实验五母种、原种接种扩大培养（板书用）一、实验目的熟悉母种、原种接种操作技能。二、实验材料和用具接种箱或超净工作台，恒温培养箱，接种钩（针），酒精灯，镊子、、火柴，记号笔，记录本，75％酒精及棉球、95％酒精，母种试管斜面，灭菌好的原种培养基。三、实验步骤与方法1.无菌测定灭菌后的培养基，随机抽出数支斜面试管培养基，置25—28℃的温箱中培养3天，培养基表面仍光滑，无杂菌出现，证明灭菌彻底，即可供接种使用。2.接种操作过程无菌操作要点：①无菌箱在启用前先灭菌，将待接种的斜面试管、酒精灯、火柴、接种针等放入箱内，紫外线照射半小时以上。超净工作台则要先灭菌20分钟。②双手洗净。打开工作灯，将双手伸入接种箱内，点燃酒精灯。用75%酒精的棉球擦拭双手，擦拭方向由前向后。③左手平托两支试管，拇指按住试管底部，外侧一支是供接种用的菌种试管，内侧一支是待转接母种的斜面试管，两支试管的斜面都应朝上。右手持接种钩，将接种钩的顶端烧红，并将整条接种柄在火焰上过几次灭菌。④将两支试管的管口部分靠近火焰，用右手同时夹住两个棉塞。拔掉两支试管的棉塞，并立即以火焰灼烧管口，并适当转动。操作过程在不离酒精灯火焰一寸远处进行。⑤用冷却的接种钩，在长满菌丝的斜面挖取少许菌丝及培养基，然后轻轻抽出试管。迅速伸进待接试管中，将种块置于培养基的中部，盖好塞子。接种过程中，应注意保持试管与桌面平行，不要远离酒精的火焰，周而复始。一支母种可扩接20—25支试管。贴上标签（或用记号笔），注明菌种或菌株名称及日期。⑥原种接种：3．菌种培养接好种的试管和原种，放在25℃条件下培养，每隔2-3天检查一次。遇有杂菌的试管要及时选出，以免污染其他试管。7～10天后菌丝就可长满试管。原种30天左右长满。作业：归纳原种和试管种的接种全过程。实验五母种接种扩大培养一、实验目的通过对接种箱常规消毒、斜面试管培养基母种(即一级种)接种和培养，基本熟悉母种接种操作技能。二、实验材料和用具接种箱或超净工作台，电热恒温培养箱，接种钩，接种针，酒精灯，搪瓷杯，高锰酸钾，，母种试管(18×180mm)，火柴，记号笔，钢笔，标签，工作记录本，250毫升磨口瓶，75％酒精及棉球、95％酒精，升汞。斜面培养基，斜面母种。四、实验步骤与方法1．无菌测定灭菌后的培养基，随机抽出数支斜面试管培养基，置25—28℃的温箱中培养3天，培养基表面仍光滑，无杂菌出现，证明灭菌彻底，即可供接种使用。2．接种操作过程无菌操作要点：①无菌箱在启用前先灭菌，将待接种的斜面试管、酒精灯、火柴、接种针等放入箱内，紫外线照射半小时以上。超净工作台则要先起动20分钟(或按说明书操作)。②双手洗净。打开工作灯，将双手伸入接种箱内，点燃酒精灯。用75%酒精的棉球擦拭双手，擦拭方向由前向后。③左手平托两支试管，拇指按住试管底部，外侧一支是供接种用的菌种试管，内侧一支是待转接母种的斜面试管，两支试管的斜面都应朝上。右手持接种钩，将接种钩的顶端烧红，并将整条接种柄在火焰上过几次灭菌。④将两支试管的管口部分靠近火焰，用右手同时夹住两个棉塞。拔掉两支试管的棉塞，并立即以火焰灼烧管口，并适当转动。经瞬时灼烧后大部分杂菌可被杀死，即使有少数未死者，也被加热固定，不致脱落。操作过程在不离酒精灯火焰一寸远处进行。⑤用冷却的接种钩，将已长满菌丝培养基划成1平方厘米的方块，钩住接种块，或用接种环轻轻接触菌苔，挖取少许菌丝及培养基，然后轻轻抽出试管。注意不要使菌苔碰到管壁，取出时，不可使环通过火焰。悬空，迅速伸进待接试管中，将种块置于培养基的中部，在斜面中部触一下，使菌块落在培养基上，注意环要平放，不要划破培养基，也不要使菌苔沾到管壁上。⑥抽出接种环，将两支试管口同时在火焰上灼烧灭菌，烧灼棉塞，分别塞好棉塞。注意不要用试管口去迎棉塞，以免试管在运动时纳入空气造成污染。接种过程中，应注意保持试管与桌面平行，不要远离酒精的火焰，周而复始。一支母种可扩接20—25支试管。接种完毕之后，必须马上贴上标签（或用记号笔），注明菌种或菌株名称及日期，以防混淆。母种标签大小为3．5×2cm，原种为4×3cm。均应贴在正面偏上位置，不要影响对菌种的观察。3．菌种培养接好种的试管，放在26--27℃条件下培养，每隔2天检查一次。遇有杂菌的试管要及时选出，以免污染其他试管。7～10天后菌丝就可长满试管。菌丝长满试管后要及时取出，放在常温下3～5天，就可作为接种试管母种或制作原种之用。不立即使用的试管母种，放在4℃左右的条件下存放，每隔半年转管一次，可长期保存。实验五•
原种接种与扩大培养一、实验目的通过对接种常规消毒、原种（二级种）接种和扩大培养，基本掌握原种接种操作技能。并•
培养学生定期检查菌丝生长情况的观察能力和鉴别杂菌污染的形征识别能力。•二、实验材料和用具•接种箱，接种钩，酒精灯，镊子，75％酒精棉球，高锰酸钾，火柴，标签，搪瓷杯，钢笔，塑料绳或皮筋，试管母种。•
三、实验步骤与方法．•1．接种操作过程•(1)无菌检查：接种以前首先检查菌种内或棉塞上有无霉孢子菌落及杂菌侵入所形成的拮抗线、湿斑。有明显杂菌侵染或可疑的菌种，培养基开始干缩或在瓶壁上有大量黄褐色分泌物的菌种，培养基内菌丝生长稀疏或大多是细线状菌索的菌种，没有菌种标签的可疑菌种，均不能用于接种。•(2)原种接种法：接种要求在无菌室内进行无菌操作。接种时要求动作快而准确，以减少污染。取斜面母种，用75％的酒精棉球擦拭外壁，拔去棉塞，在酒精灯火焰上灼烧管口。用右手持接种锄(扒)，灼烧，放在试管内侧冷却，然后切取2．5平方厘米大小斜面菌种一块，通过酒精的火焰上方，送入菌种瓶内，固定在接种孔上。注意试管口与瓶口都不离火焰一寸远。菌种块用培养料盖一下更好。每支斜面试管母种可接种3—5瓶原种。•接种后，用酒精灯火焰烧灼瓶口、棉塞，然后将棉塞塞到瓶口上。通过瓶壁观察，种块是否移动，若菌种块在接种穴内脱落或掉到接种穴内，应予调整或补接。最后盖上聚丙烯或牛皮纸，结上塑料绳，即完成了接种过程。立即盖好原种瓶，封好口。•2．原种恒温培养接种后的原种瓶，全部移放在23—25℃的培养室或恒温箱内培养。培养期间应经常检查有•
无杂菌污染，如发现黄、绿、桔红、黑色杂菌时，要及时捡出清理。尤其是塑料袋菌种，检查工作应自始至终进行。培养室切忌阳光直射，但也不要完全黑暗，要有一定的散射光。经过25～30天，待菌丝长满瓶底就可取作种子用。生长好的原种菌丝洁白、粗壮、纯净，即可用来繁殖扩大栽培种。•
•五、作业思考题•1．在接种过程中，如发现棉塞已湿，立即更换灭过菌的棉塞，为什么?•2．何谓倒置培养?倒置培养的优点是什么?请具体说明。•3．一般来说，原种满瓶经过多少天最适用于扩大培养栽培种?栽培种满瓶后多少天最适用于播种?••
4．你怎样鉴别菌种质量的优劣?5．你用什么办法保藏原种?在10℃以下低温下，原种保藏时间一般是多少?在室温下保藏原种时间一般是多少?实验五•母种接种扩大培养一、实验目的•通过对接种箱常规消毒、斜面试管培养基母种(即一级种)接种和培养，基本熟悉母种接种操作技能。•二、实验材料和用具•接种箱或超净工作台，电热恒温培养箱，接种钩，接种针，酒精灯，搪瓷杯，高锰酸钾，，母种试管(18×180mm)，火柴，记号笔，钢笔，标签，工作记录本，250毫升磨口瓶，75％酒精及棉球、95％酒精，升汞。•斜面培养基，斜面母种。••三、实验步骤与方法•1．无菌测定•灭菌后的培养基，随机抽出数支斜面试管培养基，置25—28℃的温箱中培养3天，培养基表面仍光滑，无杂菌出现，证明灭菌彻底，即可供接种使用。•2．接种操作过程•无菌操作要点：•①无菌箱在启用前先灭菌，将待接种的斜面试管、酒精灯、火柴、接种针等放入箱内，紫外线照射半小时以上。超净工作台则要先起动20分钟(或按说明书操作)。•②双手洗净。打开工作灯，将双手伸入接种箱内，点燃酒精灯。用75%酒精的棉球擦拭双手，擦拭方向由前向后。•③左手平托两支试管，拇指按住试管底部，外侧一支是供接种用的菌种试管，内侧一支是待转接母种的斜面试管，两支试管的斜面都应朝上。右手持接种钩，将接种钩的顶端烧红，并将整条接种柄在火焰上过几次灭菌。•④将两支试管的管口部分靠近火焰，用右手同时夹住两个棉塞。拔掉两支试管的棉塞，并立即以火焰灼烧管口，并适当转动。经瞬时灼烧后大部分杂菌可被杀死，即使有少数未死者，也被加热固定，不致脱落。操作过程在不离酒精灯火焰一寸远处进行。•⑤用冷却的接种钩，将已长满菌丝培养基划成1平方厘米的方块，钩住接种块，或用接种环轻轻接触菌苔，挖取少许菌丝及培养基，然后轻轻抽出试管。注意不要使菌苔碰到管壁，取出时，不可使环通过火焰。悬空，迅速伸进待接试管中，将种块置于培养基的中部，在斜面中部触一下，使菌块落在培养基上，注意环要平放，不要划破培养基，也不要使菌苔沾到管壁上。•⑥抽出接种环，将两支试管口同时在火焰上灼烧灭菌，烧灼棉塞，分别塞好棉塞。注意不要用试管口去迎棉塞，以免试管在运动时纳入空气造成污染。•接种过程中，应注意保持试管与桌面平行，不要远离酒精的火焰，周而复始。一支母种可扩接20—25支试管。•接种完毕之后，必须马上贴上标签（或用记号笔），注明菌种或菌株名称及日期，以防混淆。母种标签大小为3．5×2cm，原种为4×3cm。均应贴在正面偏上位置，不要影响对菌种的观察。•3．菌种培养•接好种的试管，放在26--27℃条件下培养，每隔2天检查一次。遇有杂菌的试管要及时选出，以免污染其他试管。7～10天后菌丝就可长满试管。菌丝长满试管后要及时取出，放在常温下3～5天，就可作为接种试管母种或制作原种之用。不立即使用的试管母种，放在4℃左右的条件下存放，每隔两个月就转管一次，可长期保存。•四、母种菌丝外观优劣鉴别•1．母种杂菌检查：保藏的母种在接种前应进行认真地检查是否有污染现象，斜面上有明显绿、•
黄、黑色等菌落，说明遭受霉菌污染；管口内的棉塞，由于吸潮生霉，只要轻微的振动，分生孢子很容易溅落到已经长好的斜面上，在低温保藏条件下受到抑制，很难发现。将斜面放在向光处，从基背面观察，在气生菌丝下面有黄褐色圆形或不定型斑块，是混有细菌的表现。已污染杂菌的母种不能用于扩大培养。•2．常见母种菌丝的生长形态和培养特征•①香菇母种：菌丝洁白、细短、絮状、浓密均匀，整齐地生长，部分菌丝沿试管壁伸延，不产生色素。一般12—14天可长满试管斜面。•②木耳母种：菌丝白色，粗壮均匀，整齐致密，齐头生长，其中黑木耳可分泌褐色素，毛木耳可分泌紫褐色素。一般10天可长满试管斜面。•③平菇母种：菌丝洁白、浓密、粗壮、丰满，长势均一，爬试管壁力很强，不产生色素。菌丝纤细，绒毛状卷缩的为退化种。一般6—8天可长满试管斜面。•④金针菇母种：菌丝白至灰白色，初期较蓬松，后期气生菌丝紧贴培养基，爬壁慢，能产色素，使培养基变淡黄色。菌丝在适温下约10天长满斜面。•⑤竹荪母种：菌丝初期白色，细长而浓密，后期可形成索状菌丝和变成粉红色或淡紫色。•
五、作业思考题•1．怎样检查母种菌丝是否有污染现象?•2．经过你亲自进行的母种接种扩大培养试管斜面，需多少天可长满试管斜面?•3．怎样制作试管棉塞?•4．母种投入生产之前，应该注意些什么?•
