奶牛性控胚胎移植技术规程

1范围本文件规定了奶牛性控胚胎生产和移植技术的术语和定义、技术操作要求和方法。本文件适用于奶牛性控胚胎生产、移植技术推广应用的规范化操作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3157-2008中国荷斯坦牛GB/T31582-2015牛性控冷冻精液NY/T34-2004奶牛饲养标准NY/T815—2004肉牛饲养标准NY/T1445-2007奶牛胚胎移植技术规程DB/T528-2008奶牛性控冷冻精液人工授精技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1性控胚胎sexedembryos选择生产性能优良、遗传性能稳定的供体牛进行超数排卵处理，发情后用性别控制精液进行人工授精，供体牛在配种后6d～7d回收的早期胚胎。3.2胚胎移植embryotransplantation选择与供体牛生理状况相近的受体牛，用非手术方法将胚胎移植到受体牛子宫角内，以便胚胎继续发育。44.1性控胚胎生产供体牛的选择与饲养管理4.1.1供体牛符合GB/T3157-2008中荷斯坦奶牛标准，系谱档案完整，体型线性评分良好。成年母牛选择参加奶牛生产性能测定（DHI）,生产性能优良的牛只，或经遗传评估（EBV），具有较好育种价值的牛只；青年母牛选择全基因组检测（GEBV）,具有较好育种价值，或其父母生产性能优良的牛只。1DBXX/XXXXX—XXXX4.1.2供体牛要求体格健壮，无遗传缺陷。饲养环境的舒适、稳定，避免出现疫苗注射等应激反应。保证科学、合理、平衡的日粮营养。超数排卵前一个月，适量补充复合维生素、微量元素，适量增加精料，保证超排期间体重处于增重状态。饲养标准按照NY/T34-2004执行。具体要求按照NY/T1445-2007中5.1.1和5.1.2的规定执行。4.2种公牛的性控冷冻精液的选择根据供体牛选种选配的要求，选择谱系清楚，检疫合格，遗传性状稳定，生产性能优良的验证种公牛性控冷冻精液与供体牛进行选配。性控冷冻精液质量符合GB/T31582-2015的规定。4.34.3.1供体牛的超数排卵季节选择应尽量避开酷暑和严寒时节，以春秋季节为宜。4.3.2激素选择超数排卵选用的生殖激素名称、类型、注射剂量及功能见附录A。4.3.3超数排卵方案不考虑供体牛的发情时间，避开发情期。应用CIDR＋FSH＋PGF2α法进行超数排卵处理。使用专用CIDR将CIDR送至供体牛子宫颈口处。以放置CIDR之日作为0d记，在7d～9d开始，采用连续4d递减注射法肌肉注射FSH。每天间隔12h注射2次，连续注射4d。在第5次和第6次注射FSH的同时注射0.2mgPGF2α；在第6次注射FSH后取出CIDR，用50ml生理盐水分别溶解青霉素320万IU和链霉素100IU，混合后冲洗供体阴道。具体操作程序见附录B.1。4.44.4.1供体牛的人工授精供体牛发情鉴定在第8次注射FSH后，每隔4h观察一次发情，每次0.5h以上。以母牛站定接受其它牛爬跨做为发情的标准，做好供体牛发情记录。4.4.2人工授精时间与次数人工授精时间尽量接近排卵期。发情后12h进行第1次输精，同时肌肉注射0.05mgLHRH-A3；间隔8h～10h进行第2次输精，如果还有大量卵泡没有排放，肌肉注射0.05mgLHRH-A3，间隔8h～10h后第3次输精。每次输精使用2支性控冷冻精液，分别输配至左右两侧子宫角大弯处。具体操作程序见附录B.2。人工授精操作按照DB/T528-2008规定执行。4.54.5.1性别控制胚胎的回收（采集）及处理准备工作在供体牛发情后的第6d，准备好检胚实验室。检胚实验室要求清洁消毒，温度20℃～25℃，相对湿度40%～60%。提前准备好胚胎回收所用器械设备清洗、消毒灭菌、试剂耗材准备等工作。器械设备和试剂耗材准备要求见附录C、附录D。具体操作方法按照NY/T1445-2007中附录C中的规定执行。4.5.2回收与检胚2DBXX/XXXXX—XXXX在供体牛发情后的第7d，用非手术方法进行回收。将回收的冲卵液迅速送到检胚室，通过体式显微镜进行检胚处理，并对检出的胚胎进行鉴定、分级和洗涤。具体操作方法按照NY/T1445-2007中5.3的规定执行。4.5.3胚胎的保存性控胚胎经过鉴定、分级和洗涤后，应尽快进行鲜胚移植或冷冻保存处理。具体操作方法按照NY/T1445-2007中5.4的规定执行。4.5.4记录做好每一批次每头供体牛的超数排卵、人工授精、性控胚胎回收及处理和胚胎生产统计记录，见附录E、附录F。55.1性控胚胎移植受体牛的选择与饲养管理选择体格较大、健康的荷斯坦青年牛或杂交改良肉用母牛做受体牛，人工授精两次或胚胎移植两次不孕者不使用。保证科学、合理、平衡的受体牛日粮营养，移植前1个月开始补饲，补充微量元素和维生素，移植期间体重应处于增重状态。饲养标准按照NY/T34-2004和NY/T815—2004执行。受体牛群要与供体牛有同样的饲养管理条件。具体要求按照NY/T1445-2007中6.1的规定执行。5.25.2.1受体牛的发情处理自然发情黄体良好且与供体牛发情前后相差不超过±1d的自然发情受体牛，可以作为受体接受胚胎移植。5.2.2同期发情处于发情周期7d～15d且直肠检查黄体良好的受体牛，采用一次注射PGF2α法进行同期发情处理；在不考虑发情周期的情况下，采用两次注射PGF2α或CIDR+PGF2α法对受体牛进行同期发情处理。受体牛的PGF2α处理的时间要与供体牛的PGF2α处理时间相吻合。具体操作按照NY/T1445-2007中6.2的规定执行。5.2.3发情观察同期发情处理的受体牛，在注射PGF2α24h后开始跟群观察发情，以稳定站立接受其它牛爬跨为准确发情标准，观察发情至96h，做好发情观察记录。5.3黄体检查受体牛发情第6d，通过直肠触摸检查黄体，确定排卵侧有功能性黄体，突起明显，直径1cm以上，质地稍硬弹性好，基质充实，子宫形态质地正常的受体进行胚胎移植。直肠触诊检查受体卵巢和黄体时，动作应轻、柔，以免过分刺激黄体和卵巢。5.4移植供体牛采集的新鲜胚胎，可以直接移植给经直肠检查黄体合格的受体牛；冷冻保存的胚胎进行移植时，应进行解冻处理，并对胚胎质量进行鉴定，胚胎移植应在受体牛发情的第6d～8d之间进行。移3DBXX/XXXXX—XXXX植所用器械设备和试剂耗材，见附录G。具体操作按照NY/T1445-2007中6.3的规定执行。5.5妊娠检查5.5.1胚胎移植后应注意观察受体牛返情情况。胚胎移植28d～60d时，对未返情的牛只应用直肠触诊法、B超检查法等方法进行妊娠检查并做记录，在移植后90d～120d时进行复检。妊娠检查时动作要轻柔，以免引起流产。5.5.2受体牛妊娠后要加强饲养管理，营养要全面，要注意与其它牛群分离，单独饲养，避免打斗、追赶，抽打等引起流产。5.6记录做好受体牛的发情观察、黄体检查、胚胎移植和妊娠检查记录，记录要求和方法见附录H。4DBXX/XXXXX—XXXX附录A（资料性附录）超数排卵选用激素表表A.1超数排卵选用激素表激素名称类型剂量（注射总量/头）肌肉注射，经产牛360mg～400mg/头；育成牛300mg～320mg/头。规格：400mg/瓶（以加拿大生产FSH为例）。1支/头。规格1.56g/支（以新西兰生产CIDR为例）。在输精时或输精前4h～6h肌肉注射0.05mg/头。规格0.025mg/支。超数排卵过程中肌肉注射0.4mg/头，冲胚结束后肌肉注射0.4mg。规格：0.2mg/支。功能促卵泡素（FSH）冻干针剂保证多个卵子同时发育成熟，是超数排卵的主要激素。阴道栓(CIDR)促黄体素释放激素（LHRH-A3）硅胶或海绵制品含有孕酮（P）,维持血液中的孕酮水平，抑制供体发情，促进卵泡发育同步。水针剂/粉剂促进LH的释放，进而促进多个卵子同步成熟、排放，促进黄体形成。前列腺素（PGF2α）水针剂溶解黄体，防止黄体囊肿和持久黄体的形成，促进供体牛发情。5DBXX/XXXXX—XXXX附录B（资料性附录）超数排卵及人工授精操作程序B.1超数排卵操作程序早晚分别注射下午开始观察PGF2α，第二次发情，并记录注射时，撤CIDR发情时间。人工授精（AI）放置CIDR冲胚0（d）791011121318连续4d早晚以递减剂量注射FSH图B.1超数排卵操作程序图B.2人工授精操作程序发情第1次AI，同时注射LHRH-A3第2次AI，同时注射LHRH-A3第3次AI，同时注射LHRH-A30（h）1220～2228～32图B.2人工授精操作程序图6DBXX/XXXXX—XXXX（资料性附录）器械设备准备表表C.1器械设备准备表序号1234567101112131415161718名称CIDR子宫颈扩张棒子宫粘液去除棒集卵杯15#冲卵管18#冲卵管15#冲卵管钢芯18#冲卵管钢芯100ul加样器1000ul加样器砂轮吸胎胚管口吸管量筒解冻杯液氮杯酒精灯温度计序号171821222324252627282930313233343536名称体视显微镜胚胎冷冻仪恒温板水浴锅电暖气液氮罐输精止血钳镊子细管剪泡沫箱头灯白大褂汤瓶雨鞋连体服紫外线灯喷壶7DBXX/XXXXX—XXXX附录C（资料性附录）试剂耗材准备表表D.1试剂耗材准备表序号12345671011121314151617181920名称5%碘酊75%酒精高锰酸钾维生素AD注射液亚硒酸钠-维生素E注射液石蜡油青霉素链霉素阴道栓（CIDR）促卵泡素（FSH）前列腺素（PGF2α）促黄体素释放激素（LHRH-A3）冲卵液保存液乙二醇冷冻液2%利多卡因无水乙醇生理盐水35mm培养皿90mm培养皿序号21222324252627282930313233343536373839名称四孔盘0.22um过滤器1ml注射器5ml注射器20ml注射器30ml注射器50ml注射器0.25ml胚胎细管棉球纸巾擦镜纸封口塞封口粉输精外套拇指管记号笔直检手套橡胶手套加样器头8DBXX/XXXXX—XXXX附录D（资料性附录）超数排卵及胚胎采集记录表表E.1地点超数排卵及胚胎采集记录表负责人品种牛场名称耳号供体场号公牛号超排处理：放栓前处理FSH厂时家间FSH剂量（mL）早晨晚上早晨晚上早晨晚上早晨晚上总剂量胚胎采集：采胚时间黄体数L卵泡数L回收胚胎数其中：桑葚胚早期囊胚囊胚RR公牛站精液质量放栓日期及时间注其他处理射剂量发情日期及时间人工授精日期、时间及数量第一次第二次第三次第四次输精人员提漏号细管号及颜色胚胎数及质量解冻日期备注扩张囊胚退化胚未受精卵冷冻方法：冷冻仪：冷冻液：程序号：备注：CM-桑葚配；EB-早期囊胚；BL-囊胚；EXB-扩张囊胚；分为ABCD四级采胚人员：检胚人员：冷冻人员：9DBXX/XXXXX—XXXX附录E（资料性附录）胚胎生产统计表表F.1胚胎生产统计表不可用胚胎序号供时体间牛号采胚总合数计可用胚胎MCMEBBEXBABCABCABCABCABC级级级级级级级级级级级级级级级术备合无退者注计精化12345678合计10DBXX/XXXXX—XXXX附录F（资料性附录）胚胎移植器械设备与试剂耗材准备表表G.1序号1234567101112131415器械设备名称CIDR体式显微镜恒温板细管剪剪毛剪温度计解冻杯擦镜纸棉球胚胎吸管液氮罐胚胎移植连体服汤瓶雨鞋胚胎移植器械设备与试剂耗材准备表序号1234567101112131415试剂耗材与名称阴道栓（CIDR）前列腺素（PGF2α）2%利多卡因保存液75%酒精5ml注射器高锰酸钾0.25ml胚胎细管0.22um过滤器35mm培养皿直检手套纸巾移植硬外套移植软外膜11DBXX/XXXXX—XXXX附录G（资料性附录）胚胎移植记录表表H.1发情时间黄体情况移植时间胚胎移植记录表胚胎编号类型级别妊检时间妊检结果序号1234567101112131415牛号术者备注12_________________________________