但不限于微生物限度测试、无菌测试、抗菌效力测试，洁净室和其他受控环境的微生物监测、制药用水监测，以及微生物的特性及鉴定。

这份报告的目标对象是常规微生物测试实验室中负责对使用的微生物测试方法进行验证的微生物学家。本文件应会对测试设备供应商、微生物经理和主管、验证专家、负责批准验证方案和产品放行的质量控制人员以及监管机构提供帮助。

1.2文件目标

微生物测试在制药实验室中起着越来越重要的作用。表现就是近年来各种新方法的出现，这些方法使现有方法自动化，发展利用替代标记或基于全新的技术。这些新方法在执行测试所需速度、准确度、精度和专属性方面提供了显著改善。

现在绝大多数执行的测试依赖于百年前的方法，基于使用固态或液态微生物生长介质的微生物复原和生长。在某种程度上这是真实的，因为这些方法非常有效并且在工业和临床的应用上有很长历史。但这常常受限于缓慢的微生物增长速度，微生物培养的无计划选择性及不同培养方法下的微生物固有可变性。尽管当前培养方法的，接受新的具有潜在优势的方法往往比较慢。我们认为部分原因在于缺少证明此方法与监管机构接受的当前方法等效和新方法设备验证的清晰指南。这份技术报告的目的是对新的微生物方法的评估、验证和实施提供指南。

化学方法的验证有很多指南。例如USP一般信息章节<1225>中药典方法验证（1）和ICH最近公布的分析方法验证（2）。这些文件为证明新的分析化学方法与现行方法具有等效性提供了具体说明。相反，事实上并没有公布专门用于微生物测试的指南。可能的例外是ASM Cumitech公布的临床微生物实验室中程序的确认和验证（3），说明了病原体的隔离和鉴定，抗菌敏感性测试，以及新的USP一般信息章节<1227>从药典物品复原微生物的验证(4)。然而仍需要更多的指南，因为微生物测量方法与化学分析有本质区别。没有统一的证明标准会对这些方法的实施形成严重的阻碍。

当有使现行微生物测量方法样品处理、结果读取或数据管理自动化，或使测试程序小型化的仪器时，使用化学分析指南不难证明替代方法具有等效性。因为测试基本相同。类似地，当新技术持续依靠微生物成长测定时（例如，阻抗，ATP生物发光或其它微生物培养基上新陈代谢的变化），可轻易证明等效性。然而，当新方法依据新技术，而与现行方法无直接关联时（比如，通过DNA扩增而不是生化反应模式进行微生物鉴定，或对用荧光标记的细菌细胞而不是琼脂平板上的菌落形成单位进行计数），则等效性证明可能需要验证原则的新应用，尽管此方法提供了更高质量的结果。

新技术的应用可通过膜过滤法替代最大数(MPN)-多管发酵来对水中大肠菌群计数，以及从使用单形态特性到生理和生化特征再变化到DNA方法来进行细菌鉴定。例如，通过激光扫描膜来对单个、活性、荧光标记的微生物细胞进行计数的能力应优于菌落形成单位的计数。微生物中包含的核酸是该物种特有的，即基因型鉴定，因此优于当前鉴定细菌的生化反应模式，即表型鉴定。

此文件由测试制造商，药品和医疗设备行业，标准组织和监管机构的代表共同编写。目的是在监管的环境下对引入新微生物法提供一个通用的方法。期望通过提供统一的性能标准能大大加速优异方法的开发、证明和执行。

1.3文件结构概要

此文件是为了建立工业范围内的标准。标准中包括什么是可接受的微生物测试及如何证明其达到监管机构的要求。

这份文件主要分为两个主要部分。在方法选择部分，微生物测试方法审核之后有这些测试的药典应用概述，最后包括监管机构认可及经济效益评估要求的讨论。在验证部分，确定了验证和等效性证明的标准，并描述了验证方法和文件记录的方法。最后，决策图表，常用术语词汇和目录为整个工艺提供了概述。

2.0技术概述

2.1微生物方法类型的一般描述

从功能来看，微生物测试方法可以分成三种：1）检测测试样品中是否存在微生物，2）统计测试样品中的微生物，3）对测试样品或纯培养基中的微生物进行特征描述和鉴定。

存在与否测试可用于检测微生物的不同种类，如用于无菌测试方法，或可用于检测特殊微生物的种类或者属类，如药典指示生物的测试。美国药典、欧洲药典和日本药典拥有相同的指示生物种属，即大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌类。

通过传统微生物技术的不同统计方法测试样品而获取的结果可能随测试条件的不同，其结果可能有很大的不同，比如，培养基类型和繁殖温度，条件和持续时间。

一个例子是对低营养培养基的水样本进行平板计数得到的区别，例如在常温下经过5到7天培养的R2A琼脂与在30到35度条件下经过48小时培养的胰酶大豆琼脂进行对比。统计结果的明显区别也可以从非生长的直接检测方法与传统方法的对比中看到。前者因为微生物培养基的次优培养条件而具有更高的统计数。

通常会使用多种微生物特征描述和鉴定的测试方法，从传统革兰氏染色和简单的用于与细菌细胞相关的特定酶的手动测试，如过氧化氢酶和细胞色素氧化酶，到利用选择性/不同生长介质中微生物菌落外形的药典方法，到半自动生化特征分析系统，及基于特定核酸序列或者细胞膜脂肪酸成分检测的方法。

这些测试方法在成本、使用方便与否、持续时间及分析参数得到的性能，如专属性、敏感性、再现性和耐用性方面存在很大差异。

2.2技术审核

如上文所述，先前的微生物学专家巴斯德，科赫，李斯特及很多其他专家开发的已使用上百年的方法是当前药典微生物测试方法的技术基础。这种方法以提供的条件为基础，允许测试样本中微生物细胞的生长和繁殖并允许检测，通常为目检平板或营养液。具体药典测试将在文后的监管审查章节进行讨论，所以本节的重点将是新技术。

微生物质量保证测试的新技术是一个快速发展的新领域。工作组已经开始尝试所有当前应用于制药生产中的技术。然而，一种技术的排除或者应用是无意的，并不意味着该技术不合适。此审核仅是当时的最佳可用信息。毋庸置疑，在这份文件有效期内将有更大的发展，也就意味着新技术或者当前技术新的应用会进入市场。为了方便，该技术分为1）基于生长的技术，2）基于活性的技术，3）分子成分或人工技术和4）基于核酸的技术。

代表供应商（见图1，2，3和4）参考仅是工作组编写的例子，并不代表工作组或PDA的商业认可。

2.3基于生长的技术

这些方法基于能反映微生物生长的生物化学或生理学参数的测量。

2.3.1 ATP生物发光

三磷酸腺苷（ATP）的存在是细胞活性最明显的标记。所有细胞都以ATP的形式储存能量。细胞数量的增加会导致ATP水平的增加。ATP生物发光利用测量萤火虫发光的荧光素酶反应来检测是否存在ATP。通过测量培养后ATP水平的增加来确定样品中是否存在微生物污染。ATP生物发光法可减少测试时间，大约是传统方法的三分之一。因为这是更灵敏的端点检测系统，使用敏感的化学品和仪器而不是依靠人的眼睛。这表明使用的原理相同，即微生物的繁殖，但检测需要的复制数量大大减少了：每毫升103个细胞，传统方法为107或更多，以确定板上的浊度或菌落数。

2.3.2 CO2生产的色度检测

测试样品置于培养瓶中用于监测。培养、搅拌并监测这些样品来确定是否存在微生物。这些系统对有机物生长产出的CO2进行色度检测。有些系统将检测颜色变更、标记阳性样品并提醒使用者。这些系统通常认为是非侵害性的检测系统，并能容纳大量样品。虽然此方法通常用于临床中的血液培养，但也可用于无菌测试。

2.3.3顶部空间压力变更的测量

这些系统基于微生物培养基的非侵害性、持续、自动监测。电子传感器用于检测每个培养瓶顶部空间的阳性或阴性压力变更。这些变化由微生物生长引起。如果检测到生产和/或消耗大量气体，样品则为阳性。大量样品可置于这些仪器中进行测试，并定期监测顶部空间的压力。虽然此方法通常用于临床中的血液培养，但也可用于无菌测试。

2.3.4阻抗

阻抗通过电测法测量微生物活性。这些仪器测量生长介质中细菌繁殖产生的离子变化。阻抗检测时间与最初接种时的微生物数量成反比。细菌使低电荷的大分子发生新陈代谢作用，产生更小的高电荷副产品。例如，低电荷的大分子，如蛋白质，水解为许多高电

荷的氨基酸类。两个电极用于测量肉汤或琼脂培养液中的离子变化。

2.3.5生物化学分析

纯培养液中的微生物细胞悬液用一系列的生物化学培养基测试。微生物与这些生化药剂有特殊的反应，如碳水化合物的利用。通过将生物化学结果与相应的结果数据库进行比较，可以鉴定测试中的有机物。许多方法可以手动执行并记录。高容量的自动仪器也同样用于记录微小培养基，并通过数据库中反应类型来鉴定微生物。

Table 1:基于生长的微生物方法 技术 代表性商业产品 主要应用 ATP生物发光 SteriScreen and MicroStar Raw material & product screening, water Rapid Microbiology and monitoring, pre-sterile filtration bioburden monitoring (E) Sterility testing (P) 原料&MicroCount Digital Systems 水监测，无菌前过滤生物负荷监(Millipore Corp, Bedford, 产品删选，MA & RapiScreen (Celsis, 测，无菌测试 Evanston, IL) SteriScreen和MicroStar快速微生物学和MicroCount数字系统 二氧化碳生产的顶部压Bact/Alert Sterility testing (P) (Organon-Teknika, Durham, 力色度检测 无菌测试 NC) & ESP Microbial Detection System (AccuMed International, Detroit, MI) Bact/Alert和ESP微生物检测系统 生物化学&生理反应 API Systems (bioMerieux, Microbial identification (I) Hazelwood, MO), BIOLOG 微生物鉴定 Systems (Biolog, San Diego, CA) & VITEK System (bioMerieux, Hazelwood, MO) 原料药系统，BIOLOG系统和VITEK系统 阻抗/电导率 Bactometer (bioMerieux, Bioburden monitoring, antimicrobial Hazelwood, MO) & Malthus effectiveness testing (E) Microbial Detection System 生物负荷监测，抗菌剂有效性测试 (Malthus Diagnostics North Ridgeville, OH) Bactometer和Malthus微生物检测系统 螺旋电镀系统（螺旋生物Bioburden monitoring (E) 螺旋电镀 技术，贝塞斯达，MD） 生物负荷测试

疏水网栅膜过滤法 Iso-Grid（QA生命科学，圣Bioburden monitoring (E) Pathogen monitoring (E) 地亚哥，CA） 生物负荷监测，病原监测 常规 Bioburden monitoring, water monitoring, antimicrobial effectiveness testing (E) 生物负荷监测，水监测，抗菌剂有效性测试 Bioburden monitoring, water monitoring, D-Value analysis (E) 生物负荷监测，水监测，D值分析 Bioburden monitoring (E) Sterility testing (P), Water monitoring (E) 生物负荷监测，无菌测试，水监测 倾注培养法 Most Probable Number 常规 Multiple - Tube Method 最近似值复式管方法 膜过滤法 常规 2.4基于活性的技术 2.4.1固相血细胞计数

在用通用的活性培养基对捕获的细胞进行标记前，固相血细胞计数法利用膜过滤从可过滤样品中分离潜在微生物污染物。当处于代谢的活性微生物细胞质中，非荧光培养基通过水解脂酶释放出自由荧光染料。仅具有膜完整性的活性微生物可在分析中保存标记。激光探测仪自动扫描过滤器，立即报告荧光标记的细胞数。

因为此方法不需要细胞增殖，对单细胞水平的敏感性于过滤量，且可能适用于所有微生物细胞包括孢子，以及热应细胞和不易生长的生物。与基于生长的程序相比由于使用了更加敏感的终点检测机制，大量活性微生物可得到近即时处理的结果。

2.4.2流式荧光细胞计

除了可滤过产品，此方法已应用于不可过滤的产品，通过将相似的贴标化学物应用到高敏感度的流式细胞仪。

Table 2:基于活性的微生物方法 技术 代表性商业产品 主要应用 Direct Epifluorescent Filter Microscopy 直接荧光过滤显微镜术 Direct Epifluorescent Filter Technique (DEFT) Automate Counting System (Micro-Measurements, Saffron Walden, Essex, United Kingdom) 直接荧光过滤技术（DEFT）自动计数系统 Bioburden monitoring (E) 生物负荷监测

Membrane Laser Scanning Fluorescence Cytometry 膜激光扫描荧光细胞计数 荧光流式细胞计数 Scan RDI (Chemunex, Monmouth Junction, NJ) (E) 水监测，生物负荷监测，环境监测 Sterility testing (P) DCount (Chemunex, Monmouth Junction, NJ) D值计数 (E) 生物负荷监测

2.5人工技术 2.5.1脂肪酸概要

高分辨率气相色谱仪进行的脂肪分析可确定未知分离株的脂肪酸成分。之后搜索数据库和已知的分离株匹配。细胞脂肪酸组分稳定并被保存。由于细菌中存在大量脂肪酸及分类群中脂肪酸组分的可重复性，才能使用此技术。样品在置于气相色谱和脂肪酸甲基酯（FAMEs）之前进行皂化、甲基化并人工提取。

2.5.2质谱学

基质辅助激光解吸离子化 - 飞行时间（MALDI-TOF）质谱法可用于快速鉴定微生物细胞并提供完整特性。不同的微生物可产生不同电荷的分子量模式或分子量谱，可以用来鉴定生物属种及某些情况下的菌株。

2.5.3 ELISA 酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种用于证明是否存在抗体或抗原的标记技术。该方法依赖于使用可耦合到酶的免疫试剂。需要对自由和束缚结合物进行分离才能得到结果。进行ELISA有几个部分：固相载体是必要的，用于分离束缚和自由结合物；酶用于结合物中，标记到抗原或抗体上；底物用于检测最终产品。

2.5.4荧光探针检测

荧光探针设计绑在具体的目标点上或细胞内，例如，抗体或核酸，并含有一个当受到能量源比如相干光（激光）刺激时能发光的分子。

2.5.5细菌内毒素-鲎变形细胞溶解物测试

美国鲎血细胞的溶解物。鲎有一个很敏感的凝血系统，此系统由革兰氏阴性菌细胞内的脂多糖触发。该测试代替了兔子热原检测法，其也是一个替代检测方法成为药典检测方法的例证。

Table 3:人工微生物方法 Technology 技术 Representative Commercial Principal Applications Products 代表性商用产品 主要应用

Fatty Acid Profiles 脂肪酸剖面图 Sherlock Microbial Identification System (MIDI, Newark, DE) Sherlock微生物鉴定系统（MIDI、 Microbial identification (I)微生物鉴定 MALDI-TOF Mass Spectrometry 电离飞行时间质谱 Kratos Analytical Systems (Manchester, UK) PerSeptive Biosystems Voyager – DE (Framingham, MA) Kratos分析系统（曼彻斯特、UK）PerSeptive生物系统-DE（费雷明翰、MA） Microbial identification (I)微生物鉴定 Fluorescence Antibody RBD-2000 (Advanced Analytical Technologies, Ames, Techniques IA)PBD-2000(高级分析技术、埃姆荧光抗体技术 Pathogen monitoring (P, E & I)病原体监测(P、E&I) Enzyme-linked Immunosorbent Assay 相关酶的免疫吸收剂检测 VIDAS & Mini-VIDAS ELISA Systems (bioMerieux, Hazelwood, MO), Tecra - Salmonella ELISA (International BioProducts, Redmond, WA), Salmo- nella-Tek ELISA (Organon-Teknika, Durham, NC)VIDAS和微型-VIDAS系统（生物梅里埃, 黑泽尔伍德, MO）、国际生Pathogen monitoring (I)病原体监测(1) Latex Agglutination 乳胶凝集 Bactigen Salmonella-Shigella Test (Wampole Laboratories, Cranbury, NJ) Pathogen monitoring (P & E)病原体监测（P&E） Limulus Amebocyte Lysate-Endotoxin Assay鲎变形细胞内毒素溶解分析 Pyrogen monitoring (P & Pyrogent Gel Clot (BioWhittaker, E)热原监测（P&E） Walkerville, MN) & Pyrotell (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA)Bactigen沙门氏菌属-志贺氏菌属测试(Wampole实验室、热原冻胶凝块(BioWhittaker, Walkerville, MN)和Pyrotell (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) Conventional 常规 Differentiates bacteria by Gram reaction (I)通过革兰氏反应来区分细菌（1） Gram’s Stain格兰氏染色

2.6基于核酸的技术 2.6.1 DNA探针

专门为目标生物检测而设计的DNA杂交实验使用固相载体设备通过一种酶进行杂交化学和色度检测。相关步骤包括样品溶解、杂交、杂交捕获、酶、彩色胶片显影和检测。

2.6.2核糖型/分子型

此项技术使用细菌基因组的核酸性片段来描述生物特征并最终鉴定。不同大小的DNA性片段与核糖体RNA探针杂混。使用化学发光的培养基。摄像机把发冷光的DNA片段转换成数字信息。获取该数字信号并摘取数字。然后生成模型。该模型可与已知细菌分离物的数据库模型相比较。核糖体是提供明确分类信息和物种辩别的一个稳定流行病学标记物。

2.6.3聚合酶链反应

聚合酶链反应的目标是受高度保护的DNA特定片段，因此比较稳定。这为生物的存在提供了高度可靠的指标。PCR通过把样品DNA与聚合酶、核苷酸和既定核苷酸系列所特定的引物相结合来很快(2-3小时)提供数百万的该特定片段复制品。

将混合物放入加热循环仪中经过多次循环加热和冷却。通过加热使DNA变成了单股。冷却时，引物退火到DNA序列。聚合酶用核苷酸延伸引物。这些步骤在一次循环中产生目标片断的两个复制品。改变性质，退火和延伸的重复循环允许有目标DNA片段的成倍产生。如果样品中不存在目标序列，则不会发生扩增。PCR产品的电脉疗法通常用于检测特殊片段的存在。PCR技术允许比传统方法更快、更敏感、更精确的检测。

Table 4:基于核酸的微生物法 技术 代表性商业产品 主要应用 Nucleic Acid Probe 核酸探针 Gene-Trak System (Gene-Trak Systems, Pathogen monitoring (P) 病原监测 Hopkinton, MA) & Gene-Probe System, (Gene-Probe, San Diego, CA) Gene-Trak系统和基因探针系统 BAX ® Microbial Identification System Pathogen monitoring (P) 病原监测 (Qualicon, Wilmington, DE) Probelia System (BioControl Systems, Bellevue, WA) 微生物鉴定系统 MicroSeq. 16S rDNA Bacterial Microbial identification Identification System (PE Applied (I) 微生物鉴定 Biosystems,Foster City, CA) 16S rDNA 细菌鉴定系统 RiboPrinter ® System (Qualicon, DNA Fingerprinting for Wilmington, DE) microbial characterization & identification (I) Polymerase Chain Reaction – DNA Amplification 聚合酶链反应- DNA扩增 16S rRNA Sequencing Techniques Automated Riboprinting

3.0监管审查

3.1 微生物测试的总分类

微生物测试实验室会进行一系列微生物测试，根据测试对最终药品和目标给药途径的的关键性，监管要求有所区别。此类测试可分为：

3.1.1加工过程中测试

大多数过程中测试是为了确保组分、环境、设备和加工步骤来控制微生物污染的充分性。通常要求用这些测试来证明与现行良好生产规范（cGMP）的相符性。基于新技术的微生物测试变化进行科学评估。然而，不太可能执行此评估，除非在产品申请文件中提交了改变更。过程中监测使用的许多微生物测试方法并不包括在原始产品申请文件中，使用新方法时，将不会提交这些方法的变更。建议将新微生物技术的变更归为产品申请文件的变更。应注意大多数中控微生物测试是定量的。

评估测试数据时，方法一致时对比才有效。然而，这不应妨碍新技术作为旧方法的替代方法。在测试方法验证期间，一段时间的方法对比可能运行用新微生物方法代替旧方法。可能需要建立新的验收标准，如基于活性的计数可能比膜过滤方法有更高的回收率。

3.1.2 产品测试

微生物测试用于产品放行，也是稳定性方案的一部分。

这些测试可能提供定性或定量的结果，用于不同目的，如证明产品中无目标微生物或符合微生物限度。

3.1.3 定性测试

产品放行微生物测试通常为定性的，用来评估符合已建立验收标准的限度。定性测试的新旧技术对比是根据检测品质属性的测试能力。例如无菌试验评估品质属性时可能会损失定量结果来提高测试的敏感度。

3.2 药典微生物测试法参考文件 3.2.1 制药用水

用于测试的水的类型、方法和说明都列在美国药典信息章节<1231>制药用水中。美国药典（USP）参考水和废水检查的标准方法，(APHA)第20版，1996中具体测试方法。在欧洲药典2000附录中将由两篇关于水的专著。一篇是关于注射用水的，细分为散装注射用水和无菌注射用水。第二篇专著是关于纯化水的。同样分为两部分：散装纯化水和容器装纯化水。对于微生物检查（若相关），规定胰酶大豆琼脂，而不是R2A或平板计数琼脂。

3.2.2 抗菌效力测试

抗菌防腐剂为添加到多用途产品中的物质，防止在产品使用（后生产）过程中产生微生物污染。抗菌效力测试用于证明任何添加的抗菌防腐剂的有效性。药典参考文件包括：USP 24 章节<51>，抗菌效力测试，日本药典XIII总说明3，防腐剂效力测试和欧洲药典第三版，生物测试，5.1.3 抗菌储存的效力。

3.2.3 微生物限度测试

微生物限度测试及原料、赋形剂（非活性药物成分）、原料药（活性药物成分）和药品的微生物质量标准的建议在纲要中确立时间已超过30年。这些测试列在USP24章<61>微生物限度测试，欧洲药典第三版，微生物测试2.6.12和2.6.13不需要符合无菌测试的产品微生物污染（活性微生物总数2.6.12，指定微生物测试2.6.13）和JP XIII 30 微生物限度测试中。

3.2.4 无菌测试

无菌测试可用于确定原料药、剂型或其他药典物件无菌，符合药典方法中的规定。满意的结果仅表明测试条件下检查的样品中无可污染的有机物。因此，结果是采用的取样计划有效性的应变量。药典中关于无菌测试的参考文件包括：USP 24章节<71>无菌测试，欧洲药典第三版，微生物测试2.6.1 无菌性和JP XIII 45 无菌测试。

3.2.5 环境监测

用于无菌药品生产设施的空气、表面和人员的微生物监测在USP 24 信息章节<1116>洁净室和其他受控环境的微生物评估和PDA技术报告No. 13 微生物环境监测方案原理中有所讨论。文件也包含微生物监测方案的设计和执行，建议了监测频率和微生物验收标准。

3.2.6 微生物鉴定

微生物的药典鉴定方法在微生物限度测试章节有描述（见微生物限度测试参考文件）。

3.3 改变微生物测试方法

3.3.1 新微生物测试方法介绍的监管观点

FDA的生物制剂评估和研究中心（CBER），药品评估和研究中心（CDER）和设备和放射卫生中心（CDRH）不批准测试方法，但批准将新药或添加剂应用于现有产品的文件。这些应用的重要部分包括建立产品、组分和工艺的分析程序和验收限度。在新药申请（NDA）或简化新药申请（ANDA）中，微生物测试的药典方法通常列在药典测试章节，可参考此指南的3.2章。

监管分析程序是申请人提议的测试方法，已被FDA用于评估原料药或药品的已确定特征。美国药典/国家处方（USP/NF）中的分析程序经美国联邦食品药品化妆品法案第501部分法律认可，已作为专著的监管分析程序。药品申请可能包括已批准监管程序的备选程序，用于测试原料药和药品。然而，监管分析程序仅用于确定是否符合法案。某种产品申请使用的测试方法不一定适用于另一种产品的测试。

规范是已批准申请中的质量标准（即测试，分析程序和验收标准），用来确认原料药、药品、中间产品、原料药、试剂和其他成分的质量，包括容器和密封系统和中间产品。

验收标准为数值限度，范围或其他的标准。除非法规或指南另有规定，所有已批准申请中的规范变更必须提交一个已获批准的产品文件的补充。除非法规或指南另有规定，这些同样适用于与产品环境监测（如颗粒和/或微生物的环境监测）相关的规范建议同样包括在NDA和ANDA提交文件中。

改变产品或成分的监管微生物测试，需要提交文件说明药品的测试和验收限度及证明测试合适性的信息。新方法合适性的理论和实践证明都是验证新方法的一部分。USP信息章节<1225>药典方法的验证中包含验证标准。信息章节包含描述验证参数的章节：准确度、精度、专属性、检测限度、定量限度、线性和范围。关于新的微生物测试方法中参数应用的更详细讨论，参见此文件的第二部分。在数据统计方面给予帮助的是美国

测试和材料协会（ASTM）的对比测试方法的标准规范D 4855及USP总信息章节<1010>分析数据的草案 - 说明和处理。

建立已批准药品申请的新监管方法，需要在使用此方法前提交药品补充文件进行批准。若使用药典方法中的替代分析方法，不需要FDA预先批准，在年度报告（21 CFR 314.70.d）中申请文件可能包括该部分信息。然而，需要验证报告来证明替代方法等同于监管或药典测试方法。生产现场需有此验证报告，用于法规审查者的检查。虽然可能会使用备选分析方法，药品的官方认可的分析测试法（仲裁法）仍然为监管方法。结果有争议时，监管方法起决定性作用。

使用新的微生物测试方法时，仪器厂商最好编写药品主文件（类型5），药厂最好在已选择药品申请的补充文件中提交使用方法的验证文件。这样FDA会对此方法进行正式审核。补充的NDA经批准后，公司可能与FDA讨论在其他NDA的附录或年度报告中提交类似变更的可选方法。

3.3.2 药典角度

USP的立场如下：USP 24总述表明备选方法可能用于确定产品是否符合药典标准，在准确度、敏感度、精度、选择性、对自动化或计算机数据整理的适应性或任何其他特殊情况方面有优点。应验证这些备选或自动方法；然而，出现争议时，药典方法有决定权，因为这是官方或仲裁测试。此外，USP 章节<61>微生物限度测试说明只要经过验证并给出同等或更好的结果，自动方法可替代使用，而USP章节<71>无菌测试说明只要备选程序得到的结果至少有同等的可靠性，就可用于证明物件的无菌性。

虽然联邦法规（CFR）规定了执行特定微生物测试的详细方法，但CFR也认为等效方法是可接受的（见21 CFR 610.9）。同样，各种指南文件也规定了各种测试的具体程序，但这些并不说明所有测试条件，所有这些文件并不是约束。国际协调会议指南（ICH），Q6A中有如下定义：备选程序为可用于测试属性的程序，它可将原料药或药品的质量控制为类似或优于法定程序的程度。管理者将根据测试的产品评估测试方法，并根据方法的合适性来评估特定属性。

其他药典要求是什么？欧洲药典总述分析和测试说明：描述的分析和测试为药典标准所依据的监管方法。如果已知任何分析或测试中使用的方法将得到等效结果，分析员不排除使用备选方法。出现疑惑惑争议时，仅药典分析方法具有权威性。同样，JP总述说明：日本药典中的测试方法可由有更好准确度和精度的备选方法代替。然而，出现分歧时，仅此药典中程序得到的结果有最终决定权。

JP总信息章节，分析程序的验证强调限度测试仅需要评估测试的专属性和检测限度，如确定产品中是否存在微生物。

其他有用的文件包括分析方法验证的ICH指南和确定测试方法精度的ISO指南。

3.4药典变更

美国药典由FDA认可作为法定纲领。USP标准用于确定药品的均一性、效价、质量和

纯度。USP的“总章节”部分包括测试和分析的要求，编号为<1> 到<999>。当前测试或新测试方案中的任何变更必须先作为药典预审，作为药典论坛（PF）和USP标准确定和修订期刊的注释。文章包括所有支持数据在PF发表前都由USP修订委员会的微生物小组审核。最后，文章的所有注释都发送给小组委员会与作者。根据需要，修订后的文章在作为现行USP附录前可作为加工过程中修订来发表，可进一步注释。除了在PF发表外，任何当事人可要求USP举行公开会议讨论新微生物方法。

在欧洲，修订方案由第一专家组准备。草案发表在欧洲药典上，此时修订过程已开始。文件由专家组接受，修订后发送给正式采用此新专著的药典委员会。国际协调会议日程中的方案必须在PF、JP论坛和欧洲药典上同时发表。

3.5 新微生物测试方法的管理者评估

特定测试与方法和验收标准一起提交在产品申请文件中。可能提交使用新技术的方法来作为应用的变更，将与产品联系起来科学地评估这些方法。科学期刊中描述的新方法可能由这些刊物的参考文件来支持其应用。同行审查期刊中未描述的技术可能需要更详细的讨论，且数据需提交到应用文件中。

新测试方法的提交文件应描述将测试的属性，并对比测试的新旧方法。申请人应验证方法，证明此方法等效于或比已批准申请中使用的方法更好。最后，新微生物方法必须可评估特殊的产品属性，如无菌性，微生物限度或不存在目标有机物。

应以科学研究的常用形式确立并测试用于确定新微生物测试方法是否等效于或比当前使用的方法更好的标准。这些研究应对比新旧方法，包括实验的已确定验收标准（测试假设情况）。试验控制应证明测试的准确度和精度。应提交并讨论数据，表明产品测试方法的适当性。研究结果应以类似于科学期刊文章或注释的格式提供。增加的准确度或精度可能足够说明改变方法的原因。监管科学家尤其希望减少假阴性结果。

第二部分：如何验证并执行新的微生物测试方法

4.0 验证流程

验证在1987年5月(14)的关于工艺验证总体原则的FDA指南中定义如下：确立记录的证据，提供高度保证，即特定工艺将不断地生产出符合预定规格和质量属性的产品。

任何验证定义的两个关键部分是特定产品或工艺的适当性（执行既定目标）和可重复性（继续执行）.

因此，对于一个新的测试方法，重要的是能证明既定分析应用中所使用方法的适当性，且有在线程序说明工艺在随后的时间继续执行相同质量标准。

验证应不只是对新方法或产品所进行的一个研究。相反，它应包括整个工艺，从决定开始到变更微生物测试项目的一些方面并通过连续常规时间继续验证。因此，验证开始时，设计的验证计划包括需要执行新测试方法的每个工艺阶段。该方法的采用目的是通过确保工艺中的每个阶段是经过深思熟虑且在进入下一阶段前进行记录，以加速引入新方法

并提高其效率。

用到该工艺中的一个有用工具是设备确认模型。

4.1 设备确认模型

最初，模型用在计算机化工艺控制中，且之后用于分析仪表。它是能用于完整系统验证的一个有用构架，即新测试方法的所有组件包括仪表、软件、固件和化学试剂。它指导评估人员评估与决策相关的工艺步骤和执行新测试所需的实用工作。

分析方法验证包括设备确认模型的3个部分，即安装，运行和性能确认。可能使用两个其他部分，即说明和设计确认，但通常是制药生产的大规模工艺设备所采用的，因此这里不作考虑。然而，值得考虑的是，验证开始前，已经提供足够的测试方法说明并设计

有相关的验证计划。

把验证工艺分成五个部分，如下所述，以使工艺变得更易实现，因为每个部分指定有特定活动。每个部分的活动不需按序列执行；平行活动可发生。例如，每个活动派生出来的数据可应用于另一个活动的计划和文件中。重要的是注意，个别部分已指定应用到工作组成员一直同意的新微生物测试系统的验证中，且可能与先前碰到的定义不同。

注：个别公司可能不同地选择指定与其公司内部和程序一致的验证工艺，并满足整个验证需求，仍实现相同结果。

方法/供应商需求

指定供应商和测试方法说明作为预验证活动的部分。

验证计划设计

设计和记录计划目标，方法和验收标准。

注：这可能用作验证方案范围内的一个执行报告总结。

(IQ) 安装确认

证明和记录系统已按相关实验室环境指定提供和安装。

注：IQ是仪表特定的，如果设备从实验室内移动或移到另一个厂区，部分需要重复进行。

(OQ) 运行确认

证明和记录系统，即方法和仪表，在所选环境中根据药典选择生物。

(PQ) 性能确认

证明和记录系统按照所选加工生物和用于产品批常规测试的环境分离物所指定的执行。

4.1.1供应商/说明书需求

决定改善微生物测试项目的一些方面时，开始选择方法/供应商。目的是考虑所有有关信息和变更测试方法的所有后果。从这一考虑得出综合说明，新方法应能实现什么，对

提供新测试系统的供应商有什么要求。

做出采购仪表这一最终决定前考虑经济和规章方面的因素。

经济因素可能包括：

新方法的单元测试成本是否与当前测试方法成本差不多？注：考虑这一决定时记得考虑所有的变数，例如，新测试方法可能降低测试次数，减少取样/介质制备需求，减少对微生物介质的生长测试需要，提供读取，记录和分析数据的效率等。

组织是否能利用减少的测试周期时间来减少产品放行周期时间？微生物测试是否是限速步骤？

对设备，方法开发和新微生物测试方法的投资在测试成本，减少的产品故障，产品放行周期和减少的存货成本上有何回报？

测试仪表PC或LIMS界面是否将减少产品放行周期时间，改善数据管理和测试结果趋势？

监管问题可能包括：

新测试方法的提交申报要求是什么？例如，该测试方法是否详述在监管文档或一般提及，以便在年度报告中可能用替代方法代替药典测试。

新测试方法是否需要证明根据当前药典规定的测试方法的参照测试数据？

微生物测试方法如此新，是否需要作为一个新方法而不是作为替代方法来验证？

新方法是否证明已提高精确度，准确度和可选择性？如果这样，管理人可能更方便审核新测试方法。

微生物测试方法如此新，是否谨慎对新测试方法申请NDA补充，尽管在年度报告中它可能被列为一个替代方法？

该技术是否足够广泛被理解，以便法规审核人员将其视为一个新微生物测试方法接受?

4.1.1.1测试方法的选择

在该阶段，根据下列因素选择候选的测试方法：（注：这些因素可能不适用于某些方法，例如，微生物特性和鉴定）

样品数量和类型

测试哪种品类型的样品且每班测试多少样品？新测试方法一旦实施，是否能扩展测试工艺中的其他样品类型？样品可能基于价值或体积进行选择，即新测试方法的实施可能仅能根据特殊产品或单独产品组的快速放行来证明。

敏感性（检测限度）

所需的敏感度等级是什么？这取决于您试图替代的当前测试方法说明，例如，平板计数方法的检测限度可能<10 cfu per mL。新方法是否有一个较低的检测限度？这是一个好的还是坏的属性？

专属性（有机体检测）

新测试方法需要检测或鉴定何种有机体？这应取决于从当前测试方法生成的历史数据并由新方法的供应商提供的信息进行补充。

参照的测试数据

能证明参照的测试数据的重要性如何？如果新测试方法建立在新的，更敏感技术基础上，那么验证研究和验收标准将需要设计以反映该方法，另一方面，如果新方法是根据容易证明参照数据的技术，那么该报告的4.2.3部分的验证研究和验收标准可使用。

操作员确认程度

新测试方法的复杂度如何？需要何种技术等级来运行一个分析试验且说明结果？实验室人员是否受正规的教育背景？他们现在是否需要分析化学，核酸生物化学和计算机技巧方面的背景？

数据管理能力

新仪表是否需要具有LIMS界面的功能？哪种数据管理工具是理想的或需要？需要软件验证证据和功能测试报告来支持软件和固件功能的每个部分。

4.1.1.2供应商选择

一旦确定候选测试方法，将对潜在供应商进行考察以确保其是合适的仪表和测试试剂的长期供应商。考虑因素包括：

质量保证程序和标准

潜在供应商是否要有商业运作所需的质量保证证明？供应商采用哪种质量保证标准，例如ISO 9000等，来管理其产品，工艺和程序，例如，变更控制程序。供应商是否已通过管理机构或使用新测试方法的制药公司审计。

经济可行性

潜在供应商是否切实经济可行且适合长期商务合作？ 参考

现有的哪些参考为新测试方法提供可信度？例如，一份广泛的当前用户列表，参考的科学出版物或第三方鉴定，比如AOAC。

支持服务工作

供应商能提供哪种技术支持服务？是否涵盖相关的地理位置？一天服务多少小时？提供何种和多少培训？

提供何种服务和维护项目，以何种成本？ 文件

供应商是否提供评估和验证文件？

4.1.2验证计划设计

这是工艺的计划部分，用于新测试方法评估的程序和方案在验证计划中形成和记录。用户负责人确保验证计划正确记录，但其可能由供应商和用户共同准备。

根据方法/供应商选择指定要求选择候选测试方法和供应商。可能地，用户的理想需求和商务测试方法的实际交付之间的折衷处理必须实现。这也应该记录。

正常验证前，简要评估或概念证明阶段应加以考虑。仪表可能暂时从供应商借或租以便把与未开发出的技术的大资本支出相关的风险减到最小。

与管理部分磋商选择要评估的产品并考虑用于挑战新测试方法的有机体的数量和类型。验证方案应按照工业规范编写，明确证明成功执行安装，运行和性能确认的要求。验收标准应确定且商定的应变计划应允许记录存在差异。

为了能证明成功执行运行确认，需要验证标准。新测试方法供应商的职责是提供与验证标准相关的数据来证明新测试方法与预期分析应用相关。提供的数据完整审核后，做出决定哪种实验研究需要重复进行到一个特定程度，且其能在用户验证文件中作简单参考。

注：主要目标应是保持实际工作量最小。这点在评估供应商数据时应谨记在心。提供大量支持数据时，一些秘密数据应放于信息中且仅一些关键元素在现场重复。例如，说明大范围微生物已在大量产品中检测的数据可能转移到验证相关的用户验证方案中，用于一些关键微生物的测试方法可能在您公司产品中不适用。

4.1.3安装确认

安装确认研究应确定设备已与正确的公用设施一起在相关实验室环境中正确安全安装。安装确认的一个重要部分是验证引进的新设备满足定制的设备说明。与原始说明的任何偏差应记录，说明正确的说明并批准。

安装确认研究应根据批准的方案执行。包括在IQ文件中的主要信息类型是确定信息，公用工程要求，运行环境条件，安全特征和支持文件（例如，技术手册，蓝图，图纸等）。不可能证明与一个设备相关的每个关键特征。

因此，需要作出关于测试这些在新测试方法的常规使用中未使用的系统特征的判定。处理该类型问题的一个方式是获得从系统生产商收到的仪表的那些特殊特征的符合性证书。

在安装确认文件中包括的典型信息包括：

目的：

确认安装的所有主要方面符合相关安装规则和已批准的设计说明。

范围：

待验证的设备确认。对于一些应用，不止一套设备或系统可能包含在一个单独的方案中。

职责：

确认负责执行、审核和批准工作的人员/部门。CGMPs需要质量单元批准所有的验证方案。

参考：

确认在确认方案，检查和设备测试中所使用的适当程序，和方法。

程序：

描述安全确认如何执行，实施验证的方法如何和结果如何记录。

例如程序步骤可能包括：

拆卸设备，确认在运送中未损坏并按照采购单检查所有部件。

记录序列号

确保足够的安全保障措施在位。

在适当实验室环境中正确置放设备并标签为不进行例行检测的未验证设备。

连接特定公用工程并升高设备。

执行主要测试来验证所提供的设备性能。

如有必要，重新校验设备。

验收标准：

明确需要满足的要求以便确认设备合格。

安装确认报告：

执行的工作总结，检查结果和获得的结果。

批准：

记录所有相关的部门包括质量单位已批准确认。

计算机或微处理机控制系统也应记录重要特征，比如，双列直插式开关设置，电缆连接点，使用的微处理机芯片，计算机配置，所需设备的任何特殊特征，打印机连接点，缓冲器，文件和存储要求。同样重要的是记录所需软件和相关的版本号。

这包括计算机所使用的任何运行系统。

安装通常由供应商实施且整个由用户见证。

4.1.4运行确认

运行确认形成了验证的主要实用部分，证明新测试方法在用户的实验室与其产品一起在限度和公差范围内进行。运行确认应在管理部分进行，可能以最多五个产品组使用新测试方法放行的阶段性方法进行。

第一阶段可看作是概念证明或原理确认的阶段。最多进行5个产品的测试来证明其与技术相兼容且可能证明带有少量单一微生物的系统可行性。如果供应商没有关于相似产品的支持数据却可能在设备的最终采购前执行，则该原则阶段的证明是最适当的。该阶段可能在在线输入大量文件前执行，以防可能做无用功。

一旦做出决定负责新测试方法的验证，如果使用符合方案的安装确认部分在用户现场执行，则生成的数据仍有效。

第二阶段可称作是验证，重复供应商支持数据的关键部分来说明测试方法适合其预期应用。根据验证标准进行工作但包括尽可能多地参考支持数据。例如，对枚举法来说，选择一个有限的微生物组包括根据药典得到的微生物和几个来源于制药生产厂的隔离物。使用简单稀释液中的这些生物证明验证的准确度、精确性、线性、探测限度和定量。可能时把您的测试结果与供应商手册或技术资料中提供的那些结果进行对比。支持数据越可行，越少的微生物可用于证明这可比较的结果。

用户必须判断决定多少数据需要生成，但对过验证的危险给出看法。应在进行常规使用的新方法中间选其一并证明适合所有目的使用。

OQ期间，计算机系统进行验证。证明菜单指令以预定方式运行设备且在任何仪表输入数据时作记录。

4.1.5性能确认

性能确认可确定系统将按指定标准使用您的产品执行并将包括满足药典需求的工作，例如USP 微生物限度和细菌抑制的制备测试和无菌试验的抑真菌测试。

描述和记录了在连续测试基础上进行的控制程序，维护和校准程序的进度安排。

一般而言，应执行生产商建议的测试。如果未执行，应提供未执行测试的技术解释。 性能确认考虑也需包括：

变更控制程序应制定和执行。这应是指定和控制工艺的一部分。所有变更应提交对设备的验证状态的变更影响。

标准操作规程应是书面的并包含新测试方法运行和维护的每个方面。有效指令是最重要

的，以便人员能确切知道怎样做。SOP应合理、清楚和准确无误且由相关个体批准。

通常供应商将电子地提供系统说明这样其能容易地成为内部SOP的一部分。

担心的特殊区是典型的持续进行的预防性维护项目，不断地由设备生产商进行处理。许多项目包括更新的现行软件版本的系统软件和定期的校验检查。重要的是确保相关的验证测试在单元回到使用前进行，进行正确维护的技术人员记录执行的维护。

培训记录应根据指定的培训需求进行保存。负责新测试系统的人员成功完成培训应作记录。

事实上，PQ不再是一个带有记录格式的方案，其将通过整个测试方法的寿命来实施。证明测试结果的统一性，一致性和可靠性。

执行-与当前方法平行的新测试方法是最终阶段。首先，专门按照现存方法的结果放行产品，同时把结果与使用新方法生产的那些结果对比。随着新方法置信度的提高，可能在预先指定时间或说明两种方法中相同的产品批编号后，根据新方法的结果放行产品。最初，旧方法可能继续平行运行来作为一个“安全保障”，但在相同预定时间后，旧方法应停用。需要判断决定平行测试所需的批数。管理人期望看到来自至少3个批次的数据，且用户必须决定该批次数是否足够。

切换到新方法前，应对验证最后阶段进行简单审核并授权变更。

为了放行新方法的测试结果，一些产品可能需要产品许可证修订(PLA)或新药申请(NDA)补充。在其他情况下，不需要预先批准，但新方法必须由检查人证明是否合理。如有任何疑问，联系您所在的办事处获得更多信息。

定期审核

一旦交错测试方法例行使用，则应采用正常机制对其性能进行定期审核。这与定期使用较老的药典方法一样简单（例如，6个月1次），以便证明新方法仍按预期运行。

验证总结

如该文件开头所述，验证的每个阶段应审核且在进入下一阶段前批准。倒数第二阶段是验证总结的准备阶段，提供验证目的和数据的概述，说明已满足验收标准并建议测试方法应执行。

4.2验证标准

一般来说，微生物测试方法需要满足的验收标准应划分开，除微生物鉴定外，分成两种类别：定量和定性。USP第<1225>章的药典方法的验证，指出定性或限度测试应满足哪种标准（一个测试有两种结果，积极或消极结果）以及定量测试应满足哪种标准。

建议使用USP <1225>中详细描述的标准并按照下列方法改进。一，在微生物术语中重新定义标准以便与我们的应用更密切相关。二，我们已增加其他元素——等效性和每个的验收标准。三，我们建议需要划分供应商和新测试系统的潜在用户间的责任来证明获

得这些标准。例如，在供应商实验室比每个潜在新用户更能广泛测试耐用性。

微生物方法的验证中应考虑的标准，如表5所示。

表5：微生物方法验证标准 验证参数 准确度 精确度 专属性 定量限度/检测限度 线性 范围 强度/重复性 等效性 定量测试 是 是 是 是/ 是 是 是 是/是 是 定性（限度）测试 否 否 是 否/ 是 否 否 是/是 是 列出所有的参数，除定量限度外，需要通过与标准的化学溶液等效的微生物来证明，化学溶液是实验室培养物的悬浮液。与当前建议的方法等同的新测试方法应适应相同测试样本来证明每个参数。等效性也可能使用“真实”样本在常规微生物测试实验室进行“交叉”研究来证明。但当代表性结果为零时该方法与微生物数量无关，例如，注射水监测，在100级区空气监测，或当无菌测试和无不良微生物的测试结果为负时的存在/缺失测试。

4.2.1测试样本的制备 不像化学分析物，这里我们可以准确地称出一个已知纯度的化学溶剂量比如溶解在水中以获得一个标准溶液，它更难以始终如一地用单位体积水中的统一细胞计数来制备细菌接种体。为制备1摩尔化学溶液，溶解1摩尔，即1升水中溶解1克分子量。该溶液包含一个阿伏伽德罗数，即6.023 x 1023摩尔/升。

与化学分析物相反，为制备细菌悬浮液的接种体，让有机体的纯培养物在大豆酪蛋白消化肉汤中在35°C下培养18— 24小时，调整培养液浊度，连续稀释培养液以获得所需的细胞数，并使用血球计或其他类型的计数室通过平板接种或直接细胞计数来核实数量。细菌接种备中的其他变数包括使用麦克法兰标准或光度读数计调整隔夜培养液的浊度，如在理想接种范围内稀释前以550 nm波长制备。

测试生物的恢复取决于具体的有机体，接种状况，培养基，和培养条件。例如，用于验证测试方法的不同药典推荐的微生物可能与水测试所使用的介质不相关。但对于水的微生物而言，显而易见的是较低的营养水平，较低的繁殖温度，繁殖时间会引起较高的数

量。

如果你有理想的纯培养液的混合悬浮液，那么从悬浮液中取得的等分计数将按照泊松分布进行分布。泊松分布的标准偏差是平均数的平方根。对于36—2范围的计数，标准偏差为6—17；相对标准偏差为16％至6％。这些实验（以两倍标准偏差）95%的置信限度是32%和12%。产品计数之间的主要偏差源可能是由于产品中微生物的不均匀分布引起的。其他误差与取样（称重等），稀释，平板接种、培养，计数和最后两个可以忽略不计的计算相关。

应当指出的是，精确度随着每个模板上的菌落数的增加而提高，例如10, 100和500个菌落的置信度分别是4—16，80—120和455—545。每个模板的30—300菌落范围内，6个技术人员计数的60%和88%是在5%和10%的标准图像计数方法限度内，随着数量增加，计数变少。

一个重要问题是决定验证方案中重复使用次数。需要说明统计学上两种微生物计数方法的显著差异的重复次数不能达到规定的置信度。重复次数取决于需要检测的真实百分比差别(10, 20, 25, 50和100%)，能检测差别的可能性(50, 70, 90%)和样品的目标浓度(1, 10, 50和100 cfu)（参考表6）。结果表明了5%的方法差别风险，事实上它们是等效的。

表6：重复次数需要作出50%-90%可能性的统计说明来检测1—100 cfu计数范围中两种微生物枚举法间10, 20, 25, 50和100%的差别。 50%可能性（乘方0.5） %差别 10 20 25 50 100 1 cfu 596 163 109 33 12 10 cfu 60 16 11 3 1 50 cfu 12 3 2 1 1 100 cfu 6 2 1 1 1 70%可能性（乘方0.7） %差别 10 20 25 50 1 cfu 1037 284 190 58 10 cfu 104 28 19 6 50 cfu 21 6 4 1 100 cfu 10 3 2 1

100 20 2 1 1 90%可能性（乘方0.9） %差别 10 20 25 50 100 1 cfu 1887 517 345 106 37 10 cfu 1 52 35 11 4 50 cfu 38 10 7 2 1 100 cfu 19 5 3 1 1

4.2.2 微生物方法的变异性：特别注明

新微生物测试方法的验证中需考虑的重要点是微生物学的固有变异性。有3种验证源：样品分布误差，细胞形态学和代谢活动。

对于任何给出的测试程序，这些源的相关重要性和分布将取决于测试方法的原理且必须仔细考虑。

4.2.2.1 样本分布误差

分布误差是归因于微生物测试结果的差异的最大误差源。微生物的自然分布是不同的，很少按照正态高斯分布甚至记录转换进行分布。分布倾向于负二项式或泊松分布，且极其难以评估，预测，特别是难以在低污染等级下在洁净室环境的样本和纯化水系统中实验。这些事实经常在我们对微生物测试的假设和结果说明中被忽视。

[ii] 精度

测定—制备测试范围上限的微生物悬浮液，并连续将其稀释至测试范围下端。在整个测试范围中，至少分析两种悬浮液。对于每种悬浮液，至少重复分析10次，以便计算统计标准偏差或相对标准偏差（偏差系数）的重要评估。

验收标准—通常，微生物计数的偏差系数（相对标准偏差）在15到30%的范围内是可接受的。

替代方法等效于药典法，例如平板计数法，该方法的精度不应明显降低。对比两种方法精度所建议的统计方法作为F测试的应用程序。在该测试中，评估每一种方法的差异，并计算出最大差异到最小差异间的比率，并与列成表的F分布值对比。表中的临界值取决于自由度和期望置信度。如果算出的自由度比率超过F分布表中的数值，那么这两种方法的精度存在显著的差异。

[iii]专属性

定义—微生物法的专属性是其检测微生物范围的能力，该能力表明了此方法适合使用。也应该证明样本矩阵类型与所使用方法的相容性。

测定—根据代表性微生物范围筛选方法。根据代表性样品类型范围筛选方法。

验收标准—所选择的所有代表性微生物已经成功隔离且从样品矩阵中列举出来。

[iv]检测限度

定义—检测限度是限度测试的一个参数。该参数是规定的试验条件下，样品中可检测出的最低微生物数量，但不一定要量化。微生物限度测试测定是否存在微生物。由于微生物的性质，检测限度指的是在任何培养步骤前存在于原样品中的生物数量，而不是出现在检测点的生物数量。同时，测试的样品数和样品稀释度可以测定检测限度。例如，当10克测试材料在90毫升的稀释液中稀释且有1毫升经过平板接种时，平板上菌落不存在的情况可称作是小于10cfu/g。

测定—由于无法持续获得包含单个微生物的可靠样品，因此有必要从许多标准药典微生物的多次重复（n≥5）中测定检测限度分析。

验收标准—最佳说明是：如果样品中显示的是单个生物，那么可在测试时间期限内检测出该生物。使用卡方检测能证明这两种方法能检测出单个生物的存在。

[v] 定量限度

定义—在样本矩阵中，定量限度是低级微生物定量分析的一个参数。在规定的试验条件下，以可接受精度和准确度可以测出微生物最低数量。

测定—由于无法获得包含已知微生物数量的可靠样品，因此，有必要通过整个检测从至少5个不同点多次重复（n≥5）测定定量限度。

验收标准—可作出的最佳陈述是，如果样品中显示的是单个生物，那么可在一定时期内定量。

注释—新方法的定量限度应等效于现有方法，或比它更好。

[vi]线性

定义—微生物测试法的线性是指在规定范围内样品中导致存在的与微生物浓度结果成比例的的能力。

测定—由于无法获得包含已知微生物数量的可靠样品，因此，有必要通过整个检测从至少5个不同点最少的重复测试中测定分析线性。

验收标准—相关系数r2=0.9，或最好是坡度幅度不超过20%从1.0（即r2 = 0.8）至1.2。另一种可以使用的统计工具可用于拟合优度检测。

[vii]范围

定义—范围是指高级和低级微生物间的间隔，已使用书面方法证明其精度、准确度和线性。

测定—在范围限度和范围内应用于包含分析物的样品时，可通过证实分析法提供可接受的精度、准确度和线性来验证该方法的范围。

验收标准—这将取决于该方法的性能特征。

[viii] 重现性

定义—重现性是指在不同常规测试条件下，比如不同的化验员、不同的仪器、不同批的反应剂等，从相同样品的分析物中获取的测试结果的再现性。通常，重现性表示为对微生物法中操作和环境变量的测试结果无影响。重现性是最好由易于接近多种仪器和部件批的测试方法的供应商进行测定的一个验证参数。有测试方法生产商提供的数据完全可用于证明重现性验证。

测定—针对每个分析变体，微生物悬浮液和测试至少重复5次，以便能够计算出标准偏差或相对标准偏差（差异系数）。对于定量法，也应包含测试方法的范围。应该注意微生物悬浮液的内在稳定性和随机试验方案，以消除偏差。

验收标准—通常差异系数在10到15%的范围内是可接受的。

[ix]耐用性

定义—微生物法的耐用性指的是测量其在参数法中维持在细微参数变化下不受影响能力。常规使用过程中，它提供了其可靠性的指示。耐用性是一个验证参数，最好由供应商确定的测试方法测定。由测试方法生产商提供的数据完全可用于证明耐用性验证。

测定—生产商调查到在关键反应物浓聚物、仪器操作参数和不同培养温度上的变更多达20%。

验收标准—应根据生产商质量保证要求和使用说明来审核结果。

[x]等效性

定义—等效性测量的是和那些要替代的方法相比，测试结果的相似性如何。

测定—等效性首先应该通过每一相关验证标准中的纯培养物来证明。微生物样品的变异可能是因素，因此微生物验证需要两种方法平行运行以证明上述讨论的每一种验证标准。重要的是因为微生物样品的不稳定本性，所以必须是随机抽取实验。也应多次重复测试以获取对样品变异的一些评估。

另外，“真实”样品需要通过两种方法进行测试，以表明其结果是等效的。为了证明与“真实”样品的等效性，样品需要进行鉴定，其中有些预计含有微生物，有些没有。至少有三批进行平行测试。

微生物替代测试法验证中的关键元素表证明该方法等效于药典法。那如何证明等效性

呢？

ASTM的统计手册（D4855）上有适合该问题的统计法。当对比两种测试方法时有许多注意事项。必须决定是否要比较两种方法的精度、灵敏度、准确度和/或偏差。然后具体说明类型I和II误差的概率值，例如，通常使用alpha = 0.05和beta = 0.10。然后决定最低实际重要性。这是要求判断的最关键的一步，且其将严重影响重复次数。选择合适的统计测试。收集并分析数据，计算测试统计量，对比结果和F值或t值表格，并确定方法是否明显不同。

《药典论坛》中最近两篇促进性文章是由新微生物列举设备的主要供应商和未来出版社的该小组合著的，可作为有用的微生物法验证（15、16和17）的范例。

4.3 微生物法验证的特殊注意事项

4.3.1实验室和公司中多件相同设备的使用

当实验室购入不只一种仪器，且该设备确实和验证单元相同时，即所有软件、微处理机、计算机等具有相同版本号的相同组件，许多公司在随后设备上减少测试。所需要的测试包括完成安装确认，以证实该设备等同于已验证的设备。一些公司也选择重复一个减少测试的操作确认研究，例如，使用参考溶液或标准。

当设备相同却用于多个生产设施中，即在不同的地理位置时，许多公司会共享一些确认数据，但必须重复其它确认部分。总是重复安装确认。环境条件、人员、方法和公用设施的任何测试必须在新地点进行。

4.3.2 微生物设备独特的测试需求

虽然USP指定了化学测试设备中要考虑的验证参数，许多定义并不实际处理微生物设备的问题。

一些不常注意的因素会影响验证测试要求。如果你公司是第一家使用该设备的公司，那就可能需要比第200家验证该设备的公司做更多测试。当用于测试的系统类型采用的是新技术时，还需要进行额外测试。

一些实验室设备满足FDA和其他机构所规定的验证要求。下述清单并包括所有要求，仅是作为设备要求的一个例子。

自动化内毒素检测/分析设备

该设备必须符合该文件中指定的内毒素测试确认的FDA指南。这包括实验室和化验员验证。读取器系统的验证通常涉及标准溶液产生指定的标准曲线的验证。

如果系统也包括数据库功能和定制报告，重要的是验证这些功能按预期操作和运行。例如，如果需要汇总报告，所有数据正确齐全吗？哪些因素会破坏结果的准确度，例如，突然断电时，丢失多少数据？是否有破坏文件和数据的典型事件发生？对于光谱光度测

量和照明系统，重要的是评估过滤器传输的波长和校准系统。

自动化微生物鉴定系统

评估应包括以反映现场真实微生物测试条件的方式和比例的评估活动。这包括来自生产环境、制药成分、制药用水、产品、人员等的代表性群体。另外，如果产品必须无不良微生物，则应与这些生物一起挑战特征和识别系统。典型的显微植物群应该在验证中加以说明。如果80%的分离株是未经发酵的革兰氏阴性菌，那么他们必须在验证中显示出来。当重复测试微生物特征和识别时，这些典型分离株应该提供高度可能的重复结果。

验证也必须包括手工处理程序的评估，例如，隔离纯培养物、接种物制备、革兰氏染色、氧化镁测试等，该评估要求支持准确的测试生物的特征和识别。

无菌测试设备

该设备类型中的特殊区包括设备评估无菌产品的能力。关键组件包括无菌操作测试材料和检测微生物完整整个范围的能力，例如，细菌细胞、细菌孢子、需氧菌和厌氧生物、真菌和酵母等，它们暴露在具有内在抗菌活性的产品接触应力中且包含有防腐系统，并取得与USP无菌测试等效的结果。假阳性率应不超过药典无菌测试率，即进行操作控制时少于0.1%。

应使用以下几点来证明当前方法和所提议方法的等效性，1) 列举USP细菌抑制和抑真菌测试微生物范围中计数低于100 cfu的接种体；2) 稀释灭绝相同微生物的接种体，其中20%到80%的接种体至少包括一种存在/.不存在微生物细胞的测试。

使用提议的计数方法和标准计数法的等效性（例如，平板计数和膜过滤）可证明准确度和精度，但是当前和建议的无菌测试法产生的积极无菌测试结果的相对比例可使用费希尔精确测试或持续校正的卡方测试可以测试出在统计上的显著差异。

通常，并不建议使用实际产品的平行或样本交叉测试来说明两种无菌测试法的等效性。当产品批次有95%可能发生0.1% 微生物污染率时，为了确保有95%的可能性来检测出两种无菌测试法间的差异，需要对10,600个批次进行平行测试。这意味着使用平行测试来证明等效性并不实际。以下是如何证明等效型的例子。

为了证明两种无菌测试法提供了相同的结果，准备夜间培养的促进微生物的稀释液，因此1mLUSP微生物的接种体即可提供阳性无菌测试，无论使用哪一种规定时间比例（P）的方法，例如P = 0.8。如果你使用稀释液中1mL的等分部分进行一系列无菌测试，例如，100次测试，那就使用两种无菌测试法；当阳性和阴性测试结果的比例使用每种方法统计上相同，使用卡方或Wilicoxen配对数据测试（18）时等效。

例如，从2 x 105个生物/ml的微生物细胞悬浮液中稀释10-5和10- 6稀释度。这些稀释度的等分部分应包含细胞87%和18% 的时间（见表7）。

表格7：显示无微生物增长（阴性）或微生物增长（阳性）的稀释度、接种物数量、预期接种物比例，以及当N=100，2 x 105 cfu/ml的微生物细胞悬浮液稀释0-4, 10-5, 10-6 和10-7稀释度时进行的阳性测试数量。

测试的稀释度

10-4 10-5 10-6 10-7

每次测试的平均接种水平

20 2 0.2 0.02

预期阴性比例 <0.001 0.135 0.819 0.980

预期阳性比例 >0.999 0.865 0.181 0.020

阳性测试数量，N=100

100 87 18 2

5.0术语词汇表

药典测试

美国、日本或欧洲药典中规定的药典或正式测试来决定与药典标准的特性、强度、质量和纯度的一致性。商务中的每一条药典条款在根据官方分析和测试程序检查时都应符合对产品进行定义的专著中的所有要求，例如，标有USP的上市产品；因此，这些测试也叫做仲裁测试。包括在USP一般测试和分析中的微生物测试是第<51>章抗菌剂有效性测试，第<61>章微生物限度测试和第<71>章无菌测试。洁净室中水和环境监测的方法可以从USP一般信息章节中的第<1231>章制药用水和第<1116>章洁净室和其它控制环境中的微生物评估中找到。

其它标准方法

USP通用信息第<1231>章《制药用水》提出美国公共卫生协会出版物作为合适的标准方法的来源。

国际AOAC发布了货物的化学和微生物分析的官方正式方法，其涉及食品、农业、公共卫生和安全以及环境等方面。根据性能结果的协作研究和科学检查来验证这些方法。国际AOAC已经出版了一系列的微生物分析法，如维生素类、人类病原体的隔离和鉴定、弱酸性罐装食品的无菌测试等。

药典法验证

如USP通用信息第<1225>章所述，分析验证中使用的分析参数包括准确性、精度、专属性、检测和确认限度、线性和范围。

微生物法验证是通过实验室研究建立的工艺，该方法的性能特征满足预期微生物应用要求。微生物方法验证期间应该考虑的参数如下所列。

准确度：

就统计意义而言，官方或建议的分析法和陈述的替代方法应相一致。使用化学分析，准确制备标准溶液并指定100%的效能，且在100%, 75%, 50%, 25%和10%效能下所测定的回收率。相反，以cfu/ml计数的微生物悬浮液指定的值是100%，且会稀释至五个水平，即100, 75, 50, 25和10%，以测定微生物回收数量。

线性：

微生物测试法的线性是指在规定范围内样品中导致存在的与微生物浓度结果成比例的能力。。由于无法获得包含已知微生物数量的可靠样品，因此有必要（通过整个检测从至少5个不同点，n ≥5）多次重复测定分析线性。测量线性时的相关系数为r。对于微生物法，r应为0.9或更佳。

精度：

同种样品间重复测量的一致程度。在整个测试中重复将程序用于多次实验室微生物悬浮液取样时，微生物法的精度是指单个测试结果间的一致程度。通常的精度指数是指标准偏差，或微生物计数法中的log (10)cfu相对标准偏差，或进行常规分布测量的标准偏差，如化学分析。例如，六种标准溶液重复注射的HPLC系统适合性要求是2.0%NMT的RSD。使用微生物法时，RSD约在15到30%之间是可以接受的。

专属性：

在样本中区分来自样本背景或其它生物体的测试微生物的方法能力。也应证明用于测试的与样本矩阵类型相兼容与的方法。

检测和定量限度：

在少量或过量样品情况下提供准确结果的方法能力。对于平板计数法，检测限度为1cfu/ml，而最准确的计数是每个平板30到300个菌落之间。使用膜过滤，检测限度是1cfu过滤体积，例如，每1000mL1cfu。

检测限度是限度测试的一个参数。该参数是规定的试验条件下，样品中可检测出的最低微生物数量，但不一定要量化。微生物限度测试测定是否存在微生物，例如，10 g物料中不存在指标生物或每克物料中的大肠菌数。由于微生物的性质，检测限度指的是存在于原样品中的生物数量，因此在任何培养步骤前，在分析点并未显示生物的数量。例如，测试材料可稀释，从稀释液中取出的等分部分将使用微生物方法检测的敏感度或检测限度。

可重复性与可再生性：

可重复性是指在相同实验室内由同一化验员使用相同设备在短时间内重复使用微生物法。可再生性是指在相同实验室内由不同化验员使用相同设备在短时间内重复使用微生物法。

重现性：

微生物法的重现性是指在不同常规测试条件下，比如不同的化验员、不同的仪器、不同批的反应剂等，从相同样本中获取的测试结果的精度。通常，重现性表示为对微生物法的操作和环境变量的测试结果无影响。重现性是最好由易于接近多种仪器和部件批的测试方法的供应商进行测定的一个验证参数。有测试方法生产商提供的数据完全可用于证明耐用性验证。

耐用性：

微生物法的耐用性是以参数法维持其在细微变化下不受影响的测量能力，例如，变化在

10%内，且在常规使用过程中其提供其可靠性说明。耐用性是一个验证参数，最好由测试方法的供应商进行测定。有测试方法生产商提供的数据完全可用于证明耐用性验证。

等效性：

微生物法的等效性是用于替代的替代方法与药典法得出的测试结果的相似性测量。微生物样品的变异可能是因素，因此微生物的验证需要两种方法与代表性微生物的纯培养物一起进行，以证明上述讨论的每一种验证标准。另外，“真实”样品需要通过两种方法进行测试，以表明其结果是等效的。

当根据数据收集比较两种方法的准确度、精度和/或灵敏度时，应使用显著性统计测试。例如，比较两种测试方法的精度时，计算每五个等级和每种方法的平均和标准偏差。F统计量作为每种测试的每一等级的两种变量。通过对比算出的F值和F分布表中1或5%等级选出的临界值来确定其置信度，且根据相关自由度来确定药典测试的差异是否不同于交叉法。如果精度的F比率大于临界值，那么可得出：两种方法的精度明显不同。详细资料可以参考ASTM D4855比较测试法的标准规程。

替代测试

USP23一般通告表明替代方法可能用于确定产品符合均一性、效价、质量、纯度的药典标准，因为准确度、灵敏度、精度、选择性和适应性上的优势满足自动化或计算机化数据简化或任何其他特定情况。应该验证这种替代方法或自动化方法。但是当有争议时，药典法起决定性作用。此外，USP第<61>章微生物限度测试中表明，自动化方法只有在其经过验证并获得等效或更好的结果之后才可以被取代，而USP第<71>章无菌测试表明可以使用交错程序来证明物品是无菌的，只要能够获取的结果至少具有等效可靠性。

使用替代方法的监管批准

根据21CFR314.70“已批准的应用程序的补充和其它变更”，交错分析法的增删不需要预先批准，而且可归入年度生产报告中。

快速微生物测定法

新的微生物测试法可实现与短时期内的典型测试相同的结果，例如，少于7天的无菌测试和不超过24小时的微生物计数和微生物鉴定。在实际时间内完成最终的快速测试，即1至3小时。

ATP生物发光：

通过美国萤火虫荧光素酶和底物荧光素的反应产生的光测量值及所有活生物中三磷酸腺苷（ATP）的高能磷酸键的能量来评估微生物群体。ATP中的单独模块产生绿光光子，以便信号和样品中的ATP数量成一定比例。检测的阀值是103个细菌和102 个酵母。通过使其逐渐适应这些范围可检测较低数量的微生物。

免疫检测法：

与特定微生物相关的样品中的抗体或抗原可能在数量和质量上由特定抗体-抗原的反应决定，该反应通过关联酶反应中产生出的凝集、颜色或荧光性进行检测。随着和目标微生物有关的特定抗原的单克隆抗体的出现，已经开发了特定病原体的免疫检测法。例如，

食品工业中通过酶联免疫吸附测定（ELISA）的沙门氏菌属、利斯特氏杆菌属和O175大肠杆菌进行检测。

核酸探针：

核酸探针由DNA短片段或与目标序列互补的核糖体RNA组成。富集培养的一部分被视为释放核酸，该核酸与酶探针混合在一起，然后进行色度检查。

聚合酶链反应（PCR）法： 从富集培养的角度来看，将来自裂解细菌细胞的特定核糖体的DNA片段放大至足够数量以供检测。根据特定目标波段使用电泳疗法进行检测，。PCR允许对目标生物进行高灵敏度、准确且快速的检测。

阻抗和电导法：

随着生长中的微生物从大的、相对不带电荷的分子（如蛋白质）为更小的、更充足的高电荷分子（如氨基酸类），微生物培养基的电阻或电导率的变更用于监测微生物。更高的接种物等级使检测时间更短，且特定病原体可能通过使用选择性培养基来检测。

药品生产质量管理规范

美国食品与药物管理局发布的法规描述了药品制备时的最低现行药品生产质量管理规范。

21 CFR第211.113部分 微生物污染控制规定1）应建立并遵循适当的书面程序，以防止不需要灭菌药品中出现不良微生物，2）指定防止无菌药品的微生物污染的相关书面程序应包括任何无菌工艺的验证。

21 CFR第211.165部分 测试与放行规定b）必要时，每批药品都要求进行适当的实验室测试，以免产生不良生物。

21 CFR第211.167部分 特殊测试需求规定a)对于每一批旨在无菌和/或无热原的药品，都应当进行适当的实验室测试以决定其符合这些需求。

21 CFR第211.194部分 实验记录说明了(2) 每一种测试样品的方法说明。该说明应指出数据位置，此数据确定用于样品测试的方法满足用于产品测试的相关准确性和可靠性标准。（注意：USP，NF和AOAC法不需验证，但应在实际使用条件下鉴定测试方法的适合性）。

FDA指南

FDA指南根据21CFR第10.90部分的程序条款出版，以允许感兴趣的个人和公司发表评论。该法规规定的指南一般适用于CGMPs，但并非合法要求。如果公司遵循指南来实现与CGMP的一致性，那么通常这对于FDA来说是可以接受的。并不强制公司遵守该指南要求，但是那些列入指南的替代方法将需要FDA批准。例如，1987年FDA指南关于无菌工艺生产的无菌药品（20）论述了在洁净室空气质量微生物等级和无菌测试可能需重复的条件。

FDA检查手册

该手册由现场调研部、事务管理局、FDA的FDA现场审查员联合发行。例如，1993年7月的《微生物药品质量控制实验室的检查指南》说明了设施、设备、培养基、非无菌产品的微生物测试、无菌测试、测试程序的方法和验证、数据存储、管理审核以及合约测试实验室等方面的问题。

备用微生物测试方法的执行

当前药典方法是否可接受？ 是 停止 No 否 确定测试要求，即成本、循环时间、规范等 否 备用方法是否符合要求？ 拒绝 并选择其他方法 Yes 是 进行概念确认 方法是否有效？ 编写验证方案 否 验证方案是否履行？ 是 否 进行测试

备用微生物测试方法的法规批准

备选方法是否已验证为备选方法？ 否 停止 是 当前方法是否为药典方法？ 否 归档为补充文件 是 作为年度报告的备选方法 确认实验室并开始测试