(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103710335 A(43)申请公布日 2014.04.09
(21)申请号 201310700136.9(22)申请日 2013.12.18
(71)申请人无锡思清源生物科技有限公司
地址214135 江苏省无锡市新区太科园清源
路立业楼E区308室(72)发明人毕鲜荣 王立言
(74)专利代理机构北京海虹嘉诚知识产权代理
有限公司 11129
代理人吴泳历(51)Int.Cl.
C12N 13/00(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图1页权利要求书1页 说明书5页 附图1页
(54)发明名称
一种利用常压室温等离子备微生物感受态细胞的方法(57)摘要
本发明公开了一种利用常压室温等离子备微生物感受态细胞的方法，属于等离子体技术在生物技术领域的应用。本发明的基本原理是利用等离子体中的能量离子及带电粒子，与微生物细胞内的蛋白质和遗传物质相互作用，最终引起细胞性质的改变，使细胞处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。本发明采用常压室温等离子体结合液体循环系统，以氦气为等离子体放电气体，作用于微生物细胞，可高效、方便的制备感受态细胞。本发明具有高效、快速、安全、便捷等优势，可作为一种新型实验技术广泛运用于微生物遗传、分子遗传、基因工程领域。CN 103710335 ACN 103710335 A
权 利 要 求 书
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1.一种利用常压室温等离子备微生物感受态细胞的方法，其特征在于，制备时，使微生物细胞悬浮液经等离子体照射，收集，即得感受态细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等离子体为常压室温等离子体，由ARTP诱变育种系统采用裸露金属电极在大气压、室温条件下产生的均匀辉光放电等离子体。
3.根据权利要求书2所述的方法，其特征在于，所述ARTP诱变育种系统，以氦气、氩气、氮气、氧气、空气或其混合气体为气源。
4.根据权利要求书2所述的方法，其特征在于，所述ARTP诱变育种系统的参数为：所述气源为氦气、氩气或其混合气体，气体流量设定为3～30SLM，功率为50～150W。
5.根据权利要求书4所述的方法，其特征在于，所述气体流量设定为5～15SLM、功率为80～120W。
6.根据权利要求书5所述的方法，其特征在于，所述液体循环系统通过蠕动泵调整流速，每个循环处理时间为0～20s。
7.根据权利要求书6所述的方法，其特征在于，每个循环处理时间为5～15s；所述微生物细胞悬浮液为细菌细胞悬浮液、放线菌细胞悬浮液、真菌细胞悬浮液、藻类细胞悬浮液或藻类原生质体细胞悬浮液。
8.权利要求书1-7任一所述方法包括如下步骤：1）从微生物生长的固体平板上挑选新活化的微生物单菌落接种于液体培养基中，震荡培养过夜，得菌液；
2）将步骤1）获得的菌液接种于新更换的液体培养基中，震荡培养至菌液OD600为0.3～1.0；
3）将步骤2）震荡所得菌液加入无菌离心管中，离心，弃上清，保留沉淀菌体；4）用无菌的0.1mol/L CaCl2水溶液重悬步骤3）离心分离的菌体；5）用所述的等离子体处理步骤4）获得的菌体；6）收集步骤5）经等离子体处理后的菌体，即为感受态细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述菌液OD600为0.5～0.7；所述菌液的接种量为5%～15%。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述的离心，转速4000～10000r/min，离心时间0.5～2.0min。
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CN 103710335 A
说 明 书
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一种利用常压室温等离子备微生物感受态细胞的方法
技术领域
本发明属于等离子体技术在生物学领域的应用，具体涉及一种利用常压室温等离
子备微生物感受态细胞的方法。
[0001]
背景技术
使带有遗传信息的DNA分子进入宿主细胞的过程称为“转化”；经过物理或化学方
式的处理而具有容易接受外来DNA分子进入的宿主细胞，称为“感受态细胞”。感受态细胞的状态直接影响转化的效率，为了使宿主细胞进行特定DNA或蛋白质的复制或表达，获得易于转化的感受态细胞是关键。
[0003] 制备感受态细胞的方法主要包括物理方法和化学方法两大类。其中较常用的物理方法包括电刺激、超声波、渗透压等；化学方法包括CaCl2、RbCl(KCl)、Inoue法等。然而，化学方法往往存在转化效率较低、处理过程繁琐、对环境污染等问题，而物理方法普遍能耗较高、细胞生存率低。因此，研究一种转化效率高、操作简单实用并且成本低廉的方法用于感受态细胞的制备，对分子生物学的研究尤为必要。[0004] 等离子体是物质的第四态，由大量的分子、原子、离子和电子等粒子组成的体系，化学活性高而宏观上呈电中性。这种条件温和、能量密度高的技术逐渐应用于感受态细胞的制备，如发明“一种利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的方法”（公告号：CN102321606A），即利用大气压介质阻挡放电（Atmospheric-Pressure Dielectric Barrier Discharge,APDBD）等离子体处理微生物细胞悬浮液，达到了提高细胞膜通透性的目的。然而DBD放电不够均匀，使得其应用受到。[0005] 常压室温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP）由于去除了介质覆盖，与APDBD相比放电更加均匀，并且发生器结构简单、成本低，所产生等离子体射流的温度接近室温，而臭氧浓度及紫外线辐射强度非常低。ARTP富含激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等能量离子，能够与微生物细胞内的蛋白质和遗传物质相互作用，最终引起细胞性质的改变，使细胞处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。然而，现有技术中并未有关于利用常压室温等离子备微生物感受态细胞的报道。
[0002]
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用常压室温等离子备微生物感受态细胞的方
法。该方法具有简单、方便、高效、经济、实用的特点，特别适用于微生物感受态细胞的制备。[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 一种利用常压室温等离子备微生物感受态细胞的方法，其特征在于，制备时，使微生物细胞悬浮液经等离子体照射，收集，即得感受态细胞。
[0006]
所述等离子体为常压室温等离子体，由ARTP诱变育种系统采用裸露金属电极在大气压、室温条件下产生的均匀辉光放电等离子体。[0010] 所述ARTP诱变育种系统，以氦气、氩气、氮气、氧气、空气或其混合气体为气源。
[0009]
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CN 103710335 A[0011]
说 明 书
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所述ARTP诱变育种系统的参数为：所述气源为氦气、氩气或其混合气体为气源，
气体流量设定为3～30SLM（Standard Liter per Minute，公升/分钟），功率为50～150W。此参数范围内，等离子体放电均匀有效。[0012] 所述气体流量设定为5～15SLM、功率为80～120W，此参数范围内，等离子体放电均匀度最佳，效果最好。
[0013] 所述液体循环系统通过蠕动泵调整流速，每个循环处理时间为0～20s，该浓度范围基本能满足制备感受态细胞的要求。[0014] 每个循环处理时间为5～15s，此范围内既可获得大量的感受态细胞，又不会对细胞膜造成损伤；所述微生物细胞悬浮液为细菌细胞悬浮液、放线菌细胞悬浮液、真菌细胞悬浮液、藻类细胞悬浮液或藻类原生质体细胞悬浮液。[0015] 上述方法包括如下步骤：[0016] 1）从微生物生长的固体平板上挑选新活化的微生物单菌落接种于液体培养基中，震荡培养过夜，得菌液；[0017] 2）将步骤1）获得的菌液接种于新更换的液体培养基中，震荡培养至菌液OD600为0.3～1.0，该浓度范围基本能满足均匀地接受等离子体照射的要求。[0018] 3）将步骤2）震荡所得菌液加入无菌离心管中，离心，弃上清，保留沉淀菌体；[0019] 4）用无菌的0.1mol/L CaCl2水溶液重悬步骤3）离心分离的菌体；[0020] 5）用所述的等离子体处理步骤4）获得的菌体；[0021] 6）收集步骤5）经等离子体处理后的菌体，即为感受态细胞。[0022] 步骤2）中，所述菌液OD600为0.5～0.7，此范围内细胞浓度适中，能更均匀地接受等离子体照射；
所述菌液的接种量为5%～15%，以提供较合适的生长浓度。
[0024] 步骤3）中，所述的离心，转速4000～10000r/min，离心时间0.5～2.0min，以充分分离样品，又不致细胞伤。
[0025] 本发明的特征在于依次按以下步骤进行：[0026] (1)制备菌悬液：从适合微生物生长的固体平板上挑选新活化的微生物单菌落接种于液体种子培养基中，在微生物的最适生长条件下震荡培养过夜；将获得的菌悬液按10%的接种量转接于新鲜液体种子培养基中，在该微生物的最适生长温度下震荡培养至OD600为0.5～0.7之间；将获得的菌悬液装入无菌离心管离心、弃去上清，用0.1mol/L CaCl2水溶液重悬。
[0027] (2)参数设置：以氦气作为等离子体放电气体，氦气流量设定为5～15SLM，功率80～120W。
[0028] (3)把所述待处理菌液加入原液储瓶中，菌液经过管路通过蠕动泵送入溢流器底部进液口，菌液通过溢流口向四周溢出至回收槽中，处理液通过回收管流入处理液储瓶。溢流器置于等离子体发生器射流区，在室温环境处理5s～30min，每个循环处理时间5～15s。
[0029] (4)将储瓶中菌液移至无菌三角瓶，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到体积百分比15%～20%，分装冻存感受态细胞。
[0030] 本发明中所述等离子体用于多种质粒的高效转化与染色体基因的敲除。
[0023]
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说 明 书
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本发明方法具有高效、快速、便捷的特点。
附图说明
[0032]
图1利用等离子备微生物感受态细胞的方法流程图
具体实施方式
[0033] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0034] 实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0035] ARTP诱变育种系统为北京思清源生物科技有限公司根据ZL201110339695.2的发明专利而制备得到。[0036] 实施例1：大肠杆菌Top10菌株感受态细胞的制备及转化效率测定[0037] 1、材料和试剂[0038] 材料：受体菌E.coli TOP10；质粒：pUC[0039] 试剂：LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水定容1L，pH7.0，121℃灭菌20min。
[0040] LB固体培养基：琼脂10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水定容1L，pH7.0，121℃灭菌20min。[0041] 2、实验仪器
[0042] ARTP（常压室温等离子体）诱变育种系统[0043] 3、实验步骤：[0044] 1）处理液制备：于生长Top10菌株的固体平板上挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃培养12～16小时；取2mL培养物转接种（接种量为5%）于200mL新鲜LB液体培养基中继续生长至菌液OD600为0.5；将菌液分装于50mL冰冻的离心管中4000r/min离心1min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于20mL0.1mol/L CaCl2水溶液。[0045] 2）设置处理参数：以高纯氦气为气源，气体流量10SLM，功率120W，处理距离2mm，流速5rpm，进行一个循环，循环时间为5s。[0046] 3）感受态细胞的获得：收集处理后的菌悬液即为感受态细胞。[0047] 4）转化效率的测定：取1μL pUC质粒DNA加入200μL感受态细胞中；轻轻混合后，冰浴30min；42℃，热休克90s，然后迅速置于冰浴冷却3min；加入1mL LB液体培养基，37℃振荡培养2h，使宿主菌复苏并表达抗性蛋白。将菌液离心，弃上清，加入200μL新鲜菌液重悬，取100μL涂布于相应的LB固体培养基。37℃倒置培养12～16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。
[0048] 表1.经不同时间常压室温等离子体处理大肠杆菌Top10的转化率
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CN 103710335 A[0049]
时间（s）转化率（%）[0050]
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说 明 书
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如表1所示，在15～75s范围内，菌体转化率随处理时间的增加而逐渐减少，达到
51%的转化率所需的处理时间仅为15s，说明该方法快速、高效。[0051] 实施例2：大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化效率测定[0052] 1、材料和试剂[0053] 材料：受体菌E.coli DH5α；质粒pUC[0054] 试剂：LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水定容1L，pH7.0，121℃灭菌20min。
[0055] LB固体培养基：琼脂10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水定容1L，pH7.0，121℃灭菌20min。[0056] 2、实验仪器
[0057] ARTP（常压室温等离子体）诱变育种系统[0058] 3、实验步骤[0059] 1）处理液制备：于生长DH5α菌株的固体平板上挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃培养12～16小时；取2mL培养物转接种（接种量为10%）于200mL新鲜LB液体培养基中继续生长至菌液OD600为0.6；将菌液分装于50mL冰冻的离心管中6000r/min离心1min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于20mL0.1mol/L CaCl2水溶液。[0060] 2）设置处理参数：以高纯氦气为气源，气体流量5SLM，功率100W，处理距离3mm，流速5rpm，进行一个循环，循环时间为10s。[0061] 3）感受态细胞的获得：收集处理后的菌悬液即为感受态细胞。[0062] 4）转化效率的测定：取1μL pUC质粒DNA加入200μL感受态细胞中；轻轻混合后，冰浴30min；42℃，热休克90s，然后迅速置于冰浴冷却3min；加入1mL LB液体培养基，37℃振荡培养2h，使宿主菌复苏并表达抗性蛋白。将菌液离心，弃上清，加入200μL新鲜菌液重悬，取100μL涂布于相应的LB固体培养基。37℃倒置培养12～16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。
[0063] 表2.经不同时间常压室温等离子体处理大肠杆菌DH5α的转化率
[00]
时间（s）转化率（%）[0065]
00
15
3028
4516
608
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由表2可知，在15～75s范围内，随着处理时间增加，菌体转化率逐渐减少，当处理时间为15s时，转化率可达%。[0066] 实施例3：大肠杆菌Top10菌株感受态细胞的制备及转化效率测定[0067] 1、材料和试剂[0068] 材料：受体菌E.coli TOP10；质粒：pUC
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说 明 书
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试剂：LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水定容1L，pH7.0，
121℃灭菌20min。
[0070] LB固体培养基：琼脂10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水定容1L，pH7.0，121℃灭菌20min。[0071] 2、实验仪器
[0072] ARTP（常压室温等离子体）诱变育种系统[0073] 4、实验步骤：[0074] 1）处理液制备：于生长Top10菌株的固体平板上挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃培养12～16小时；取2mL培养物转接种（接种量为15%）于200mL新鲜LB液体培养基中继续生长至菌液OD600为0.5～0.7；将菌液分装于50mL冰冻的离心管中8000r/min离心1min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于20mL0.1mol/L CaCl2水溶液。[0075] 2）设置处理参数：以高纯氦气为气源，气体流量15SLM，功率80W，处理距离4mm，流速5rpm，进行一个循环，循环时间为15s。[0076] 3）感受态细胞的获得：收集处理后的菌悬液即为感受态细胞。[0077] 4）转化效率的测定：取1μL pUC质粒DNA加入200μL感受态细胞中；轻轻混合后，冰浴30min；42℃，热休克90s，然后迅速置于冰浴冷却3min；加入1mL LB液体培养基，37℃振荡培养2h，使宿主菌复苏并表达抗性蛋白。将菌液离心，弃上清，加入200μL新鲜菌液重悬，取100μL涂布于相应的LB固体培养基。37℃倒置培养12～16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。
[0078] 表3.经不同时间常压室温等离子体处理大肠杆菌Top10的转化率
[0079]
时间（s）转化率（%）[0080]
00
1562
3030
4510
607
751
由表3可知，在15～75s范围内，随着处理时间增加，菌体转化率逐渐减少，当处理时间为15s时，转化率可达62%。这表明，利用常压室温等离子体可快速、高效地制备感受态细胞。
[0081] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
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CN 103710335 A
说 明 书 附 图
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图1
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