嚣蓐华＾渣化奈毫．＠ｗｃｊｄ＠ｗｊｇｎｅｔ．ｃｏｒｎ世界华人消化杂志２００８年４月１８日；１６（１１）：１１９４－１１９８ＩＳＳＮ１００９－３０７９ＣＮ１４－１２６０／Ｒ临床研究ＣＬＩＮＩＣＡＬＲＥＳＥＡＲＣＨＴ—ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化与人肝癌Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ表达的关系萎燃熬麟～张志发，黄志勇，陈孝平，严群，肖振宇，吴在德ｔｈｅｎｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔ５－ａｚａ一２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｏｔｈｅｒｅ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ，ａｎｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙ５一ａｚａ－２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｗａｓａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄ．ｓｕｒｅＲＥＳＵＬＴＳ：ＴｈｅｏｆＴ—ｃａｄｈｅｒｉｎ■同行评议者篓臻ｈ．．ｅｒｉｎ二附属医院瘤花科万 方数据Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎａｂｅｒｒａｎｔｍｅｔｈｙ｜ａｔｉｏｎｏｆＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏＣｅ¨ｕＩａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＺｈｉ・ＦａＺｈａｎｇ，Ｚｈｉ－ＹｏｎｇＨｕａｎｇ，Ｘｉａｏ—ＰｉｎｇＣｈｅｎ，ＱｕｎＹａｎ，Ｚｈｅｎ－ＹｕＸａｉｏ，Ｚａｉ－ＤｅＷｕＺｈｉ・ＦａＺｈａｎｇｔＺｈｉ－Ｙｏｎｇ。ＨｕａｎｇｌＸｉａｏ－ＰｉｎｇＣｈｅｎＩｑｕｎＹａｈ，Ｚｈｅｎ－ＹｕＸａｉｏ，Ｚａｉ－ＤｅＷｕ，ＣｅｎｔｅｒｏｆＨｅｐａｔｉｃＳｕｒ－ｇｅｒｙ，Ｔｏｎ西ｉＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｏｎｇｊｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００３０．Ｈｕ－ｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＣｈｉｎａＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ，Ｎ０．３０４７ｌ６９４．ａｎｄｔｈｅＮｅＷＣｅｎｔｕｒｙＥｘｃｅｌ．１ｅｎｔ１’ａｌｅｎｔＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｒｏｍＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．ＮＣＥＴ－０４－０７０１Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：Ｄｒ．Ｚｈｉ—ＹｏｎｇＨｕａｎｇ．ＣｅｎｔｅｒｏｆＨｅ－ｐａｔｉｏＳｕｒｇｅｒｙ，ＴｏｎｇｊｉＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｏｎｇｊｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０９５Ｊｉｅ－ｆａｎｇＲｏａｄ，Ｗｕｈａｎ４３００３０，ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ。Ｃｈｉｎａ．ｚｙｈｕａｎｇ＠ｍｅｄｍａｉｌ．ｔｏｍ．ｃｎＲｅｃｅｉｖｅｄ：２００７－１２．２６Ｒｅｖｉｓｅｄ：２００８．０２．２８ＡｂｓｔｒａｃｔＡＩＭ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｂｅｒｒａｎｔｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＴ—ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄＴ—ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）．ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ（ＭＳＰ），ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆＴ—ｃａｄ一ｎＩｎｐｒｏｍｕｏｅｔｅｒｏｔｉｓｓｌｓｕｅ－ｓａｍｐｌｅ．ａｎｄ．Ｔ…－ｃａｄｈ…ｅｒｉｎ一ｓｓｏｔｅＨＣＣｒ．ｐｒｏ．ｔｅｃｉａｎａｎｄｐｘｃａｅｎｃｅｒ。ａｄ。ｊａｃｅｎｔｍｕｃｏｓａ．ＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄ，ａｎｄｍｅｔｈｌｙｌａｔｉｏｎｐｒｏｍｏｔｅｒｅｘｉｓｔｅｄｉｎＨＣＣ（４０％１，ｔｈｅ１ｋａｄｈｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｏｍ－ｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｔｈａｔｉｎＨＣＣｗｉｔｈｏｕｔｍｅｔｈｖｌａｔｉｏｎ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｃｏｒｅ：０．２２７±０．８７５ｖｓ０．１８８士１．６６７，Ｐ＜０．０５）．ＷｈｅｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｗｉｔｈａｂｅｒｒａｎｔｍｅｔｈ－ｙｌａｔｉｏｎｏｆＴ—ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ５一ａｚａ一２一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ，Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎｗａｓｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｂｅｒｒａｎｔｍｅｔｈｙｌａ－ｔｉｏｎｐｌａｙｓａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＴ－ｃａｄ—ｈｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｇｅｎｔｓｃａｎｒｅｓｔｏｒｅＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏａｓｔｏｓｕｐｐｒｅｓｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ．ＫｅｙＷｏｎｄｓ：Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ；Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＷｅＳｔｅｍｂｌｏｔ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ；ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＺｈａｎｇＺＦ，ＨｕａｎｇＺＹ，ＣｈｅｎＸＰ，ＹａｎＱＸａｉｏＺＹ，ＷｕＺＤ．ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎａｂｅｒｒａｎｔｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄＴ—ｃａｄｈｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅＵｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＳｈｉｊｉｅＨｕａｒｅｎＸｉａｏｈｕａＺａｚｈｉ２００８；１６（１１）：１１９４－１１９８摘要目的：探讨Ｔ．ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化与Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在肝细胞癌中表达的关系．方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣ＆ＭＳＰ）、免疫组织化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）和免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）检浸，ｌＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在肝细胞癌中启动子甲基化的状态及其对Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达的影响．培养肝癌ＨｅｐＧ２细胞。采用去甲基化药物５－ａｚａ．２．ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ处理后．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达。并观察Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达对肝癌细胞株ＨｅｐＧ２细胞增殖的影响．张志发，等．Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化与人肝癌Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ表达的关系１１９５结果：Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ＆肝细胞癌中存在启动子甲基化（４０％），肝细胞癌组织ｔＰＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲科中心行手术切除的原发性肝细胞癌及远离癌灶边缘２ｃｍ以上的癌旁肝组织共２０例．所取标本石蜡切片，所有诊断均经病理学诊断证实为肝＿研发前沿萎骂￡鬻ａ内ｄｈ许ｅｆｉ多ｎ巍爵、’翥矗极性基化导致其表达明显下调（表达评分：０．２２７±Ｏ．８７５ＶＳ０．１８８±１．６６７，Ｐ＜Ｏ．０５）：对存在Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ罢薯慕架嚣毖墨善主荽舅等量巍勰启动子甲基化的ＨｅｐＧ２细胞应用去甲基化药物５一ａｚａ－２一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ３告养能诱导Ｈｅｐ（讫细胞Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ分子的重新表达。Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ分子重新表达能抑制ＨｅｐＧ２细胞增殖．结论：Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子的甲基化导致其表达下调：去甲基化药物５一ａｚａ．２一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ能恢复ＨｅｐＧ２细胞Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达，并抑制ＨｅｐＧ２细胞增殖关键词：Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ；甲基化；肝细胞癌；免疫印迹法；聚合酶链反应；免疫组织化学张志发，黄志勇．陈孝平，严群，肖振宇，吴在德．Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化与人肝癌Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ表达的关系．世界华人消化杂志２００８；１６（１１）：”９４—１１９８ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｊｇｎｅｔ．∞ｍ，１００９－３０７９，１６，１１９４．ａｓｐ０引言原发性肝癌为高度恶性肿瘤，其死亡率居我国肿瘤死亡率第二位．手术切除是治疗肝癌的首选方法．我国原发性肝癌与乙肝感染引起的肝硬化密切相关，且易发生早期转移和播散，手术切除率低和术后转移及复发是制约手术疗效的重要因素．因此，研究肝细胞癌发生、发展的分子机制，对我们制定新的治疗方案，控制其转移及复发有着重要的临床意义．近年来研究发现黏附分子与恶性肿瘤的生物学特征如肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭及转移有密切的相关性．黏附分子家族中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在乳腺癌ｎ１、肺癌口】、结直肠癌‘３１、．卵巢癌川等中表达下调，其下调机制和Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化明显相关【２．５１．转染Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎｃＤＮＡ的乳腺癌细胞增殖和侵袭能力减弱”】，证实Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ具有肿瘤抑制的功能，且Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ作为肿瘤抑制因子的推测在裸鼠体内也得到了进一步证实【６】．在人肝细胞癌中是否存在Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化对Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达的影响尚无研究报道．深入研究人肝癌组织中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达与Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化的关系，对揭示其发生、发展的精确分子机制，设计合理的药物治疗，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要的意义．１材料和方法１．１材料收集２００３—０８／２００６—０１同济医院肝脏外ｗｗｗ．ｗｊｇｎｅｔ，ｃｏｍ万 方数据细胞肝癌．１．２方法１－２．１甲基化特异性聚合酶链式反应（ＭｓＰ）：用ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ从２０例肝癌组织、癌旁组织和１例肝癌细胞株中提取基因组ＤＮＡ，提取步骤按照试剂盒的说明进行．然后取１ｌａｇ的基因组ＤＮＡ用ＣｈｅｍｉｃｏｎＣｐＧＷ２刑ＤＮＡＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ进行处理，将基因组ＤＮＡ上所有非甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，同时那些甲基化的胞嘧啶则保持不变【８】，修饰过程按试剂盒说明书进行．修饰后的ＤＮＡ保存在ＴＥ缓冲液（ｐＨ７．５）中．用上述修饰的ＤＮＡ作为模板，按照Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化和非甲基化两种可能设计两对引物，引物序列按照Ｓａｋａｉｅｔａ／ｆ９］所述．Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子非甲基化的引物序列是：上游引物：５＇－ＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴ－３’，下游引物：５’一ＡＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＩ＇ＡＣＡＣＡＣＡ一３’，扩增出２４２对碱基产物．针对Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化的引物序列是：上游引物：５’一ＴＣＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＣ一３，下游引物：５’．ＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＣＡＣＧＣＧ一３’，扩增出２４３个碱基对，ＰＣＲ扩增的产物在２０ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶验证．１．２．２逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）：用ＴＲＩｚ０１分别从２０例肝细胞癌组织和其对应的癌旁组织中提取总ＲＮＡ，提取步骤按照ＴＲＩｚｏｌ试剂的说明进行．用２¨ｇＲＮＡ作为模板进行逆转录反应．ＰＣＲ反应的引物序列按Ｗａｎｇ影∥８１和Ｓａｋａｉ甜ａ，【９】所述．上游引物：５’．ＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴ－３’。下游弓Ｉ物：５’一ＧＴＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＣＡＧＡＧＴ－３’．内参ＧＡＰＤＨ做为对照，上游引物：５＇－ＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＧ一３’。下游引物：５＇－ＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣ．３’．循环过程包括：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ：５０℃１ｍｉｎ；７２℃１ｍｉｎ；共３２个循环：最后７２℃１０ｒａｉｎ．ＰＣＲ的产物在２０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳验证．１．２．３蛋白质免疫印迹杂交：用三去污裂解液从１０例肝癌组织和癌旁组织提取蛋白（用单去污裂解液从肝癌细胞株中提取蛋白），每孔加入８０“ｇ蛋白，以１０％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳分离，电转印将蛋白质转移到纤维膜（ＮＣ膜），用含５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ缓冲液３７。Ｃ下封闭ＮＣ膜１ｈ，将兔抗人Ｔ－ｃａｄｈｅｉｒｎ一抗和Ｂ—ａｃｔｉｎ用含５％脱脂奶粉瓮蘸肇爨参细胞的识别和信主姜釜未耋嘉箬胞癌的发生、发簧善兰兰渠萎殳们了解．１１９６ＩＳＳＮ１００９－－３０７９ＣＮ１４・－１２６０／Ｒ世界华人消化杂志２００８：年－－４月１８日第１６卷第１１期■创新盘点本研究通过ＭＳＰ技术证实了Ｔ－ｃａｄｈｃｒｉｎ分子在肝细胞癌中存在启动子甲基化，以及用去甲基化药图１物能抑制ＨＣＣ细胞的恶性生物攀特征的现象，有助于从基因水平上了解肝细胞癌的４１，ＩＪ肝癌存在Ｔ—ｃｏｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化．ｍ：代表甲基化产物；ｕ：非甲基化产物；Ｔ：肿瘤组织；Ｎ：癌周组织．图３Ｔ－ｃａｈｄｅｒｉｎ启动子甲基化和Ｔ—ｃａｈｄｅｒｉｎ蛋白表达的关系．Ｔ：肿瘤组织；Ｎ：癌周组织．发展规律．万 方数据图２Ｔ－ｃａｈｄｅｒｉｎ启动子甲基化与Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ表达Ｔ：肿瘤组织：Ｎ：癌周组织．的ＴＢＳＴ缓冲液以１：１０００和１：２００稀释后分别置入含有ＮＣ膜的杂交袋中４℃孵育过夜，ＴＢＳＴ漂洗数次后。再以１：５０００稀释的ＨＲＰ标记羊抗兔ＩｇＧｑｂ于３７℃孵育１ｈ，ＴＢＳＴ漂洗数次，采用ＥＣＬ化学发光试剂于暗室中进行放射自显影．１．２．４免疫组织化学：组织标本行４“ｍ厚连续切片，组织切片常规脱蜡、水化，抗Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ一抗用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）以１：１００稀释后孵育过夜，余后采用上海基因公司代理Ｄａｋｏ公司二步法抗兔／鼠通用型免疫组化检测试剂盒的步骤．ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照．结果判断根据阳性细胞所占百分比进行评分，Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ阳性细胞为细胞膜被染成棕黄色。１００倍镜头下任意选取１０个视野，４００倍镜头下在每一视野中连续记数１００个癌细胞，记录其中阳性细胞数，计算阳性细胞百分数，取平均数后从Ｏ到４评分．Ｏ：≤５％阳性细胞数；１：６％一２５％阳性细胞数；２：２６％．５０％阳性细胞数：３：５１％．７５％阳性细胞数：４：≥７６％阳性细胞数．１．２．５细胞增殖实验：肝癌细胞株ＨｅｐＧ２被培养在含有１００ｍＬ／Ｌ的胎牛血清、青霉素和链霉素的ＤＭＥＭ培养液中．１０４个细胞被种植在直径为６ｃｍ的１８个培养皿中，１８个皿被分成两组，每组９个皿．一组细胞被种植在上述普通的培养液中，另一细胞被种植在含去甲基化药物终浓度为２Ｉ，ｔｍｏｌ／Ｌ的培养液中，培养液每３ｄ换１次．两组细胞在第３、５、７天各计数一次，每次每组选３个皿计数取平均值．分别以０、１、２、４、８、１０、２０、４０”ｍｏｌ／Ｌ的药物浓度培养细胞，在２ｐｍｏｌ／Ｌ的药物浓度时观察到既能让细胞保持较０求８魅６絮４璺委２０号８‘ｇ芎６士４２０伴甲基化的非甲基化的肝细胞癌组织肝细胞癌组织图４Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白在伴Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化和非甲基化肝细胞癌组织中的表达．认ｏ．０５．好的生长状态又能保证不因药物剂量过大而致的细胞毒性作用．每次细胞计数结束，收集细胞做Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析．统计学处理所有数据均采用ｍｅａｎ±ＳＤ表示，以０ｃ＝０．０５为检验水准．应用ＳＰＳＳｌｌ．５对实验结果进行统计学处理．２结果２．１启动子甲基化导致Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在肝细胞癌中表达下调对２０例肝细胞癌组织、癌旁组织中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ甲基化的状态及其表达水平的研究表明：在肝细胞癌组织中有８例出现甲基化，而在癌旁组织中没有出现甲基化，均表现出非甲基化（图１）．证明Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子的甲基化与肝癌恶性转化相关．８例甲基化肝细胞癌组织中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ的表达显著低于癌旁组织（图２）；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明８例甲基化的肝组织中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白水平低于对应的癌旁组织（图３）；免疫组织化学结果也表明：这８例存在甲基化的癌组织中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白较没有甲基化的１２例癌组织中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达低，其表达评分分别为０．８７５±０．２２７和１．６６７±０．１８８，有显著性差异（氏０．０５，图４），表明启动子的甲基化是导致Ｔ－ｃａｄｈ＇ｅｒｉｎ在肝细胞癌中表达下调的机制之一．２．２去甲基化药物能重新诱导肝癌细胞株ＨｅｐＧ２ｗｗｗ．ｗｊｇｎｅｔ，ｃｏｍ张志发，等．Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化与人肝癌Ｔ—ｃａｄｈｅｒｉｎ表达的关系１１９７●应用要点本研究证实Ｔ－ｅａｄｈｅｒｉｎ分子参与肝癌发生、发展过程，为下一步的实验提供可靠理论基础．图５５－ａｚａ一２一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ处理后肝癌细胞ＨｅｐＧ２Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达．１：对照组；２：５－一，ａ－２一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ处理组．中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达。并能抑制ＨｅｐＧ２细胞生长前期实验证实肝癌细胞株ＨｅｐＧ２中存在Ｔ－ｃａｄｈｅｉｒｎ启动子甲基化现象．为进一步验证启动子甲基化对Ｔ－ｃａｄｈｅｉｒｎ表达的影响，实验组中将ＨｅｐＧ２细胞以浓度为２“ｍｏｌ／Ｌ的去甲基化药物５．ａｚａ一２一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ培养，对照组中仅用常规培养基培养，培养７ｄ后收集细胞ＨｅｐＧ２检测Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达，结果发现，用去甲基化药物处理过的细胞中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白的量明显高于没有用药物处理的细胞（图５）．同时还发现，以去甲基化试剂培养的ＨｅｐＧ２细胞培养第５，７天计数显著少于以常规培养基培养的细胞（氏０．０５，图６）．治疗靶点对肝癌治疗具有重要意义．Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ３１，说明ｗｊｇｎｅｔ，ｃｏｍ万 方数据芰一籁盘壁器图６５－ａｚａ一２一ｄｅｏｘｙｃｙｌｉｄｉｎｅ抑制肝癌细胞株ＨｅｐＧ２的增殖．≯＜Ｏ．０５．的重要原因之一，这在卵巢癌‘１４１、胰腺癌［１５－１６１中已得到证实，而因启动子甲基化导致Ｔ－ｃａｄｅｒｈｉｎ在众多的肿瘤中表达下调或缺失已有诸多报道，在胰腺癌【８１中约５８％的Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的下调表达是由于启动子甲基化引起的，说明在恶性肿瘤中启动子的甲基化和Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达下调中有直接的相关性．我们的研究结果表明在２０例肝细胞癌中８例存在启动子甲基化，这８例甲基化的癌组织中Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达水平显著低于其他１２例没有甲基化的肝细胞癌组织（氏０．０５），表明Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ甲基化在肝癌中是影响Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达下调的重要机制．为进一步证实上述结论，利用肝癌细胞株ＨｅｐＧ２＠存在Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化这一特征，我们应用去甲基化药物来研究是否去甲基化试剂能恢复Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达．结．果表明，ＨｅｐＧ２细胞通过去甲基化药物培养后，Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在ＨｅｐＧ２细胞株中的表达上调，且恢复Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达对的ＨｅｐＧ２细胞增殖有明显受抑作用．我们前期研究表明，将Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ基因导入缺失表达的Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ分子的大鼠胶质母细胞Ｃ６细胞使其过度表达Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ分子，Ｃ６细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，证实Ｔ－ｅａｄｈｅｒｉｎ在大鼠胶质母细胞中的肿瘤抑制功能，并进一步揭示起抑制机制是Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ分子通过诱导ｐ２１ｃ１嗍ＡＦｌ表达致使肿瘤细胞于细胞周期Ｇ：期阻滞．本研究证实在人肝细胞癌中启动子甲基化对Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达下调有密切的相关性，而去甲基化的药物能恢复Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在ＨｅｐＧ２细胞株中的表达，并能抑制他的增殖，证明Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ启动子甲基化导致Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达缺失是肝癌恶性转化的机制之一，ｐ２１ａⅣｗＡＦｌ基因是否参与肝表明去甲基化药物５一ａｚａ．２一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ能恢复Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达，且能抑带ｔＪＨｅｐＧ２细胞的增殖．３讨论肝癌是我国常见的恶性程度极高的肿瘤之一，手术切除率低．肝癌对放疗、化疗均不敏感，对手术切除后复发和转移的病例及不能手术切除的肝癌，目前尚无有效的治疗手段，因此，深入研究肝癌的发生、转移的分子机制，探索新的药物是黏附分子家族较为特殊的一种类型，因为缺失经典ｃａｄｈｅｒｉｎ分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上【９】，故命名ｔｒｕｎｃａｔｅｄ．ｃａｄｈｅｒｉｎ（且ＯＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，又称ＣＤＨｌ３或Ｈ—ｃａｄｈｅｒｉｎ）。他主要介导同种细胞间的黏附【１ｌ】和迁移【１１】．研究已经发现重新表达Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的乳腺癌细胞其增殖特性受抑…，而在成神经细胞瘤中，Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的高表达也能抑制由表皮生长因子诱导的细胞生长、侵袭性反应【１Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ黏附分子参与了肿瘤的发生、发展过程．启动子甲基化是导致肿瘤抑制基因沉默１１９８ＩＳＳＮ１００９—３０７９ＣＮ１４—１２６０／Ｒ世界华人消化杂志４７７７＿４７９０８Ｓａｋａｉ２００８年４月１８日第１６卷第１１期■同行评价本文报道内容新颖．研究方法可行．结果基本可靠。具有较好的学术价值．癌的发生、发展是需要进一步研究．深入研究Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ基因表达下调或缺失与肝癌的关系，以及影响Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达的分子机制，对进一步探索Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ基因在肝癌发生、发展过程中的作用。进而发展通过调节Ｔ－ｃａｄｈｅｒｉｎ基因表达来抑制肿瘤生长的肿瘤治疗研究具有重要意义．４１１０９Ｍ，ＨｉｂｉＫ，ＫｏｓｈｉｋａｗａＫ，ＩｎｏｕｅＳ，ＴａｋｅｄａｐｒｏｍｏｔｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆＣＤＨｌ３ｉｎＳ，ＫａｎｅｋｏＴ，ＮａｋａｏＡ．Ｆｒｅｑｕｅｎｔｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ．ＣａｎｃｅｒＳｃ／２００４：９５：５８８－５９１ＢＤ，ＭａｒｃｏｚｚｉＣ，ＭａｇｅｅＡＩ．Ｔｈｅｃａｄｈｅｒｉｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｄｉｖｅｒｓｉ坤ｉｎｆｏｒｍａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．，ＱＩｆＡｎｇｓｔＳｃｆ２００１：１１４：６２９．６４１ＶｅｓｔａｌＤＪ，ＲａｎｓｃｈｔＢ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－－ａｎｃｈｏｒｅｄＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎｍｅｄｉａｔｅｓｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ．，（纠ｆＢｉｏｌ１９９２；１１９：４５１—４６１Ｐｈｉｌｉｐｐｏｖａ参考文献ＳａｔｏＭ，ＭｏｒｉＹ，ＳａｋｕｒａｄａＡ，Ｆｕｉｉｍｕｒａｓ，ＨｏｒｉｉＡ．ＴｈｅＨ—ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨｌ３）ｇｅｎｅｉｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｉｎｈｕｍａｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ．Ｈ“ｍＧｅｎｅｔ１９９８：１０３：９６－１０１Ｌｅｅ１１Ｍ，ＩｖａｎｏｖＤ，Ｔｋａｃｈｕｋｖ，Ｅｍｅｔｏｉｎｖｉｔｒｏ：ａＰ，ＲｅｓｉｎｋＴＪ．ＰｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎｏｆＴ－ｃａｄｈｅｒｉｎｏｆｍｉｇｒａｔｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌｓｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌ３５３．３６０１２ｔｈｅｌｅａｄｉｎｇｅｄｇｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎ２ＳＷ．Ｈ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，ａｎｏｖｅｌｃａｄｈｅｒｉｎｗｉｔｈｇｒｏｗｔｈｍｏｔｉｌｉｔｙ？Ｈ诒ｔｏｃｈｅｍＧＢ“Ｂｉｏｌ２００３：１２０：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄ３ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｌ＂．ＮａｔＭｅｄ１９９６：２：隔７８２ＨｕａｎｇＺＹ，ＷｕＹ，ＨｅｄｒｉｃｋＮ，ＧｕｔｍａｎｎＤＨ．ａｒｒｅｓｔａｎｄｒｅｑｕｉｒｅｓＫ，ＭｉｙａｊｉｍａＫ，ＭａｋａｒｌａＰ，ＳａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａＵＧ，ＹｉｎＪ，ＳａｔｏＦ，ＳｈｉｖａｐｕｒｋａｒＮ，ＭｅｌｔｚｅｒＳＪ，ＧａｚｄａｒＡＦ．ＡｂｅｒｒａｎｔｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＤＨｌ３ｆＨ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）ｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅ函ｏｎｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｓａｎｄａｄｅｎｏｍａｓ．ＣａｎｃｅｒＴｏｙｏｏｋａＳ，ＴｏｙｏｏｋａＫＯ，ＨａｒａｄａＲｅｓＴ．．ｃａｄｈｅｒｉｎ．，ｍｅｄｉａｔｅｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｖｏｌｖｅｓＧ２ｐｈａｓｅｐ２１（ＣＩＰｌ／ＷＡＦｌ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｏｆＣｅｌ！Ｂｉｏｆ２００３；２３：５６６．５７８ＴａｋｅｕｃｈｉＴ，ＭｉｓａｋｉＡ，ＬｉａｎｇＳＢ，ＴａｃｈｉｂａｎａＡ，ＨａｙａｓｈｉＮ，ＳｏｎｏｂｅＨ，ＯｈｔｓｕｋｉＹ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ２００２：６２：３３８２－３３８６ｋａｄｈｅｒｉｎａｎｄｉｔｓ４ＫａｗａｋａｍｉＭ，ＳｔａｕｂＴ，ＣｌｉｂｙＷ，ＨａｒｔｍａｎｎＬ，ＳｍｉｔｈＤＩ，ＳｈｒｉｄｈａｒＶ．ＩｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＨ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨｌ３）ｏｎ１６ｑｉｎｃａｎｃｅｒ．／ｎｔｆＣＤＨｌ３，Ｈ．Ｃａｄｈｅｒｉｎ）ｉｎｈｕｍａｎｂｒａｉｎａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｃｅｌｌｓ．ＩｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓＮｅｕｒｏｃｈｅｍ２０００：７４：１４８９－１４９７１４ｔｈｅｒｅｇｉｏｎｏｆｆｒｅｑｕｅｎｔｄｅｌｅｔｉｏｎｒＯｎｃｏｌ１９９９；１５：７１５—７２０ｉｎｏｖａｆｉａｎ５ＬｅｅＳＷ，ＲｅｉｍｅｒＣＬ，ＣａｍｐｂｅｌｌａｎｄｔｕｍｏｒＤＢ，ＣｈｅｒｅｓｈＰ，ＤｕｄａＲＢ，ＫｏｃｈｅｒＯ．Ｈ－ｃａｄｈｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｓｉｎ６ｖｉｔｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．ＭｅｒｌｏＡ，ＨｅｒｍａｎＪＧ，ＭａｏＬ，ＬｅｅＤＪ，ＧａｂｒｉｅｌｓｏｎＥ，ＢｕｒｇｅｒＰＣ，ＢａｙｌｉｎＳＢ，ＳｉｄｒａｎｓｋｙＤ．５’ＣｐＧｉｓｌａｎｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｒａｎｓｃｒｉＤｔｉｏｎａｌｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｔｕｍｏｕｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｐ１６／ＣＤＫＮ２／Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１９９８；１９：１１５７－１１５９ＭＴＳｌｉｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓ．ＮａｔＭｅｄ１９９５；１：６８６＿６９２Ｒｏｍａｎ－ＧｏｍｅｚＪ｜ＣａｓｔｉｌｌｅｊｏＪＡｌＪｉｍｅｎｅｚＡｔＣｅｒｖ—ａｎｔｅｓＦ，ＢｏｑｕｅＣ，ＨｅｒｍｏｓｉｎＬ，ＬｅｏｎＡ，ＧｒａｎｅｎａＡ，ＣｏｌｏｍｅｒＤ，ＨｅｉｎｉｇｅｒＡ，ＴｏｒｒｅｓＡ．Ｃａｄ—ｈｅｒｉｎ－１３，ａｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ．ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ，ｉｓｓｉｌｅｎｃｅｄｂｙＤａｍｍａｎｎＲ，ＳｃｈａｇｄａｒｓｕｒｅｎｇｉｎＵ，ＬｉｕＬ，ＯｔｔｏＮ，ＧｉｍｍＯ，ＤｒａｌｌｅＨ，ＢｏｅｈｍＢＯ，ＰｆｅｉｆｅｒＧＰ，Ｈｏｎｎｇ—ＶｕＣ．ＦｒｅｑｕｅｎｔＲＡＳＳＦｌＡａｎｄＫ．ｒａｓｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｒｉｓｋｐｒｏｆｉｌｅａｎｄｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌｆａ．，ｉｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｃｈｒｏｎｉｃ１６ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２００３；２２：３８０６－３８１２ＦｕｋｕｓｈｉｍａＮ，ＳａｔｏＮ，ＵｅｋｉＴ，ＲｏｓｔｙＣ，ＷａｌｔｅｒＫＭ，ＷｉｌｅｎｔｚＲＥ，Ｙｅｏｑ，ＨｒｕｂａｎＲＨ，ＧｏｇｇｉｎｓＭ．Ａｂｅｒｒａｎｔｐ１６ｐｒｏｍｏｔｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＣｆｉｎＯｎｃｏｌ２００３：２１：１４７２－１４７９７ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｅｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｎｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａｄｕｃｔａｌＷａｎｇＣＷＩｂｉｓｕｌｆｉｔｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ５－ｍｅｔｈｙｌｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅａｎｄｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９８０；８：ＲＹ，ＧｅｈｒｋｅＥｈｒｌｉｃｈＭ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎａｎｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｍ，Ｐ口ｔｈｏｆ２００２；１６０：１５７３．１５８１编辑李军亮电编郭海丽ＩＳＳＮ１００９．３０７９ＣＮ１４．１２６０瓜２００８年版权归世界华人消化杂志・消息・世界华人消化杂志作者署名要求本刊讯本刊论文署名作者不宜过多，一般不超过８人，主要应限于参加研究工作并能解答文章有关问题、能对文稿内容负责者，对研究工作有贡献的其他人可放入致谢中．作者署名的次序按贡献大小排列，多作者时姓名间用逗号，如是单名，则在姓与名之间空１格（正文和参考文献中不空格）．《世界华人消化杂志》要求所有署名人写清楚自己对文章的贡献．第一方面是直接参与，包括：（１）酝酿和设计实验；（２）采集数据；（３）分析／解释数据．第二方面是文章撰写，包括：（１）起草文章；（２）对文章的知识性内容作批评性审阅．第三方面是工作支持，包括：（１）统计分析；（２）获取研究经费；（３）行政、技术或材料支持；（４）指导；（５）支持性贡献．每个人必须在第一至第三方面至少具备一条，才能成为文章的署名作者．《世界华人消化杂志》不设置共同第一作者和共同通信作者．（常务副总编辑：张海宁２００８－０４－１８）万方数据
