高效液相色谱法在药物含量测定中的应用
——何首乌中二苯乙烯苷的含量测定 [适用对象] 药学专业
[实验学时] 10学时
一、实验目的
1.掌握高效液相色谱法测定中药有效成分含量的基本原理 2.掌握高效液相色谱仪的操作及注意事项。
二、实验原理
1.何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thumb.的干燥块根，二苯乙烯苷，又名2, 3, 5, 4-四羟基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷(C20H22O9)，为何首乌中含有的药理活性成分。二苯乙烯苷结构中具有共轭系统，因此具有紫外吸收，因此可以选用紫外监测器检测。
2.外标法是以待测组分的纯品作对照品，以试样和对照品中待测组分的峰面积或峰高比较进行定量分析，本实验采用峰面积进行定量。进行外标法定粮食，分别精密称取一定量的对照品和试样，配制成溶液，分别进相同的体积的对照品溶液和试样溶液，在完全相同的色谱条件下进行色谱分析，测定峰面积。
中国药典2005年版一部规定，何首乌中含2, 3, 5, 4-四羟基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷(C20H22O9)不得少于1.0%。
三、仪器设备
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高效液相色谱仪 / 紫外检测器 / 色谱柱 ODS 容量瓶 10ml 球形冷凝管 150ml 锥形瓶 150ml 乙腈 色谱纯 甲醇 色谱纯 重蒸馏水 / 四、相关知识点
1.高效液相色谱法的原理 2.高效液相色谱仪的操作方法 3.工作站的使用 4.色谱柱的使用保养知识 5.测定波长的选择 6.系统适应性试验 7.定量分析的原理 8.外标法的计算 9. 回流提取技术
五、实验步骤
开电源，依次打开泵系统、监测器、电脑，装色谱柱，排气泡，用流动相冲洗色谱柱至系统平衡。
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（一）色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-甲醇-水（15：10：75）为流动相；检测波长为320nm；流速为1.5ml/min。理论板数按2, 3, 5,
4-四羟基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷峰计算应不低于
2000。
（二）对照品溶液的制备 取2, 3, 5,
4-四羟基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷对照品适量，精
密称定，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
（三）供试品溶液的制备
取何首乌粉末（过四号筛）0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，上清液用微孔滤膜（0.45m）滤过，即得。
稀乙醇的配制：取乙醇529ml，加水稀释至1000ml，即得。本液在20C时含C2H5OH应为49.5％～50.5％（ml/ml）。 （四）测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，计算出2, 3, 5, 4-四羟基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷的含量。 (五) 计算
Ci = Cs Ai/As
Ci：为待测样品溶液中二苯乙烯苷的浓度（mg/ml） Cs：为对照品溶液中二苯乙烯苷的浓度（mg/ml）
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Ai：样品溶液中二苯乙烯苷峰的积分面积 As：对照品溶液色谱图中二苯乙烯苷的积分面积
六、实验报告要求
要求有原始数据，实验时间，注意事项，并讨论流动相的极性对样品分离的影响，类似液相色谱法测定实验中需要进行哪些试验条件的选择。
七、思考题
1.怎样选择测定波长？
2.系统适应性试验包括哪几项内容？ 3.外标法和内标法相比有何优缺点？
4.减少流动相中水的用量，色谱图产生什么变化？
八、实验成绩评定办法
实验成绩的评定包括实验操作（包括容量瓶的使用、天平的使用、高效液相色谱仪的使用、数据的处理和卫生情况等5个小项）和实验结果（包括实验结果的准确性和相对标准偏差）、实验报告的规范性。
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