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铁皮石斛花色苷抑菌活性研究
作者：杨晓娜 谢雯颖
来源：《大东方》2018年第10期
摘 要：用溶剂法提取铁皮石斛花色苷并研究其抑菌作用。抑菌实验表明：铁皮石斛花色苷对枯草芽孢杆菌抑制作用较强，金黄色葡萄球菌次之，对大肠杆菌的抑制作用最弱，最低抑菌浓度实验表明铁皮石斛花色苷对三种常见细菌的最低抑菌浓度分别为1.138 mg/L、0.284mg/L、0.569mg/L，并且随着花色苷溶液浓度的增加，抑菌效果越明显。而对黑曲霉和白色念珠菌没有抑制作用。
关键词：铁皮石斛；花色苷；抑菌
铁皮石斛（Dendrobium officinale）属兰科石斛属植物，俗称铁皮枫斗，被国家列为重点保护的濒临危药用植物[1]。近几年，对铁皮石斛的研究除了进行组织培养外，更多的是集中在化学物质的测定[2]、种类鉴定[3]、共生真菌[4]及药理作用[5]的临床试验等方面。本试验主要以龙陵铁皮石斛紫茎为试材，着眼于紫茎的花色苷提取、鉴定和对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉等的抑菌效果。 1 材料
1.1 材料、试剂与仪器
选用新鲜、无病虫害、无霉烂的铁皮石斛茎作试材，采购自龙陵县铁皮石斛人工种植基地，除叶后于-20℃ 冰箱保存备用
试剂：甲醇、盐酸、无水乙醇、蛋白胨、酵母膏、氯化钠、琼脂、氢氧化钠、盐酸均为均为国产分析纯。
供试菌种：大肠杆菌Escherichia coli标准菌株ATCC25922；金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus标准菌株ATCC259226538；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis标准菌株ATCC6633，白色念珠菌 Monilia albican ATCC10231，黑曲霉 Aspergillus niger ATCC104均购自广东微生物菌种保藏中心。
主要仪器与设备：CP系列电子天平、冰箱、UV5000紫外可见分光光度计、电热恒温水槽、SHB-ⅢA循环水式多用真空泵等。 1.2 试验方法
1.2.1溶剂法提取铁皮石斛花色苷
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将铁皮石斛从-20℃冰箱取出，取叶鞘和有色素石斛茎表皮剪成长3-5 mm，与刚配制的1%盐酸甲醇溶液按料液比为1：20的比例混合，放在40℃电热恒温水槽溶解两个半小时后过滤，滤渣中再倒入同比例的1%盐酸甲醇溶液混合，按同样的方法再溶解一次，过滤后与第一次的滤液充分混匀，将混匀的滤液倒入棕色瓶于4℃下保存以待备用。
用pH示差法测定[8]，取浓缩后的铁皮石斛花色苷溶液5mL，分别用pH1.0的氯化钾缓冲液和pH4.5的乙酸钠缓冲液定容至25 mL，室温下平衡90 min。
按照下式计算吸光度值：A=（A530-A700）pH1.0-（A530-A700）pH4.5； 原样液中花色苷浓度为：C（mg/L）=（A×MW×DF×1000）/（ε×1）
式中：MW—样品中主要花色苷的分子量，MW=449.2；DF—稀释因子，此处为5；ε—样品中主要花色苷的摩尔吸收率，ε=26，900。 1.2.2 花色苷抑菌试验相关试材及溶剂的制备 （1）溶液及培养基的配置
称取0.9 g氯化钠于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水溶解，121℃，湿热灭菌30 min。 100 mL LB液体培养基配置，1000 mL LB固体培养基配置，取20套已灭菌的培养皿，在超净工作台上用已灭菌的培养基到入培养皿中，冷却，备用。 （2）菌种的活化及菌悬液的制备
将购买的五种供试菌在37℃/24 h条件下，活化两次后制备菌悬液，于37℃ 150 r/min 恒温振荡培养24 h。用比浊法[10]测定菌悬液的光密度值来推测其浓度。 （3）不同浓度花色苷溶液的制备
二次稀释法[34]分别配制不同浓度的花色苷溶液。设11个浓度梯度。对照组用无菌水处理。用已灭菌的直径为5 mm的圆形滤纸片放入不同浓度的花色苷溶液和无菌水中，每瓶溶液中放四片，浸泡30 min，备用。 1.2.3花色苷抑菌活性试验
取0.1 mL菌悬液至已经冷却的固体培养基中，用无菌涂布器均匀涂布。待晾干后用无菌镊子夹取浸泡过的含有不同浓度的滤纸片，等距离放置于培养基中。37℃/24 h下培养，用直尺量取各抑菌圈的直径（mm），重复3次。并记录数据。
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2 结果与分析
2.1 比较铁皮石斛不同浓度花色苷抑制三种细菌的抑菌圈大小
由表1可知铁皮石斛花色苷对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金红色葡萄球菌的抑制效果，花色苷对枯草芽孢杆菌的抑制作用较为明显，抑菌作用大小为枯草芽孢杆菌>金红色葡萄球菌>大肠杆菌。 3 结论
用溶剂法提取铁皮石斛花色苷，pH示差法测得花色苷浓度为145.698mg/L。将花色苷溶液二倍稀释，作为抑菌溶液，来观察不同浓度的花色苷对三种常见细菌的抑制作用。抑制作用大小为枯草芽孢杆菌>金红色葡萄球菌>大肠杆菌。对大肠杆菌的最低抑制浓度为0.569mg/L，铁皮石斛花色苷溶液对枯草芽孢杆菌的最低抑制浓度为1.138 mg/L，对金红色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.284mg/L。对两种真菌：白色念珠菌和黑曲霉均无抑制作用。 基金项目：保山学院科研项目（2015BZ006） 参考文献
[1]吕圭源，颜美秋，陈素红.铁皮石斛功效相关药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（4）：4-493.
[2]诸燕，张爱莲，何伯伟，等.铁皮石斛总生物碱含量变异规律[J].中国中药杂志，2010，35（18）：2388-2391.
[3]刘文杰，孙志蓉，杜远，等.不同产地铁皮石斛主要化学成分及指纹图谱研究[J].北京中医药大学学报，2013，36（2）：117-120.
[4]严亮，杨瑞娟，王桥美.云南铁皮石斛内生菌的分离与鉴定[J].云南农业大学学报：自然科学版，2015（5）：760-765.
[5]覃辉艳，梁慧莉，姚思宇，等.铁皮石斛颗粒增强免疫力作用的实验研究[J].应用预防医学，2016（1）：81-83. 作者简介：
杨晓娜（1984—），女（回），临沧凤庆，硕士，讲师，研究方向：天然产物开发 （作者单位：保山学院，资源环境学院）
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