Ⅵ，、Ⅳｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔ 中国乳品工业 ｚｇｒｐｇｙ＠１６３．ＣＯｒｎ ｄ￣］ｒｙＩＮＤＵＳＴＲＹ 测序技术的研究进展及三代测序的应用 乌日拉嘎，徐海燕，冯淑贞，孙志宏，孟和毕力格，张和平 （内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特０１００１８） 摘要：简述了一代和高通量测序技术的基础上重点介绍以单分子实时测序为代表的第三代测序技术及其他的应用，并对单分子测 序技术和未来发展方向进行展望。 关键词：Ｓａｎｇｅｒ￣＇｜序技术；高通量测序技术；单分子测序技术；应用 中图分类号：Ｑ５０３ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００１—２２３０｛２０１６）０４—００３３—０５ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒ－ ａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｗｕｒｉｌａｇａ ＸＵ Ｈａｉ—ｙａｎ，ＦＥＮＧ Ｓｈｕ—ｚｈｅｎ，ＳＵＮ Ｚｈｉ—ｈｏｎｇ，Ｍｅｎｇｈｅｂｉｌｉｇｅ，ＺＨＡＮＧ Ｈｅ—ｐｉｎｇ ｒＫｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｍｉｎｉｓｔｒｙ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ ０１００１８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｒｅｖｉｅｗｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ——ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｂｒｉｅｆｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｅｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｉｎｇｌｅ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳＭＲＴ）．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｈｅ ｉｆｒｓｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｈｉｇｈ——ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｓｉｎｇｌｅ——ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０ 引 言 １第一代测序技术 １９４４年Ａｖｅｒｙ通过肺炎双球菌转化实验证明了 ＤＮＡ测序技术在分子生物学领域中的作用不言 ＤＮＡ是遗传信息的载体ｎ１。之后，人们便开始致力于研 而喻，并且推动了生物学的发展。１９７７年，Ｓａｎｇｅｒ发 究ＤＮＡ的结构与序列，使得ＤＮＡ测序技术应运而 明的ＤＮＡ双脱氧核苷酸末端终止测序法（ｃｈａｉｎ ｔｅｒ— 生。随之，１９５３年Ｔ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ和Ｆ．Ｈ．Ｃ．Ｃｒｉｃｋ发现的 ｍｉｎａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）和Ａ．Ｍ．Ｍａｘａｍ和Ｗ．Ｇｆｌｂｅ￣报道 ＤＮＡ双螺旋模型推进了ＤＮＡ测序技术的迅猛发展［２１。 的ＤＮＡ化学降解测序法（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｓｅ— 关于ＤＮＡ测序技术的较早报道始于１９５４年Ｗｈｉｔｆｅｌｄ ｑｕｅｎｃｉｎｇ）为代表的第一代测序技术诞生 ，但由于化 等用化学降解法测定了多聚核糖核苷酸序列嘲。成熟 学讲解法的程序复杂，后来逐渐被Ｓａｎｇｅｒ测序法代 的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７Ｏ年代中期，由Ｓａｎｇｅｒ 替。Ｓａｎｇｅｒ测序法的原理是由于双脱氧核苷三磷酸 的链末端终止法州和Ｍａｘａｍ与Ｇｆｌｂｅ￣的化学裂解法 （ｄｄＮＴＰ）的２、３位置不含羟基，在ＤＮＡ合成反应中不 到Ｒｏｃｈｅ公司的４５４技术、Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司的Ｓｏｌｅｘａ技 能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断ＤＮＡ合成 术、和ＡＢＩ公司的ＳＯＬＩＤ技术 ，人们进入了高通量 反应。在４个ＤＮＡ合成反应体系中分别加入一定比 测序时代，从单一，局部的基因或基因片段的研究转 例带有效放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过凝胶 变成了对整个基因组的研究 ，在基因组从头测序和 电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待 转录组测序应用中较广。近几年来，以单分子实时测 测分子的ＤＮＡ序列“ 。Ｓａｎｇｅｒ￣序技术因操作快、简 序为代表的第三代测测序技术开始进入人们的视野， 单，准确率高和较长读长的优势而被广泛应用，例如， 该测序技术跨越了一代，二代较短读长而直接对 人类基因组测序正是基于该技术而完成的ｎ”。但这一 ＤＮＡ单个分子进行测序的新一代测序平台应用日益 技术易受到成本低、速度慢、通量低等因素的，在 广泛。 小型的细菌基因组测序、质粒测序、细菌人工染色体 末端测序、突变位点验证等研究领域中较为常见，但 收稿日期：２０１５—０９—２５ 无法满足大型基因组组装方面的需要，这促使高通量 基金项目：国家高技术研究发展＃￣（２０１１ＡＡ１００９０２）；内蒙古科技重大 测序为标志的第二代测序技术的诞生。 专项（２０１４０１２５）。 作者简介：乌日拉嘎（１９９２一），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。 ２第二代测序技术 通讯作者：孟和毕力格 随着基因组计划的不断发展与改进，为弥补第一 ｊ．４４，Ｎｏ￣４ ２０１６（ｔｏｔ ．ｊ｝．ｊ｝ 专题论述Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ 代测序的通量低、速度慢和测序成本高而无法满足深 ＡＢＩ公司则主要是ＳＯＬＩＤ ３和ＳＯＬＩＤ ４两个测序 度测重复测序等大规模测序的需求，新一代测序技术 即第二代测序技术随机而生，目前主要包括Ｒｏｃｈｅ公 司的ＧＳ－－ＦＬＸ测序平台、Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司的Ｈｉｓｅｑ／ＭｉＳｅｑ 测序平台和ＡＢＩ公司的ＳＯＬＩＤ测序平台 。第二代测 序突出的特点是通量高，一次能测序几十万到几百万 平台，与Ｓｏｌｅｘａ的合成测序对比，ＳＯＬｉＤ测序技术拥 有第二代测序反应中最高的通量，是边合成边测序过 程中采用连接反应而不是聚合反应。其基本原理是 以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成。 ＳＯＬＩＤ测序技术的独特点在于“双碱基编码”＿ 的应 １条ＤＮＡ分子序列，使得一个物种的转录组测序或基 因组深度测序变得方便易行 １，实现了由研究单个基 因位点向全基因组层面的巨大转变。 ２．１ Ｒｏｃｈｅ／４５４ ＧＳ—ＦＬＸ平台 用，使每个碱基被阅读两次，校对原始数据而避免错 误，以此保证ＳＯＬＩＤ系统原始碱基数据的准确率大于 ９９．９４％ 。但其存在的不足是在荧光解码阶段，鉴于 其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就 容易产生连锁的解码错误。目前该技术多应用在基 因组重测序、基因型分析、基因表达分析、小分子 ＲＮＡ、表观组学测序（染色质免疫共沉淀和ＤＮＡ甲基 化）等领域。 ２００７年Ｒｏｃｈｅ公司推出了Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｅｎｃｅｒ ＦＬＸ（ＧＳ－－ＦＬＸ）测序平台，建立在４５４焦磷酸测序原 理上的一种高通量测序。比起其它二代测序平台，具 有较长的读长。目前ＧＳ ＦＬＸ测序系统样品序列片段 读长已超过４００ ｂｐ ，而最新的４５４ Ｇｓ—ＦＬｘ＋Ｓｙｓｔｅｍ 最长读长能达到１ ｋｂ，平均读长７００ ｂｐ” ，而且不需要 荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，具 有分析结果准确、快速、灵敏度较高等优点。然而， ４５４平台的测序成本比其他新一代测序平台高，并且 与其他第二代测序平台相比，无法准确测量同聚物的 长度会导致结果不准确，但该技术在基因组从头测 序、转录组分析等领域仍有着广泛的应用。 ２．２ Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＨｉＳｅｑ／ＭｉＳｅｑ测序平台 ２００６年，Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司收购Ｓｏｌｅｘａ公司，获得新一 代高通量测序技术并把该技术发展成为市场上的主 流技术，目前提供ＨｉＳｅｑ４０００、ＨｉＳｅｑ３０００、ＨｉＳｅｑ２０００、 ＨｉＳｅｑ２５００／１ ５００、Ｇｅｎｏｍｅ ＡｎａｌｙｚｅｒｌＩｘ、ＭｉＳｅｑ等测序 第二代测序技术的突出点是以高通量、低成本为 主，然而，第二代测序的较短读长不利于生物信息学 分析 １，而且，扩增ＰＣＲ前后的ＤＮＡ分子片段数目比 例有偏差，这对基因表达、尤其是对大量表达的基因 影响会更大ｎ 。这些缺点在一定程度上制约了第二代 测序技术的应用和发展，推进第三代单分子测序技术 应运而生。 ３第三代测序技术 鉴于一代和二代测序存在依赖于模板扩增以及 序列读长等的缺点，为了补充和进一步完善测序 技术，近几年研发出最新一代的测序方法——单分子 测序技术（Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），主要包括Ｈｅｌｉ— ＣＯＳ公司的真正单分子测序技￣：（Ｔｒｕｅ ｓｉｎｇｌｌｅ－－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔＳＭＳＴＭ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ公司的单分 系统。Ｈｉｓｅｑ是一种基于单分子簇的边合成边测序技 术，基于专有的可逆终止化学反应原理，实现自动化 样本制备和大规模平行测序，其文库片段的扩增是通 过桥式ＰＣＲ来实现 。Ｈｉｓｅｑ２５００测序仪虽然具有高 准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优 势，但是，基于ＤＮＡ模板扩增，其在组装高ＧＣ含量基 因组时尤其受限ｎ ，最重要是较短的测序读长不利于 组装基因组。目前Ｈｉｓｅｑ３（）（）０／４０００测序仪是基于 ＨｉＳｅｑ２５００系统流动槽技术发明的对人类基因组学测 序有很大益处的世界最先进的高通量测序平台。双 流动槽的ＨｉＳｅｑ４０００系统具有更长的读长，更高的通 量和更短的测序时间等优点而应用广泛。而单流动 槽的ＨｉＳｅｑ３０００系统则享有同样的低价格和快速运行 时间。基因组重测序、转录组测序和外显子等方面的 子纳米孔测序技术（Ｔｈｅ ｓｉｎｇＪｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、Ｐａｃｉｉｆｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）公司的单 分子实时测序技术（Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ， ＳＭＲＴ）等。 ３．１真正单分子测序技术 真正单分子测序技术（Ｔｒｕｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔＳＭＳＴＭ）是主要由Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ等人 利用合 成测序理论开发的第一个单分子测序方法（ ｔＳＭＳＴＭ）。原理是将待测序列打断成小片段用末端 转移酶阻断，经过杂交、定位点、合成等步骤检测带有 荧光信号的单个碱基 ”。该测序有样本试剂消耗少， 通量非常高，不需要ＰＣＲ扩增或连接酶等优点，适合 ＲＮＡ直接测序或把ＤＮＡ聚合酶用逆转录酶代替进 行ＲＮＡ直接测序［２２１。然而，由于测序的平均读长相 对较短，原始数据准确率相对低，仪器价格昂贵等缺 点，该测序技术需要进一步的改进。 ３．２单分子纳米孔测序技术 Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司开发的纳米孔 测序技术（Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ＤＮＡ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｉｎｇ）原理是基于电信号测序的技术。其原理为： 应用依然广泛。 ＭｉＳｅｑ测序仪是小型测序平台，以边合成边测序 技术为基础，通过可逆终止方法对数百万个片段同时 进行大规模平行测序，具有测序速度快，数据准确率 高的优点，可实现３００ｂｐｘ２的测序长度，主要在微生 物多样性分析、宏基因组测序、转录组ｄｅ ｎｏｖｏ测序、 微生物基因组测序、小ＲＮＡ测序、表达谱、ＣｈｌＰ－Ｓｅｑ 中的应用较多。目前，Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司２０１４年推出的新 代Ｈｉｓｅｑ Ｘ Ｔｅｎ测序仪已实现１０００美元完成一个人 类基因组的目标（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ 单个碱基或ＤＮＡ分子通过纳米孔通道时，会引起通 道电学性质的变化。理论上，Ａ，ｃ，Ｇ，Ｔ ４种不同的碱 基化学性质的差异会导致它们穿越纳米孔时引起的 电学参数的变化量也不同，对这些变化进行检测可以 ｉｓ－ｔｈｅ－１－０００－ｇｅｎｏｍｅ—ｆ－０ｒ—ｒｅａｌ一１．１ ４５３０）。 ２．３ ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ测序平台 ３｜２０ 年第４４卷第４觏（总第３０ 期 Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ专题论述 得到相应碱基的类型，进而测定ＤＮＡ链的序列 ，２４１。 相对于其他测序技术，Ｏｘｆｏｒｄ纳米孔测序技术的 样本处理极其简单，无需ＤＮＡ聚合酶或者连接酶，也 无需ｄＮＴＰｓ，因此其测序成本十分低廉，比其他测序 技术更有可能实现１ ０００美元基因组目标。然而，Ｏｘ— ｆ０－ｒｄ纳米孔测序技术面临的最大的问题是如何将 ＤＮＡ通过纳米孔的速度减慢，使每一个碱基通过纳 米孔的时间从微秒级上升至毫秒级纳米孔测序技术， 提高通量和准确率。２０１２年Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈ— ｎｏｌｏｇｉｅｓ公司宣布了两款基于Ｏｘｆｏｒｄ纳米孔测序技术 的测序平台，但目前没有它完成全基因组测序等相关 该测序技术比起一代和二代减少成本和测序时间，并 且避免二代测序中的ＰＣＲ扩增的环节。以上介绍的 几种单分子测序技术里，ＰａｃＢｉｏ公司的ＲＳ（Ｒｅ— ａｌ－ｔｉｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）系列测序仪已经商业化且应用较为 广泛。目前，单分子实时测序技术（ＳＭＲＴ）在基因 组、甲基化、基因重测序和转录组学等方面的应用也 越来越普遍。 ４．１基因组测序 Ｄａｖｉｄ Ａ．等 首次利用单分子实时测序技术对 引起德国大规模爆发的腹泻和血溶性尿毒症综合征 （２０１１年）的发病菌株进行全基因组测序发现：基因水 应用的报道，仅用来完成过合成ＤＮＡ模板测序，因 平交换出现的高毒性产志贺毒素的大肠杆菌（Ｓｈｉ． 此，该技术实际应用的性能还未知。如果对该技术进 ｇａ－ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１０４：Ｈ４）属于 步完善和改进的话，相信不久的将来也会变成核心 致病型肠黏附性大肠杆菌。ＳＭＲＴ测序技术的较短 技术。 的运行时间有利于在很短时间内得到变异微生物的 ３．３单分子实时测序技术 基因组，能够快速、准确地发掘爆发起因，并提供治疗 ＰａｃＢｉｏ ＲＳ测序技术是第三代测序中应用比较广 策略 １。 泛且已商业化的核心技术。该测序是基于荧光标记 采用ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ测序技术对分离自垃圾堆里 的边合成边测序技术，其原理是：ＤＮＡ模板被聚合酶 的Ｐａｎｄｏｒａｅａ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ Ｒ＿Ｂ－－４４的全基因组序列进行从 捕获后，４种不同荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸 头（ｄｅ ｎｏｖｏ）测序，结果发现该菌株具有细菌群感效应 （ｄＮＴＰ）通过布朗运动随机进入检测区域与聚合酶结 的特点，这也关于是全基因组序列和一个Ｐａｎｄｏｒａｅａ 合，与ＤＮＡ模板匹配的碱基生成化学键的时间比其 种类的细菌群感效应特点的首次报道，这也为了解土 他碱基停留的时间长很多，这有利于荧光标记的 壤细菌群体感应活动提供了重要信息 。 ｄＮＴＰ被激发而检测到相应的荧光信号，根据发射的 Ｔｈｅ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＢＣＣ）由１ ８种 不同波长的荧光基团，可以识别延伸的碱基种类 ， ， 细菌种类组成，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｈ１ １ １是ＢＣＣ 之后经过信息处理可测定ＤＮＡ模板序列。 的一种，分离自囊性纤维性患者的唾液，为了克服基 单分子实时测序（Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｔｄｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ， 因组测序领域Ｇ＋Ｃ含量导致的缺陷，使用Ｐａｃｂｉｏ ＳＭＲＴ）与Ｓａｎｇｅｒ测序法和高通量测序技术相比有优 ＲＳＩＩ进行大片段文库测序，不仅弥补了Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａ— 点，也有不足之处。例如，单分子测序比一代和二代 ｃｉａ Ｈ１１１的组成部分（２个染色体和ｔｈｅｍｅｇａｐｌａｓｍｉｄ 测序原始数据准确率低，有效反应孑Ｌ不足故通量低等 ｐＣ３）的缺陷 ，并有助于产生高质量的循环序列。 缺点，同时，ＳＭＲＴ测序的低准确率备受争议，ＳＭＲＴ ４．２基因组重测序 测序的错误率大约是１５％，碱基错测率约１％，其他错 ２０１０年，联合应用Ｒｏｃｈｅ ４５４和ＩＵｕｍｉｎａ测序技 误主要是由单碱基的插入和缺失导致的，进行纠正 术绘制了植物乳杆菌Ｐ－８基因组精细图谱 。２０１４ 后，其正确率可达９９．３％，并且，ＳＭＲＴ测序的错误都 年，内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重 是随机错误，而非系统错误，系统错误是无法通过提 点实验室研究人员利用单分子实时测序技术对植物 高测序覆盖度矫正的 １。因此，其数据应用于基因组 乳杆菌Ｐ－８（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ－８）进行了基因组 组装前需先对数据进行纠错处理。然而，整体的优势 重新测序 ，三代测序结果表明，虽然所得基因组与参 相对一代和二代还是较高的。ＳＭＲＴ测序具有超长 考序列整体线性关系良好，但是也存在一定数量的 读长、测序时间短、无需模板扩增和直接检测表观修 ＳＮＰ位点。在植物乳杆菌Ｐ－８中，同时存在片段大于 饰位点等特点，这可以避免ＰＣＲ导致的误差，而且在 ２５ ｂｐ段的变异位点。对测序结果的进一步分析发 较短的时间内测序，酶失活之前检测完成而提高准确 现，这些位点都是因为之前测序技术读长有限，无法 率。Ｕｅｍｕｒａ等－ｚ １使用ＲＮＡ直接测序技术对核糖体中 跨越含有重复序列区域进而导致错误的拼接结果。 ｍＲＮＡ的翻译过程进行实时测序，观察到了单个核糖 使用ＰａｃＢｉｏ数据纠正后，在植物乳杆菌Ｐ－８基因组中 体如何将氨基酸串联起来的过程，这为研究人员提供 检测到一个基因组片段大小１５．１７４ ｋｂ，Ｇｃ含量为 了直接测转录本的新选择，一个全新的研究思路。目 ３９．７％的新的质粒。 前，ＳＭＲＴ测序在小型基因组从头测序和完整组装中 武汉生物技术研究院对一株产生重要药物的细 已有良好应用，并且已经或将在表观遗传学、转录组 菌进行基因组测序，采用Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序技术组装之后 学、大型基因组组装等领域发挥其优势，促进基因组 得到６条ｓｃａｆｆｏｌｄ，其中ｃｏｎｆｉｇ为５１８条，采用ＰａｃＢｉｏ单 学的研究。 分子测序技术进行测序得到３条ｓｃａｆｆｏｌｄ，深入分析发 ４第三代测序技术的应用 现３条ｓｃａｆｆｏｌｄ中一条３．８Ｍｂ是环形基因组，而另外两 个是１６７ Ｋｂ和４７ Ｋｂ的质粒。研究结果表明，采用三 过去几年，单分子测序技术开始慢慢的进人人们 代单分子测序技术同时还可以了解到基因组的甲基 的视野，人们也对这个新型的测序技术越来越关注。 化修饰位点，整个基因组中含有６一ｍＡ修饰位点９４５９ Ｖｏ１一．４４，Ｎｏ．４２０１６（ｔｏｔａｌ ３ｏｓ）Ｊ ＇一 专题论述Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ 个，４－ｍＣ修饰位点４３３６个，并精确确定被修饰碱基 的位置 。 ４．３ 甲基化研究 标。新一代测序技术仍在不断开发中，技术的进步推 动测序成本不断降低和测序时问不断缩短，相信不久 千元基因组甚至百元基因组的目标将会实现。届时， 单分子测序技术能检测２０种不同类型的ＤＮＡ化 学修饰，其中包括细菌ＤＮＡ的三３Ｖ甲基化类型 （６ｍＡ，４ｍＣ ａｎｄ ５ｍＣ），利用ＳＭＲＴ测序进行甲基化转 移酶从头测序鉴定发现了细菌种类和相关菌株的多 人们对生命的发育过程和疾病的发生分子机制等重 大问题将会有更深刻细致的了解，并实现Ｐ，．ＮＡ直接 测序测技术的商业化。这将有利于展开个人基因组 测序工作，同时也便捷了各领域的研究人员获得研究 领域的物种基因组，促进基因组学研究的发展。 样性 。近几年，人们对微生物组的研究大有兴趣，但 对肠道微生物细菌甲基化的相关报道依然很少，２０１４ 年，美国加利福尼亚大学用使用ＰａｃＢｉｏ平台测定来自 两个婴儿粪便的宏基因组ＤＮＡ基础上测定了优势菌 株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅｉ的ＤＮＡ腺苷酸甲基化（Ｄａｒｎ ｍｅｔｈｙｌ— 参考文献： 【１ Ｊ ＡＶＥＲＹ Ｏ Ｔ，ＭＡＣＬＥＯＤ Ｃ Ｍ，ＭｃＣＡＲＴＹ Ｍ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏ— ａｔｉｏｎ），研究发现腺苷酸甲基化对肠道菌群的存活影 响较大，因为这个甲基化影响肠道微生物的营养，能 量等的运输与转移 ｑ。采用ＰａｃＢｉｏ ＲＳ测序平台对６ 株环境细菌进行重测序，不仅鉴定出新的６ｍＡ和 ４ｍＣ位点，还能检测一些表观遗传学标志的甲基转移 酶 。内蒙古农业大学乳品楼重点实验室研究团队利 用ＰａｃＢｉｏ测序技术对Ｌ．ｃａｉｓｅ ｚｈａｎｇ和Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｐ－８ 进行全基因组测序发现Ｌ．ｃａｉｓｅ ｚｈａｎｇ存在６ ｍＡ甲基 化位点，Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｐ－８没有 ，因此，ＳＭＲＴ测序系 统不仅了解到基因表观遗传信息，也为生物学和功能 ；６－面的应用开辟新思路。 ４．４转录组学 Ｌｕ ｃｈｅｎ等 对人类造血组细胞中（ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏ— ＣＯＣＣａｌ ｔｙｐｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９４４，９８：４５１—４６０ ｆ２］刘振波．ＤＮＡ测序技术比较Ｄ］生物学通报，２０１２，４７：１４—１７． ［３］ＷＨＩＴＦＥＬＤ Ｐ Ｒ．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＵ］，１９５４，５８（３）：３９０—３９６． ［４】ＳＡＮＧＥＲ Ｆ，ＮＩＣＫＬＥＮ Ｓ，ＣＯＵＬＳＯＮ Ａ Ｒ．ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ—ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ４￣］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１９７７，７４（１２）：５４６３—５４６７． 【５］ＭＡＸＡＭ Ａ Ｍ，ＧＩＬＢＥＲＴ Ｗ Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ Ｕ】．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１９７７，７４（２）：５６０—５６４ ［６］ＳＨＥＮＤＵＲ．Ｅ Ｊ，ＪＩ Ｈ．Ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏ— ｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６（１０）：１１３５—１１４５． ［７】ＳＣＨＵＳＴＥＲ Ｓ Ｃ．Ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ ｔｏｄａｙｐ、ｓ ｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅＨ）的巨核细胞（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ， ＭＫｓ）转录组进行ＰａｃＢｉｏ ＲＳ测序，不仅能测完整序 列，也能克服基于Ｉｌｌｕｍｉｎａ的记录短读长的缺陷，通过 ｂｉｏｌｏｇｙ￣］．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，５（１）：１６—１８ 【８］ＭＡＲＤＩＳ Ｅ Ｒ Ｎｅｘｔ～ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ】．Ａｎ— ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，２００８，９：３８７－４０２． ［９］周晓光，任鲁风，李运涛，等．下一代测序技术：技术回顾与展望【Ｉ１ ＿中国科学：生命科学，２０１０，４０（１）：２３—３７． ［１０】孙海汐，王秀杰ＤＮＡ测序技术发展及其展望［Ｉ１．科研信息化技 术与应用，２００９，（３）． 【１ １］ＴＡＹＬＯＲ Ｔ Ｄ，ＨＩＤＥＫＩ Ｎ，ＹＡＳＵＳＨＩ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏ— ｓｏｍｅ １ １ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｉｃａ— ｆ测序读出起源于个体ＲＮＡ转录体６７１１０序列鉴定为 完整序列分子，还有合并成的３５６６３共识序列集群的 转录物结构体，并且新型接头连接在ＰａｃＢｉｏ数据集中 显示，转录物结构体也是转录组完整序列的一部分， 使用连接接头评估ＰａｃＢｉｏ作为阅读深度序列和记录 读长。 ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ２００６，４４０（７０８３）：４９７—５００． ２０１４年首次使用单分子ｍＲＮＡ测序技术技术鉴 定一些蘑菇形状真菌类，结果发现：这些真菌类的全 基因组范围内普遍存在多顺反子转录组组，并含有达 ８％的转录基因。这些多顺反子ｍＲＮＡ不像原核生物 的转录组，这些反转录基可以的转录并且对顺流 【１２】解增言，林俊华，谭军，等．ＤＮＡ￣］序技术的发展历史与最新进展 硼．生物技术通报，２０１０，（８）：６４—７０ 【１３］代军杰，喻树迅，庞朝友，等新一代测序技术的应用及其对作物 分子育种的影响ｕＪ．中国棉花，２０１２，３９（４）：１—５． ［１４］ＭＡＲＤＩＳ Ｅ Ｒ．Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏ— ｇＹ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，２００８，２４（３）：１３３—１４１． ［１５］ＳＨＩＮ Ｓ Ｃ，ＡＨＮ Ｄｏ Ｈ，ＫＩＭ Ｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ—Ｍｏｌｅ— ｃｕｌｅ Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｈｉｇｈ—ＧＣ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｅｓ［Ｊ】Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１３，８（７）：ｅ６８８２４一ｅ６８８２４． 串联基因表达有所干扰，这是首次系统的发现多顺反 子转录组在高等真菌广泛存在。此外，我们还发现长 度长测序方法结合生物学信息分析精确描述复杂的 转录组能够辨别ｍＲＮＡ异构体，然而还没有用短读 长组装途径发掘的转录组基因的相关报道ｎ。 ，因此单 分子测序技术的长度长测序技术发挥了重要作用。 【１６］ＢＲＵＤＯＮ Ｍ，ＭＥＤＶＥＤＥＶ Ｐ，ＳＴＯＹＥ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ ２００９ ＳＩＧ ｏｎ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ０］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２００９，２５（２５）：２８６３—２８６４． ［１７】杨烨，刘娟．第二代测序序列比对方法综述 武汉大学学报，理学 ５展望 版，２０１２，５８（５）：４６３—４７０． ［１８】ＰＯＰ Ｍ，ＳＡＬＺＢＵＲＧ Ｓ Ｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｅｗ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２００８，２４（３）：１４２—１４９． ［１９］ＴＯＲＲＥＳ Ｔ Ｔ，ＭＥＴＴＡ Ｍ，ＯＴＴＥＮＷＡＬＤＥＲ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｅｘ— 目前，ＳＭＲＴ测序不仅在小型基因组中的已有良 好应用，在大型基因组，甲基化研究，及ＲＮＡ直接测 序测等领域也越来越发挥优势。随着单分子测序技 术的不断发展和完善，未来的第三代测序将会实现更 短的测序时间、更低廉的成本、更强的灵活性、更高的 通量、更长的读取长度、更高的测序质量等一系列目 ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００８，１８（１）：１７２—１７７． 『２Ｏ】ＩＤＯ Ｂ，ＢＥＮＥＤＩＣＴ Ｈ，ＥＭＩＬ Ｋ，ｅｔ ａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓＵ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｄ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ｊ６２ｏ：ａ￣一－ 年４卷第４期（总第３Ｄ５期） Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ专题论述 ２００３，１００（７）：３９６０－３９６４． 【３２】ＺＨＡＮＧ Ｗ，ＳＵＮ ｚ，ＭＥＮＧＨＥ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｓｈｏｍ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：ｓｉｎ ［２１】ＨＡＲＲＩＳ Ｔ Ｄ，ＢＵＺＢＹ Ｐ Ｒ，ＨＡＺＥＮ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｎｇｌｅ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｖｉｒａ１ ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２０（５８７２）： １０６－１０９． 、 ｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ—ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａ￣ｅｒｎｓ ｏｆ ２ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎｓⅡ］．Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ，２０１５，ｄｏｉ：１０．３１６８￣ｄｓ．２０１４—９２７２． 【３３】ＺＨＡＮＧ Ｗ，ＳＵＮ Ｚ，ＭＥＮＧＨＥ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ＬａｃｔｏｂａｃｉＵｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ一８ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ 【２２］ＯＺＳＯＬＡＫ Ｆ，ＰＬＡＴＴ Ａ Ｒ，ＪＯＮＥＳ Ｄ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡ ｓｅ— ｑｕｅｎｃｉｎｇ［ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１（７２６５）：８１４—８１８． 【２３］ＪＡＭＥＳ Ｃ，ＨＡＩ—ＣＨＥＮ Ｗ，ＬＡＫＭＡＤ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｂａｓｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕ］． Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，４（４）：２６５—２７０． ａｃｔｉｖｉ￣Ｕ１．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５，１９３（１０）：４１—４２． ［３４］周袁杰，马田，邓子新，等．第三代单分子测序技术在微生物基因 组研究中的应用［ｃ］．第四届全国微生物基因组学学术研讨会， ２０１２． ［２４］ＤＡＶＩＤ Ｓ，ＨＥＲＯＮ Ａ Ｊ，ＥＬＬＩＮＡ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｎｇｌｅ—ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｓ－ ｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｏｂｉｈｚｅｄ ＤＮＡ ｏｈｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ［３５】ＢＥＡＵＬＡＵＲＩＥＲ Ｊ，ＺＨＡＮＧ Ｘ ｓ，ＺＨＵ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅ— ｎａｎｏｐｏｒｅＵ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００９，１０６（１９）：７７０２—７７０７． ｃｕｌｅ——ｌｅｖｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｎａｄ ｌｏｎｇ ｒｅａｄ——ｂａｓｅｄ ｐｈａｓｉｎｇ ｏｆ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａ— ［２５】ＥＩＤ Ｊ，ＦＥＨＲ Ａ，ＧＲ ＡＹ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｒｏｍ ｉｔｏｎｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ［ｊ］．Ｂｉｏｒｘｉｖ，２０１４，６． ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２３（５９１０）：１３３—１３８． ［３６］ＬＥＯＮＡＲＤ Ｍ Ｔ，ＤＡＶＩＳ—ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ Ａ Ｇ，ＡＲＤＩＳＳＯＮＥ Ａ 【２ ６Ｊ ＲＵＳＫ Ｎ．Ｃｈｅａｐ ｔｈｉｒｄ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ：ｄｉｓｐａｒａｔｅ Ｄａｍ ２００９，６（４）：２４４． ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａ￣ｅｒｕｓ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｏｒｅＪ【Ｕ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉ— ［２７】ＳＯＴＡＲＯ Ｕ，ＣＯＬＩＮ ＥＣＨＥＶＥＲＲＩＡ Ａ，ＪＯＮＡＳ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｒｅ－ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，５：３６１—３６１． ａｌ—ｔｉｍｅ ｔＲＮＡ ｔｒａｎｓｉｔ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｉｒｂｏｓｏｍｅｓ ａｔ ｃｏｄｏｎ ｒｅｓｏｌｕ－ ［３７］ＭＵＲＲＡＹ Ｉ Ａ，ＣＬＡＲＫ Ｔ Ａ，ＭＯＲＧＡＮ Ｒ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｙ— ｔｉｏｎＵ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６４（７２９１）：１０１２—１０１７ ｌｏｍｅｓ ｏｆ ｓｉｘ ｂａｃｔｅｍ￣］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，４０（２２）： 【２８］ＲＡＳＫＯ Ｄ Ａ，ＷＥＢＳＴＥＲ Ｄ Ｒ，ＳＡＨＬＪ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆｔｈｅ Ｅ． １１４５０－１１４６２． ｃｏｈ ｓｔｒａｉｎ ｃａｕｓｉｎｇ ａｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ—ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ［３８】ＺＨＡＮＧ Ｗ，ＳＵＮ ｚ，ＭＥＮＧＨＥ Ｂ，ｅｔ ａ１．ｓｈｏｒｔ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ： ｇｅｒｍａｎｙ［Ｊ］．Ｎ ＥｎｇｌＪ Ｍｅｄ．２０１１，３６５：７０９—７１７． Ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ— 【２９】刘岩，吴秉铨．第三代测序技术：单分子即时测序．中华病理学杂志 ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ２ ＬａｃｔｏｂａｃｉＵｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ［ｊ］． Ｕ］，２０１ １，４０（１０）：７１８７２０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＤａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，９８：３０２０３０２４． 【３ｏ】ＥＥ Ｒ，ＬＩＭ Ｙ Ｌ，ＹＩＮ Ｗ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆｔｈｅ Ｑｕｏ－ 【３９１ ＬＵ Ｃ，ＭＹＲＴＯ Ｋ，Ｍａｒｔｅｎｓ Ｊ Ｈ Ａ，ｅｔ ａ１．ＴｒａｎｓｃｒｉＦ·ｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｒｕｍ—Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｐａｎｄｏｒａｅａ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＲＢ一４４ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅ— ｄｕｒｉｎｇ ｌｉｎｅａｇｅｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ Ｕ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｑｕｅｎｃｅ Ｕｓｉｎｇ ＰａｃＢｉｏ Ｓｉｎｇｌｅ——Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ——Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ２０１４，３４５（６２０４）：１２５１０３３—１２５１０３３． Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ，２０１４，２（２）． 【４０］ＧＯＲＤＯＮ Ｓ，ＴＳＥＮＧ Ｅ，ＳＡＬＡＭＯＶ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｐｏｌｙｃｉｓ— ［３１】ＣＡＲＬＩＥＲ Ａ，ＡＧＮＯＬＩ Ｋ，ＰＥＳＳＩ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｒｏｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｍｕｓｈｒｏｏｍ——ｆｏｒｍｉｎｇ ｆｕｎｇｉ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ——ｍｏｌ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｈｌｌ１，ａ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ａｉｒｗａｙ Ｉｓｏｌａｔｅ．［『】． ｅｃｕｌｅ ｌｏｎｇ—ｒｅａｄ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［ｊ］．Ｂｉｏｒｘｉｖ，２０１４． Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ，２０１４，２（２）． Ｖｏ１．４—４Ｎｏ．４． ．ｊ｝７
